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    金果欖組織培養(yǎng)與快速繁殖技術(shù)研究

    2016-01-18 05:48:18李小泉薛艷霞韋紹龍
    種子 2016年3期
    關(guān)鍵詞:外植體調(diào)節(jié)劑生根

    李小泉,薛艷霞,韋紹龍

    (1.廣西壯族自治區(qū)農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所, 南寧530007; 2.廣西大學(xué)農(nóng)學(xué)院, 南寧530005)

    金果欖(Tinospora capilliPes Gagnep.)別名地苦膽、山慈菇、九龍膽等,為防己科植物,分布于廣西、湖南等地。其干燥塊根為我國(guó)傳統(tǒng)中草藥,具有清熱解毒、利咽、止痛之功效,常用于治療咽喉腫痛、癰疽疔毒、泄瀉、痢疾、脘腹熱痛等癥[1]。隨著對(duì)金果欖研究的不斷深入,發(fā)現(xiàn)金果欖還具有抗幽門(mén)螺桿菌[2]、抑菌[3]、降血糖[4]、抗腫瘤[5]、抗輻射[6]以及改善心腦血管疾?。?]作用,可用于治療胃潰瘍、糖尿病、癌癥和老年癡呆[8]等病癥。近年來(lái),由于過(guò)度采挖,金果欖野生自然資源急劇減少,處于瀕危狀態(tài)。人工栽培是緩解金果欖的供需矛盾、拯救金果欖野生自然資源的有效措施,而種苗則是人工栽培所面臨的首要問(wèn)題。目前對(duì)金果欖的研究主要集中于化學(xué)成分、藥理以及資源調(diào)查等方面,種苗繁育方面鮮有報(bào)道。植物組織培養(yǎng)不僅具有繁殖系數(shù)高、育苗速度快等優(yōu)點(diǎn),還能保持原植株的優(yōu)良性狀等特點(diǎn)。因此,開(kāi)展金果欖組織培養(yǎng)與快速繁殖技術(shù)研究,可為金果欖人工栽培提供大量?jī)?yōu)質(zhì)種苗。

    1 材料與方法

    1.1 材 料

    金果欖莖節(jié)為外植體,莖節(jié)分為嫩莖節(jié)和老莖節(jié),沒(méi)有木質(zhì)化的為嫩莖節(jié),有木質(zhì)化的為稍老莖節(jié);材料來(lái)源于廣西靖西縣,引種到廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所中草藥園圃。

    1.2 方 法

    1.2.1 材料預(yù)處理

    在天氣晴朗的09:00~10:00時(shí),剪取金果欖莖節(jié),去掉葉片,留下0.5cm葉柄,將莖節(jié)剪成木質(zhì)化帶節(jié)間的莖段、幼嫩的帶節(jié)間莖段和頂芽約2cm長(zhǎng)的3種外植體,用洗衣粉水浸泡20min,自來(lái)水清洗10min,高錳酸鉀溶液浸泡8min,用濾紙吸干表面水分,備用。

    1.2.2 外植體滅菌

    在超凈工作臺(tái)上,外植體在75%乙醇浸泡20~30 s,無(wú)菌水清洗1次,然后用0.1%升汞(HgCl2)滅菌6~15min,無(wú)菌水清洗5次,放在無(wú)菌濾紙上吸去多余水分,備用。

    1.2.3 培養(yǎng)條件

    基本培養(yǎng)基:初代培養(yǎng)、增殖培養(yǎng)為 MS,生根培養(yǎng)為1/2MS,每升培養(yǎng)基中加入5g瓊脂、20g白糖,pH 值為5.8,在121℃、0.11kPa滅菌25min,冷卻后接入外植體。

    在光照強(qiáng)度1 500~2 000μmol/(m2·s)、光照時(shí)間12h/d、溫度25℃左右的培養(yǎng)室中培養(yǎng)。

    1.2.4 初代誘導(dǎo)培養(yǎng)

    將滅菌好的金果欖莖節(jié)切去兩端的舊傷口,接種于初代誘導(dǎo)培養(yǎng)基上。培養(yǎng)基附加的激素以6-BA濃度為0.5,1.0,2.0,3.0mg/L分別與 NAA 0.2mg/L 組合的4個(gè)處理,每個(gè)處理接種40個(gè)外植體,培養(yǎng)30d,統(tǒng)計(jì)各處理的芽誘導(dǎo)率。

    1.2.5 繼代增殖培養(yǎng)

    在金果欖初代誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn),細(xì)胞分裂素6-BA與NAA使用時(shí),金果欖節(jié)間單芽誘導(dǎo)率高,叢生芽少,擬在培養(yǎng)基中添加TDZ(噻二唑苯基脲),以期摸索到增殖系數(shù)較高的植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑適宜添加量的培養(yǎng)基。將初代誘導(dǎo)得到的芽接入增殖培養(yǎng)基培養(yǎng)。增殖培養(yǎng)基中植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑組合為:

    1)TDZ 0.5mg/L+NAA 0.2mg/L;

    2)TDZ 1.0mg/L+NAA 0.2mg/L;

    3)TDZ 2.0mg/L+NAA 0.2mg/L;

    4)TDZ 0.5mg/L+6-BA 0.5mg/L+NAA 0.2 mg/L;

    5)TDZ 0.5mg/L+6-BA 1.0mg/L+NAA 0.2 mg/L;

    6)TDZ 1.0mg/L+6-BA 0.5mg/L+NAA0.2 mg/L;

    7)TDZ 1.0mg/L+6-BA 1.0mg/L+NAA 0.2 mg/L。

    各處理接入20個(gè)芽,每7天觀察1次,并做好記錄,40d時(shí)統(tǒng)計(jì)各處理芽數(shù),并計(jì)算出各處理增殖系數(shù),結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,篩選出最佳增殖系數(shù)培養(yǎng)基。

    1.2.6 生根培養(yǎng)

    經(jīng)過(guò)多次生根培養(yǎng)基的篩選實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),金果欖的芽生根比較困難。因此,本研究采用液態(tài)植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑處理和固態(tài)培養(yǎng)基結(jié)合的方法,誘導(dǎo)金果欖芽的生根。將生長(zhǎng)至3~5cm高的增殖芽切成單芽,基部放入滅過(guò)菌的植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑溶液中處理10,20 min,接種于1/2MS培養(yǎng)基中培養(yǎng)。植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑溶液為IBA 50mg/L+6-BA 10mg/L、IBA 100mg/L+6-BA 10mg/L、NAA 50mg/L+6-BA 10mg/L、NAA 100mg/L+6-BA 10mg/L 4個(gè)處理,每處理接入15個(gè)芽,每7d觀察1次,50d時(shí)統(tǒng)計(jì)各處理生根情況,計(jì)算出各處理的根誘導(dǎo)率和根數(shù),對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,篩選出較好的植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的處理濃度和時(shí)間。

    1.2.7 數(shù)值計(jì)算

    芽誘導(dǎo)率(%)=誘導(dǎo)出芽的外植體數(shù)/外植體總數(shù)×100%。

    增殖系數(shù)=總芽數(shù)/接入芽數(shù)。根誘導(dǎo)率(%)=誘導(dǎo)出根的芽數(shù)/接入總芽數(shù)×100%。

    1.2.8 數(shù)據(jù)分析

    每個(gè)處理3次重復(fù),應(yīng)用SPSS 17.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 最佳外植體篩選和滅菌時(shí)間的確定

    將金果欖莖節(jié)分為芽、嫩莖節(jié)、稍有木質(zhì)化的老莖節(jié)3種外植體,3種外植體分別在0.1%升汞中滅菌6,8,10,12min,滅菌后接種于 MS培養(yǎng)基中,20d時(shí)統(tǒng)計(jì)外植體的污染率、死亡率、出芽率等指標(biāo),從而獲得不同外植體的最佳滅菌時(shí)間。通過(guò)對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析,金果欖芽和嫩枝的最佳滅菌時(shí)間為8min,芽的污染率為8.7%、死亡率為12.1%、出芽率為50.3%,嫩枝的污染率為5.7%、死亡率為4.3%、出芽率為72.0%;老莖節(jié)的最佳滅菌時(shí)間為10min,污染率為25.3%、死亡率為0%、出芽率為96.2%。由此可見(jiàn),老枝的出芽率最高,且芽比較壯,但污染率也比較高,而且在隨后的培養(yǎng)中,老枝上的芽不斷有細(xì)菌污染出現(xiàn)。為了充分利用好老莖節(jié)資源,對(duì)老莖節(jié)的滅菌方案再做調(diào)整,在超凈臺(tái)上,用75%乙醇滅菌30s后,用15%次氯酸鈉滅菌20min,無(wú)菌水清洗3次,再用0.1%升汞滅菌10min,無(wú)菌水清洗5次,接入MS培養(yǎng)基中,污染率降為6.7%、死亡率為3.3%、出芽率為93.5%,得到的芽在隨后的培養(yǎng)中成活率高,且污染率大大降低。因此,金果欖老莖節(jié)選為最佳的外植體,滅菌處理為15%次氯酸鈉滅菌20min,無(wú)菌水清洗1次,再用0.1%升汞滅菌10min,無(wú)菌水清洗5次。

    2.2 6-BA與NAA對(duì)金果欖外植體誘導(dǎo)的影響

    金果欖帶節(jié)間的莖段在附加不同濃度6-BA與NAA 0.2mg/L組合培養(yǎng)基上培養(yǎng)10d,金果欖莖段的節(jié)間膨大成芽點(diǎn),15d開(kāi)始萌發(fā)出芽,培養(yǎng)30d時(shí),芽長(zhǎng)為1~3cm,各處理的誘導(dǎo)率和芽長(zhǎng)勢(shì)見(jiàn)表1。

    從表1可看出,6-BA 濃度在0~2.0mg/L范圍內(nèi),金果欖帶節(jié)間的莖段誘導(dǎo)率隨著6-BA濃度增加而提高,誘導(dǎo)率高達(dá)90.8%;當(dāng)6-BA濃度增加到3.0 mg/L時(shí),誘導(dǎo)率下降為72.5%,說(shuō)明6-BA濃度太高不利于金果欖腋芽萌發(fā)。經(jīng)過(guò)統(tǒng)計(jì)分析,各培養(yǎng)基間的誘導(dǎo)率差異顯著,誘導(dǎo)率最高的為3號(hào)培養(yǎng)基,芽的長(zhǎng)勢(shì)好。因此,金果欖初代誘導(dǎo)較好的培養(yǎng)基為MS+6-BA 2.0mg/L+NAA 0.2mg/L。

    表1 不同培養(yǎng)基對(duì)金果欖初代芽誘導(dǎo)的影響

    2.3 不同濃度植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑組合對(duì)金果欖芽增殖的影響

    初代誘導(dǎo)得到的芽接種于增殖培養(yǎng)基中培養(yǎng),7d節(jié)間誘導(dǎo)出芽點(diǎn),15d左右在芽點(diǎn)處陸續(xù)長(zhǎng)出新芽,40d時(shí)記錄芽數(shù),并計(jì)算出增殖系數(shù)(見(jiàn)表2)。

    由表2可看出,TDZ與6-BA組合使用對(duì)金果欖的叢生芽誘導(dǎo)和芽的長(zhǎng)勢(shì)均有促進(jìn)作用,雖然(7)號(hào)培養(yǎng)基的增殖系數(shù)稍高于(6)號(hào),但經(jīng)過(guò)統(tǒng)計(jì)分析,2種培養(yǎng)基的增殖系數(shù)差異不顯著。因此,金果欖增殖培養(yǎng)較好的培養(yǎng)基為(6)MS+TDZ 1.0mg/L+6-BA 0.5mg/L+NAA 0.2mg/L。

    表2 不同培養(yǎng)基對(duì)金果欖增殖培養(yǎng)的影響

    表3 植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑溶液對(duì)金果欖生根的影響

    2.4 IBA、NAA 對(duì)金果欖芽生根的影響

    金果欖芽基部在滅過(guò)菌的植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑中處理相應(yīng)時(shí)間后,接種于1/2MS培養(yǎng)基中培養(yǎng),10d左右芽的基部膨大,形成愈傷組織,20d左右從愈傷組織處長(zhǎng)出根,50d統(tǒng)計(jì)根誘導(dǎo)率和每個(gè)芽誘導(dǎo)出的根條數(shù)(見(jiàn)表3)。

    由表3可以看出,高濃度生長(zhǎng)素處理金果欖芽的基部可以有效誘導(dǎo)出根。相同濃度下,IBA的根誘導(dǎo)率和誘導(dǎo)出的根條數(shù)均比NAA的要高,而且NAA處理過(guò)的芽的基部愈傷組織特別多,但能長(zhǎng)根的不多。在對(duì)相關(guān)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析發(fā)現(xiàn),IBA 100mg/L+6-BA 10mg/L處理的根誘導(dǎo)率和每株苗的根條數(shù)均與其它處理差異大顯著水平。因此,植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑溶液為IBA 100mg/L+6-BA 10mg/L處理10min時(shí)生根效果最好。根誘導(dǎo)率達(dá)80%,每株苗根條數(shù)為3.7條。

    3 結(jié) 論

    在金果欖最佳外植體篩選過(guò)程中,老莖節(jié)上誘導(dǎo)出來(lái)的芽壯,這可能與老莖節(jié)上積累的營(yíng)養(yǎng)比較豐富以及腋芽的芽原基發(fā)育比較好有關(guān)。

    在金果欖組織培養(yǎng)過(guò)程中,存在生根難的問(wèn)題。而在扦插繁殖過(guò)程中,同樣存在插條生根影響成活率的問(wèn)題。為了使插穗盡早生根,通常會(huì)采用一些方法進(jìn)行催根。植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑可通過(guò)調(diào)節(jié)扦插苗的生理機(jī)能從植物內(nèi)部起作用[9],適合的生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑對(duì)生根具有顯著促進(jìn)作用,常用的生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑為NAA和IBA[10-11]。因此,本研究應(yīng)用生長(zhǎng)素 NAA、IBA 分別與6-BA組合使用,開(kāi)展金果欖芽激素處理和固態(tài)培養(yǎng)基上生根的研究。結(jié)果表明,利用高濃度的生長(zhǎng)素溶液處理一定的時(shí)間對(duì)金果欖芽的生根具有促進(jìn)作用,其中IBA 100mg/L與6-BA 10mg/L組合處理10 min時(shí)生根效果最好。由于在植物組織培養(yǎng)過(guò)程中,整個(gè)培養(yǎng)過(guò)程為無(wú)菌狀態(tài),從而避免了插穗因傷口感染微生物而腐爛等問(wèn)題,由于在固態(tài)培養(yǎng)基中碳源豐富,從而提高了芽的生根率和生根數(shù)。該操作簡(jiǎn)單易行,為生根難的植物建立組培快繁技術(shù)體系提供了技術(shù)參考。

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