發(fā)狀念珠藻胞外多糖對(duì)小鼠免疫活性的影響

發(fā)狀念珠藻胞外多糖對(duì)小鼠免疫活性的影響

郭金英，杜潔，李彤輝，任國(guó)艷，張玉先

(河南科技大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院，河南 洛陽 471023)

摘要：采用BG-11培養(yǎng)液，懸浮培養(yǎng)發(fā)狀念珠藻，提取發(fā)狀念珠藻胞外多糖。分別以發(fā)狀念珠藻胞外多糖25 mg/kg、50 mg/kg、100 mg/kg這 3個(gè)劑量灌胃小鼠，連續(xù)兩周后，皮下注射氫化可的松一周，處死小鼠。測(cè)定小鼠臟器指數(shù)、碳粒廓清指數(shù)、遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)和脾臟抗體生成細(xì)胞數(shù)，分析發(fā)狀念珠藻胞外多糖的體內(nèi)免疫活性。研究結(jié)果表明：與模型對(duì)照組相比，多糖組小鼠的臟器指數(shù)、廓清指數(shù)、吞噬指數(shù)及足跖增厚值都顯著增大，脾臟B細(xì)胞分泌抗體能力顯著增強(qiáng)。發(fā)狀念珠藻胞外多糖具有增強(qiáng)小鼠免疫功能的作用。

關(guān)鍵詞：發(fā)狀念珠藻；胞外多糖；免疫活性

基金項(xiàng)目：河南省科技攻關(guān)計(jì)劃基金項(xiàng)目(142102110038)

作者簡(jiǎn)介：郭金英(1971-),男,河南南陽人,副教授,博士，碩士生導(dǎo)師,主要從事食物新資源方面的研究.

收稿日期：2014-03-03

文章編號(hào)：1672-6871(2015)01-0072-04

中圖分類號(hào)：TS201.4

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

0引言

發(fā)狀念珠藻(Nostocflageliforme)主要分布于中國(guó)西北部干旱和半干旱的荒漠地區(qū)，是一種常見陸生藍(lán)藻[1]。其營(yíng)養(yǎng)豐富，富含蛋白質(zhì)、多糖和氨基酸等，具有較高的經(jīng)濟(jì)和藥用價(jià)值[2]。發(fā)狀念珠藻多糖是一種酸性雜多糖，由木糖、甘露糖、半乳糖、葡萄糖以及葡萄糖醛酸組成，為藻體正常的分泌物質(zhì)，是一種極具開發(fā)潛力的天然藥物資源[3]，具有重要的生物功能，它可使離體培養(yǎng)的腫瘤細(xì)胞死亡[2]，還具有抗病毒[4]、抗氧化等功能。

目前，發(fā)狀念珠藻多糖的結(jié)構(gòu)、理化性質(zhì)等方面的研究已有報(bào)道。文獻(xiàn)[5]對(duì)分離純化后的發(fā)狀念珠藻多糖作了初步的結(jié)構(gòu)分析；文獻(xiàn)[6]確定了提取發(fā)狀念珠藻多糖的最佳工藝條件并對(duì)多糖性質(zhì)進(jìn)行了研究；文獻(xiàn)[7]提取純化了發(fā)狀念珠藻胞外多糖與莢膜多糖，并研究了它們的理化特性。但是，關(guān)于發(fā)狀念珠藻多糖生物活性的研究尚處于起步階段，發(fā)狀念珠藻多糖免疫活性的研究還未見報(bào)到。因此，本文以小鼠為試驗(yàn)對(duì)象，研究發(fā)狀念珠藻多糖對(duì)免疫低下模型小鼠的體內(nèi)免疫活性的作用，為發(fā)狀念珠藻多糖的開發(fā)應(yīng)用提供依據(jù)。

1材料與方法

1.1　發(fā)狀念珠藻胞外多糖的制備

熱水提取—木瓜蛋白酶水解蛋白質(zhì)—乙醇沉淀—蒸餾水溶解—sevag試劑脫蛋白—乙醇沉淀—蒸餾水溶解—冷凍干燥。通過硫酸-苯酚法測(cè)得胞外多糖純度(質(zhì)量分?jǐn)?shù))為82.50%。

1.2　試劑

鹽酸左旋咪唑：山西太原藥業(yè)有限公司；氫化可的松：上海索萊寶生物科技有限公司；印度墨汁：青島海博生物技術(shù)有限公司；其他均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.3　試驗(yàn)動(dòng)物

健康ICR小鼠，雄性，體質(zhì)量18～22 g；健康豚鼠，雌雄不限，體質(zhì)量300～400 g，購(gòu)自河南科技大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心。

1.4　試驗(yàn)儀器

CKX41倒置顯微鏡：廣州市明美光電技術(shù)有限公司；TG-16G離心機(jī):上海安亭科學(xué)儀器廠；SW-CJ-1F單人雙面超凈工作臺(tái) :蘇州凈化設(shè)備有限公司；722S可見分光光度計(jì):上海精密科學(xué)儀器有限公司。

1.5　方法

1.5.1綿羊紅細(xì)胞

無菌條件下，抽取健康綿羊靜脈血注入到滅菌的加有玻璃珠的三角瓶?jī)?nèi)，輕輕搖晃幾分鐘以去除纖維蛋白，加入2倍體積的Alsever液搖勻后置于4 ℃冰箱保存。使用時(shí)先用生理鹽水漂洗：前兩次以1 500 r/min離心5 min，后兩次以2 000 r/min離心5 min，去掉上清，即得到綿羊紅細(xì)胞(SRBC)。

1.5.2豚鼠血清補(bǔ)體

采集豚鼠心血，常溫放置25 min，離心制得血清。將豚鼠血清與SRBC按照體積比5∶1混合，置4 ℃、30 min，然后2 000 r/min離心5 min，取上清冷凍保存。用時(shí)以生理鹽水稀釋10倍。

1.5.3動(dòng)物分組及處理

將48只ICR小鼠隨機(jī)分為6組，分別為正常對(duì)照組、模型對(duì)照組、陽性對(duì)照組、多糖低劑量組(25 mg/kg)、多糖中劑量組(50 mg/kg)和多糖高劑量組(100 mg/kg)。正常對(duì)照組和模型對(duì)照組小鼠灌胃生理鹽水，陽性對(duì)照組小鼠灌胃鹽酸左旋咪唑(25 mg/kg)，劑量為每10 g體質(zhì)量0.1 mL。灌胃兩周后，除了正常對(duì)照組小鼠皮下注射生理鹽水外，其他各組小鼠均注射氫化可的松(15 mg/kg)，連續(xù)注射一周。

1.5.4免疫器官指數(shù)測(cè)定

小鼠于末次處理后，12 h內(nèi)禁食不禁水，然后脫頸椎處死，稱其質(zhì)量；剝離胸腺、脾臟、肝臟，用濾紙吸除表面水分污垢并稱質(zhì)量。計(jì)算胸腺質(zhì)量與小鼠質(zhì)量之比即胸腺指數(shù)，脾臟質(zhì)量與小鼠質(zhì)量之比即脾臟指數(shù)，肝臟質(zhì)量與小鼠質(zhì)量之比即肝臟指數(shù)。

1.5.5碳粒廓清試驗(yàn)

注射用墨汁由印度墨汁用生理鹽水稀釋4倍制成。小鼠最后一次處理后12 h，準(zhǔn)確稱取各組小鼠體質(zhì)量，尾靜脈注入注射用墨汁(0.01 mL/g)，之后用玻璃毛細(xì)管于2 min(t1)、10 min(t2)分別從小鼠內(nèi)眥靜脈叢取血并定量吸取20 μL，立即將其加入到2 mL、質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1%的Na2CO3溶液里。用分光光度計(jì)于650 nm波長(zhǎng)下測(cè)2 min和10 min時(shí)的OD值，即OD1和OD2，以Na2CO3溶液作為空白對(duì)照。處死小鼠后，取出肝臟和脾臟并稱質(zhì)量。按下列公式計(jì)算小鼠碳廓清指數(shù)K和吞噬指數(shù)α：

K=(lgOD1-lgOD2)/(t2-t1)；

1.5.6遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)

小鼠處理至第17天時(shí)，腹腔注射0.2 mL、2%(體積分?jǐn)?shù))的SRBC進(jìn)行致敏。4 d后用數(shù)顯游標(biāo)卡尺測(cè)它們的左后足跖厚度，同一部位測(cè)定3次，取其平均值。然后用20 μL、20%(體積分?jǐn)?shù))的SRBC于測(cè)定部位進(jìn)行皮下注射，1 d后再次測(cè)定并讀取左后足跖厚度，取3次平均值。計(jì)算兩次左后足跖的厚度差值。

1.5.7脾臟抗體生成細(xì)胞測(cè)定

小鼠處理至第17 d時(shí)，腹腔注射0.2 mL、5%(體積分?jǐn)?shù))的SRBC進(jìn)行致敏。最后一天處理后12 h脫頸椎處死小鼠。將無菌摘取的脾臟過200目網(wǎng)篩，用磷酸緩沖液(PBS)洗滌3次，制備脾淋巴細(xì)胞懸液，調(diào)整脾淋巴細(xì)胞濃度為1×107mL-1。每組一個(gè)離心管，分別加0.2%(體積分?jǐn)?shù))的SRBC、脾淋巴細(xì)胞懸液、稀釋10倍的豚鼠血清各0.5 mL；另一離心管以生理鹽水代替補(bǔ)體作為空白對(duì)照，放于37 ℃水浴鍋中1 h，冰浴終止反應(yīng)。然后3 000 r/min離心5 min后取出吸取上清液，測(cè)吸光度A450 nm。

1.6　統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2結(jié)果與分析

2.1　多糖對(duì)小鼠免疫器官指數(shù)的影響

人工合成的氫化可的松也是天然存在的糖皮質(zhì)激素，除具有抗炎、抗毒、抗休克作用外，還有免疫抑制作用。發(fā)狀念珠藻胞外多糖對(duì)小鼠免疫器官指數(shù)的影響見表1。由表1可以看出：與正常對(duì)照相比，模型對(duì)照組小鼠脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)均顯著下降(P<0.05)，說明成功建立了免疫低下小鼠模型。同模型對(duì)照相比，陽性對(duì)照組小鼠肝臟指數(shù)和脾臟指數(shù)均顯著提高(P<0.05)，而胸腺指數(shù)沒有明顯提高；多糖低劑量小鼠肝臟指數(shù)和胸腺指數(shù)沒有明顯差異，而脾臟指數(shù)顯著提高(P<0.05)；多糖中、高劑量組小鼠3個(gè)器官指數(shù)均顯著提高(P<0.05)，并且隨著多糖濃度的增大，小鼠器官指數(shù)逐漸增大，差異顯著(P<0.05)。

表1　多糖對(duì)小鼠肝臟、脾臟和胸腺指數(shù)的影響　mg/g

注：同列中不同的字母表示差異顯著(P<0.05)，下同。

2.2　多糖對(duì)小鼠碳粒廓清指數(shù)和吞噬指數(shù)的影響

多糖對(duì)小鼠碳粒廓清指數(shù)和吞噬指數(shù)的影響見表2。由表2可見：與正常對(duì)照組相比，模型對(duì)照組小鼠廓清指數(shù)K和吞噬指數(shù)α顯著降低(P<0.05)；與模型對(duì)照組相比，陽性對(duì)照組小鼠廓清指數(shù)和吞噬指數(shù)均顯著增大，多糖低、中、高劑量組小鼠的廓清指數(shù)和吞噬指數(shù)也顯著增大(P<0.05)；多糖低、中、高劑量之間的廓清指數(shù)差異顯著(P<0.05)，而吞噬指數(shù)差異不顯著。

表2　多糖對(duì)小鼠碳粒廓清指數(shù)和吞噬指數(shù)的影響

2.3　多糖對(duì)小鼠遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)的影響

發(fā)狀念珠藻胞外多糖對(duì)小鼠遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)的影響見表3。由表3可以看出：與正常對(duì)照組相比，模型對(duì)照組小鼠足跖增厚顯著降低(P<0.05)。與模型對(duì)照組相比，陽性對(duì)照組小鼠足跖增厚值顯著增加(P<0.05)；多糖低、中劑量的足跖增厚值增加，但不顯著，而多糖高劑量的足跖增厚值顯著增加(P<0.05)。與陽性對(duì)照組相比，多糖中、高劑量組小鼠足跖增厚值差異不顯著，而多糖低劑量組差異顯著(P<0.05)。

2.4　多糖對(duì)小鼠脾臟B細(xì)胞分泌抗體能力的影響

多糖對(duì)小鼠脾臟B細(xì)胞分泌抗體能力的影響見表4。由表4可知：與正常對(duì)照組相比，模型對(duì)照組小鼠A450 nm值顯著降低(P<0.05)。與模型對(duì)照組相比，陽性對(duì)照組，多糖低、中、高劑量組小鼠A450 nm值顯著增大(P<0.05)。與陽性對(duì)照組相比，多糖低、中劑量組小鼠A450 nm差異顯著(P<0.05)，而多糖高劑量組的差異不顯著。

表3　多糖對(duì)小鼠遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)的影響

表4　多糖對(duì)小鼠脾臟B細(xì)胞分泌抗體能力的影響

3討論

脾臟與胸腺是機(jī)體首要的兩個(gè)免疫器官，當(dāng)注射氫化可的松等抑制免疫時(shí)，淋巴器官體積有縮小趨勢(shì)；當(dāng)喂入鹽酸左旋咪唑等增強(qiáng)免疫時(shí)，淋巴器官體積增大，質(zhì)量增加。因此，一定程度上，脾臟和胸腺指數(shù)可以表明機(jī)體的免疫功能強(qiáng)弱[8]。本文研究結(jié)果表明：發(fā)狀念珠藻多糖中、高劑量使注射了氫化可的松的小鼠的脾臟指數(shù)與胸腺指數(shù)顯著提高，說明發(fā)狀念珠藻多糖對(duì)抑制免疫的小鼠淋巴器官有促進(jìn)生長(zhǎng)作用。

巨噬細(xì)胞吞噬能力很強(qiáng)，當(dāng)碳粒等異物從小鼠尾部靜脈注射進(jìn)去后，可導(dǎo)致巨噬細(xì)胞迅速增多并將其吞噬，從而降低了血漿中異物的濃度，這是機(jī)體非特異性免疫防御的一項(xiàng)重要指標(biāo)[9]。文獻(xiàn)[10]研究提取出的厚殼貽貝多糖免疫活性時(shí)，發(fā)現(xiàn)多糖溶液對(duì)小鼠碳廓清有增強(qiáng)功效，且同樣存在一定劑量依賴關(guān)系。文獻(xiàn)[11]對(duì)馬尾藻多糖免疫活性進(jìn)行了研究，結(jié)果顯示多糖使小鼠吞噬指數(shù)顯著提高，增強(qiáng)了巨噬細(xì)胞殺傷能力。本試驗(yàn)中，發(fā)狀念珠藻多糖組小鼠的廓清指數(shù)和吞噬指數(shù)明顯大于模型對(duì)照小鼠，證明發(fā)狀念珠藻多糖對(duì)抑制免疫的小鼠巨噬細(xì)胞吞噬能力有增強(qiáng)作用。

定量溶血分光光度法，由溶血空斑試驗(yàn)的原理衍化得來，反映機(jī)體的體液免疫水平，其結(jié)果用吸光度表示，抗體產(chǎn)生量與其成正比。文獻(xiàn)[12]研究發(fā)現(xiàn)枸杞粗多糖可使SAMP8脾臟抗體形成細(xì)胞數(shù)顯著增多。而本試驗(yàn)中，發(fā)狀念珠藻多糖組在450 nm處的吸光度明顯比模型對(duì)照組大，說明發(fā)狀念珠藻多糖有助于小鼠脾臟B細(xì)胞生成并分泌抗體，體液免疫活性增強(qiáng)。

綜上所述，發(fā)狀念珠藻胞外多糖在一定程度上對(duì)小鼠的機(jī)體免疫活性有提高的功效，并表現(xiàn)出劑量效應(yīng)關(guān)系。

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