息肉標本預處理方法對高分辨率顯微內鏡成像效果的影響

作者單位：100039北京，武警總醫(yī)院消化內科

息肉標本預處理方法對高分辨率顯微內鏡成像效果的影響

談濤，屈亞威，劉海峰

【摘要】目的比較結腸息肉標本不同預處理方法對高分辨率顯微內鏡成像效果的影響。方法選擇90例離體結腸息肉標本，隨機分為3組，分別使用生理鹽水(A組)、生理鹽水+去黏液劑(B組)、生理鹽水+去黏液劑+高滲糖溶液(C組)沖洗，預處理結腸息肉標本后分別進行高分辨率顯微內鏡成像觀察，然后行病理學檢查，比較三組圖片質量，并與病理結果對照，分析診斷的準確率。結果每組息肉標本獲得高分辨率顯微內鏡圖片900張，A組優(yōu)質圖片317張，優(yōu)質率為35.2%，B組優(yōu)質圖片493張，優(yōu)質率為54.8%，C組優(yōu)質圖片564張，優(yōu)質率為62.7%，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。與病理檢查對比，A組同時診斷為腺瘤性息肉9例、非腺瘤性息肉8例，診斷準確率為56.7%；B組同時診斷為腺瘤性息肉13例、非腺瘤性息肉7例，診斷準確率為66.7%；C組同時診斷為腺瘤性息肉12例、非腺瘤性息肉15例，診斷準確率為90.0%，高分辨率顯微內鏡診斷結腸息肉總體準確率為71.1%，C組與A組相比、C組與B組相比，差異均具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。結論使用生理鹽水+去黏液劑+高滲糖溶液處理標本可以提高高分辨率顯微內鏡診斷準確性。

【關鍵詞】結腸息肉；高分辨率顯微內鏡；去黏液劑；高滲糖；診斷

通訊作者：劉海峰，E-mail：haifengliu333@163.com

作者簡介：田南，碩士研究生，E-mail：963422126@qq.com

【中國圖書分類號】R730.49

Affect of different pretreatment methods of polyp specimens on high-resolution microendoscopic imaging

TAN Tao, QU Yawei, and LIU Haifeng. Department of Gastroenterology,General Hospital of Chinese People’s Armed Police Forces,Beijing 100039, China

Abstract【】ObjectiveTo verify the effect of high-resolution microendoscopic imaging and to compare the effects of different pretreatment methods for colon polyps specimens in high-resolution microendoscopic imaging and the accuracy of the diagnosis of disease. MethodsIn vitro specimens from 90 patients with colon polyps were randomly divided into three groups: using saline (group A), saline plus mucus removing agent (group B), saline, and mucus removing agent plus hypertonic glucose solution (group C) to wash and high-resolution microscopic imaging was made for pretreated specimens of colon polyps and then for pathological examination.The picture quality of the three groups was analyzed. ResultsThe high-resolution microscopic images are 900 for specimens in each polyp, high-quality images in group A were 317 and high quality rate was 35.2%; high-quality images in group B were 493 and high quality rate was 54.8%; and high-quality images in group C were 564 and high quality rate was 62.7%, the difference was statistically significant (P<0.05).Compared with the pathological examination, group A showed simultaneous diagnosis of adenomatous polyps in 9 cases, 8 cases of non-adenomatous polyps, with diagnostic accuracy of 56.7%;group B showed simultaneous diagnosis of adenomatous polyps in 13 cases, non-adenomatous polyps in 7 cases, with diagnostic accuracy of 66.7%; and group C showed simultaneous diagnosis of adenomatous polyps in 12 cases, non-adenomatous polyps in 15 cases, with diagnostic accuracy of 90.0%. The overall accuracy of high-resolution microendoscopy in diagnosis of colon polyps was 71.1%. In Group C, compared with group A, and compared with group B. The difference was statistically significant (P<0.05). ConclusionsHigh-resolution microendoscopy has good imaging results for polyp specimens after pretreatment. It can improve the picture quality and diagnostic accuracy before imaging using saline combined with mucus removing agent and hypertonic glucose solution.

【Key words】colon polyps; high resolution microendoscopy; mucus removing agent; hypertonic glucose; diagnosis

高分辨率顯微內鏡(high resolution microendoscopy，HRME)是一種新型的成像技術，早期主要用于細胞成像研究[1]，近年來有學者開始嘗試應用于臨床研究[2-4]。借鑒國外學者的研究經(jīng)驗，筆者研制出一套HRME成像系統(tǒng)，前期預實驗(動物實驗)證明該成像系統(tǒng)對胃腸道黏膜具有較好的成像效果。為了進一步提高圖像質量，本研究選擇離體結腸息肉為研究對象，比較不同預處理方法對結腸息肉標本高分辨率顯微內鏡成像效果的影響為優(yōu)化預處理流程提供依據(jù)。

1　對象和方法

1.1對象2014-07至2014-10在我院消化內鏡中心行電子結腸鏡檢查診斷為結腸息肉的90例，其中男62例，女28例(男女比例為2.2∶1)，年齡為21～83歲，平均(48.4±5.3)歲。對經(jīng)電凝切除、內鏡下黏膜切除術(endoscopic mucosal resection，EMR)和內鏡下黏膜剝離術(endoscopic submucosal dissection，ESD)，術后90枚離體息肉標本進行HRME成像研究，息肉直徑0.6～4.2 cm。

1.2方法

1.2.1成像設備使用自行研制的HRME成像系統(tǒng)，包括1根含30 000像素、長1.8 m的光纖、10×顯微鏡鏡頭、500 nm二向色鏡、濾光片、三維組合平移臺、科學級低溫制冷CCD相機和計算機圖像處理軟件，成像過程中圖像以17幀/s的速度傳輸至計算機(圖1)。

圖1　HRME結構原理

1.2.2試劑0.01%原黃素鹽酸鹽(美國Sigma公司)、0.9%生理鹽水(辰欣藥業(yè)股份有限公司)、50%葡萄糖溶液(華潤雙鶴藥業(yè)股份有限公司)、鏈霉蛋白酶顆粒(北京泰德制藥股份有限公司)、碳酸氫鈉(北京奇祥宏業(yè)商貿有限公司)。

1.2.3成像方法

1.2.3.1標本預處理術前充分進行腸道準備，對于腸道準備差的患者，術中盡可能沖盡息肉表面的糞渣及殘留物。對術中發(fā)現(xiàn)的結腸息肉，經(jīng)電凝切除、EMR和ESD術后，標本用于成像研究。將息肉標本隨機分為A、B、C三組，A組標本用0.9%生理鹽水緩慢沖洗1 min，沖洗后干棉球擦干，備用。B組標本先用0.9%生理鹽水緩慢沖洗1 min后，再用配制好的鏈蛋白酶和碳酸氫鈉混合溶液沖洗1 min；再次使用0.9%生理鹽水沖洗，干棉球擦干，備用。C組標本在依次使用生理鹽水和去黏液劑沖洗后，再用50%葡萄糖溶液沖洗1 min，最后用0.9%生理鹽水沖去表面殘留溶液，干棉球擦干，備用。

1.2.3.2成像系統(tǒng)搭建搭建HRME成像系統(tǒng)，啟動計算機成像軟件，調節(jié)焦距，當視野中能清晰分辨出每個像元時為最佳成像狀態(tài)。

1.2.3.3成像過程對預處理后的標本分別局部噴灑0.01%原黃素鹽酸鹽1～2 ml，染色劑在組織表面大約停留30 s后緩沖鹽沖洗表面殘留染料，干棉球輕輕擦干組織表面殘留液體。將光纖頭端以不同角度觀察組織表面，標記觀察部位，每個標本留取30張清晰的圖片用于分析。檢查結束后組織行病理檢查。

1.2.3.4圖片質量判定標準參照Peter等[5]的方法，HRME圖像中細胞核顯像高于50%的圖片定為優(yōu)，而細胞核顯像低于50%的圖片定為差，對所得圖片進行分析。

整個HRME成像過程應在15 min內完成，圖片解讀由兩名經(jīng)過系統(tǒng)培訓的醫(yī)師共同完成，圖片分析結果與病理結果進行對比，整個過程在雙盲模式下完成。

1.3統(tǒng)計學處理應用SPSS17.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)處理。計量資料采用四格表方式，分別計算A、B、C三組圖片的優(yōu)質率以及三組HRME診斷結腸息肉與病理學診斷的相比較的準確性，采用χ2檢驗比較三組圖片優(yōu)質率和診斷準確率，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2　結　　果

2.1HRME圖片質量分析C組與A組相比、C組與B組相比，差異均具有統(tǒng)計學意義(P<0.05，表1)。

表1　HRME圖片質量分析

注：與A、B組優(yōu)質率比較，①P<0.05

2.2HRME診斷結果根據(jù)細胞核的大小、形態(tài)、排列方式、腺體結構，初步制定了HRME診斷結腸息肉的標準，非腺瘤性息肉診斷標準：細胞核大小一致、形態(tài)規(guī)則，排列有序，圓形或橢圓形的腺體結構(圖2)。腺瘤性息肉診斷標準：腺體增大，可見較多的線性隱窩，開口擴張，腺體呈管狀或指狀結構，偶爾可見絨毛結構(圖3)。C組與A組相比、C組與B組相比，差異均具有統(tǒng)計學意義(P<0.05，表2)。

表2　HRME診斷標準與病理學診斷結果比較

注：與A、B組準確率比較，①P<0.05

圖2非腺瘤性息肉(HE，×40)

A.白光內鏡；B.HRME；C.病理

圖3　腺瘤性息肉(HE，×40)

3　討　　論

HRME是基于高分辨率光纖和分子成像技術開發(fā)出的一種新的成像方法，能夠對組織進行實時成像，從而實現(xiàn)細胞水平的組織成像[6-8]。近年有研究者利用高分辨率顯微內鏡成像技術進行活體組織病理學成像，證實了HRME成像的可行性[2-4]。筆者使用自行研制的HRME成像系統(tǒng)對離體結腸息肉標本進行了HRME成像的初步研究，發(fā)現(xiàn)該成像系統(tǒng)對離體結腸息肉具有很好的成像效果和診斷準確率，與組織病理學相比較，三組診斷準確率分別為56.7%、73.3%和86.7%，表明HRME對病變的的診斷具有較高的準確性，而改善成像前的標本處理方法可以提高診斷的準確率。與組織病理學相比，HRME具有耗時短、花費少、操作簡單等優(yōu)點，具有重要臨床意義[9]。

如何獲得高質量的圖片成為HRME成像技術的一大難題。成像前標本的預處理是決定成像效果的重要因素。對于消化道組織標本而言，其表面主要附著物為唾液、黏液、糞液及其他雜質成分。唾液和黏液主要化學成分為蛋白質、H+和水分等[10]。對于標本的清潔主要依靠沖洗，以前僅使用生理鹽水沖洗，沖洗效果不盡如人意。本研究通過對組織表面附著物化學成分的研究，改進了沖洗方法，可以分為四步：(1)用生理鹽水沖洗初洗，去除表面的殘留物；(2)用鏈蛋白酶(或糜蛋白酶)和碳酸氫鈉混合溶液沖洗，去除組織表面的蛋白質和H+成分；(3)用高滲糖溶液沖洗；(4)用生理鹽水沖洗，去除表面殘留的沖洗液。通過這種沖洗方法對組織進行預處理，組織表面的清潔度得到改善，成像效果明顯提高。本研究比較了三種沖洗方法對成像圖片的影響，A組圖片優(yōu)質率為35.2%，B組圖片優(yōu)質率為54.8%，C組圖片優(yōu)質率為62.7%，表明通過該種沖洗方法可以獲得最好的成像效果。

蛋白酶和碳酸氫鈉沖洗的作用原理主要是通過蛋白酶使蛋白水解以及碳酸氫鈉與酸的中和作用[11]。根據(jù)不同組織表面的不同蛋白質成分可以選擇相應的特異性蛋白酶，會得到更好的效果。高滲溶液沖洗的原理主要是根據(jù)高滲溶液作用于細胞表面可以使細胞內水分由于濃度差的作用而流入細胞外，從而使細胞處于相對脫水狀態(tài)[12]，表面噴灑熒光對比劑更容易進入細胞內，使細胞核的染色效果更好。但實驗過程中要把握好高滲溶液的濃度和時間，防止細胞長時間脫水狀態(tài)而導致細胞死亡，以至于細胞核不能著色。研究中主要應用高滲糖溶液，根據(jù)其原理也可以使用高滲鹽、高濃度乙醇或其他對細胞無毒害作用的高滲溶液。

總之，成像前標本的清洗是成像成功的關鍵，筆者嘗試了很多方法，成像效果得到了明顯改善，但還需要繼續(xù)探索，希望能有更好的預處理方法。

HRME作為一種新型的成像方法展現(xiàn)了很多優(yōu)點，尤其是與傳統(tǒng)的內窺鏡相比更是具有即時組織病理學的優(yōu)勢，因此也受到越來越多的關注[13]。但HRME的成像方法還沒有統(tǒng)一的標準，筆者通過研究總結了一些經(jīng)驗，希望能對更多的研究提高幫助。然而，更好的成像方法還需要我們不斷的探索和實踐。

【參考文獻】

[1]Mark P, Dihua Y, Rebecca R. High-resolution Fiber-optic Microendoscopy for in situ [J]. Cellular Imaging，2011,11(47):2306.

[2]Pierce M C, Vila P M, Kingsley M J. Accuracy and interrater reliability for the diagnosis of Barrett’s neoplasia among users of a novel,portable high-resolution microendoscope[J]. Diseases of the Esophagus,2014,(27):55-62.

[3]Pierce M C, Guan Y, Quinn M K，etal. A pilot study of low-cost, high-resolution microendoscopy as a tool for identifying women with cervical precancer[J]. American Association for Cancer,2012,5(11):1273-1279.

[4]Aslanog lu M. Electrochemical and spectroscopic studies of the interaction of proflavine with DNA[J]. Analytical Sciences,2006,22(3):439-443.

[5]Peter M. Discrimination of benign and neoplastic mucosa with a high-resolution microendoscope[J]. Ann Surg Oncol，2012，19:3534-3539.

[6]Regunathan R, Woo J, Pierce M C,etal. Feasibility and preliminary accuracy of high-resolution imaging of the liver and pancreas using FNA compatible microendoscopy(with video)[J]. Gastrointest Endosc,2012,76(2):293-300.

[7]Neil D. In vivo diagnostic accuracy of high-resolution microendoscopy in differentiating neoplastic from non-neoplastic colorectal polyps: a prospective study[J]. Am J Gastroenterol,2014,109:68-75.

[8]WANG X, XU W, ZHANG F,etal. Diagnostic value of a new high-resolution microendoscopy for early esophageal cancer[J]. Chin J Dig Endosc,2012,29(1):24-28.

[9]Chang SS, Shukla1 R. Polydoridesetal. High resolution microendoscopy for classification of colorectal polyps[J]. Endoscopy, 2013, 45: 553-559.

[10]李松華，連超，李兆申,等. 胃黏液的理化性狀研究進展[M].國外醫(yī)學，2002，22(1)：4-6.

[11]李淑瑩.鏈霉蛋白酶聯(lián)合達克羅寧膠漿作為胃鏡檢查術前準備的臨床療效[J].醫(yī)學信息，2014，27(6)：516.

[12]胡曉梅，金秀梅，馮亞茹,等.靜脈注射50%葡萄糖溶液對血滲透壓的影響研究[J].中國綜合臨床,2003，19(7)：626-627.

[13]Justin S.Applications and advancements in the use of high-resolution microendoscopy for detection of gastrointestinal neoplasia[J]. Clinical Gastroenterology and Hepatology，2014,12(11):1789-1792.

(2015-01-11收稿2015-03-11修回)

(責任編輯梁秋野)