NRP-1和NRP-2在結(jié)直腸癌組織中的表達水平及臨床意義*

周秋媛，王紅莉，李 虹，李 偉，徐艷華(恩施州中心醫(yī)院病理科，湖北恩施 445000)

結(jié)直腸癌為常見消化道惡性腫瘤之一，近年來有年輕化傾向，嚴(yán)重危害患者健康甚至危及生命[1，2]。結(jié)直腸癌的發(fā)病與多種因素有關(guān)[3]，其治療以手術(shù)治療為主，同時輔助放化療。早發(fā)現(xiàn)、早治療對結(jié)直腸癌病情的緩解具有重要意義[4]。近年來，腫瘤標(biāo)志物在惡性腫瘤發(fā)病中的作用為越來越多學(xué)者重視。神經(jīng)纖毛蛋白1(neuropilin,NRPs)家族中，NRP-1，NRP-2為其主要成員，參與了多種生物學(xué)反應(yīng)。研究發(fā)現(xiàn)，NRP-1，NRP-2在非小細(xì)胞肺癌[5]和鼻咽癌[6]等惡性腫瘤細(xì)胞的增殖和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用，在這些惡性腫瘤中，NRP-1，NRP-2可出現(xiàn)異常表達。有關(guān)NRP-1，NRP-2的表達與結(jié)直腸癌發(fā)病關(guān)系的研究較少。因此，本研究通過檢測結(jié)直腸癌患者血清中NRP-1，NRP-2的表達水平，旨在探討NRP-1，NRP-2的表達與結(jié)直腸癌發(fā)病及臨床病理的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 研究對象 選取2014年12月～2015年9月期間被湖北省恩施州中心醫(yī)院收治的65例結(jié)直腸癌患者和65例腸息肉患者作為研究對象。結(jié)直腸癌和腸息肉均經(jīng)病理科確診[7]。65例結(jié)直腸癌患者年齡41～80歲，平均年齡為65.37±7.81歲，病程3～7年，平均病程為3.26±0.74年，均無吸煙史、飲酒史，其中2例有結(jié)直腸癌家族史。腸息肉患者年齡41～80歲，平均年齡為64.81±7.16歲，病程3～5年，平均病程為2.97±0.67年，均無吸煙史、飲酒史、結(jié)直腸癌家族史。選擇同期在我院健康檢查的65例健康女性作為正常對照組，年齡41～80歲，平均年齡65.14±7.36歲，均無吸煙史、飲酒史、結(jié)直腸癌家族史。3組年齡、吸煙史、飲酒史、結(jié)直腸癌家族史等資料比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，有可比性。本研究經(jīng)入組對象簽署知情同意書，并獲湖北省恩施州中心醫(yī)院倫理委員會審批通過。

1.2 試劑和儀器 用真空干燥管抽取入組對象空腹靜脈血4 ml，其中42例接受結(jié)直腸癌改良根治術(shù)的病例在其治療后再次抽取空腹靜脈血4 ml；上述標(biāo)本用美國Invitrogen公司生產(chǎn)的離心機，以3 500 r/min離心10 min后取上清液保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 方法 采用美國Invitrogen公司生產(chǎn)的熒光定量PCR儀行RT-PCR，檢測結(jié)直腸癌和腸息肉及健康人群血清中NRP-1，NRP-2 mRNA的表達水平，以GAPDH為內(nèi)參。NRP-1上游引物為：5’ GCGTGAGTGTGTGTGTGTGAGTG 3’，下游引物為：5’AAGCTCTGGGTTTCATGCCA 3’；GAPDH上游引物為：5’AGAAACGAGCCTGCCTTACA 3’，下游引物為：5’ATCAAGTCCAGGGCTTCAGA 3’。NRP-2上游引物為：5’AAGAAGCATTTCAACGCCTCC 3’，下游引物為：5’TGGAATGGAGCAGCGGAGTC 3’；GAPDH上游引物為：5’CTCTGCTCCTCCTGTTCGAC 3’，下游引物為：5’TTAAAAGCAGCCCTGGTGAC’。PCR反應(yīng)步驟如下：94℃預(yù)變性3 min：94℃變性20 s，60℃退火30 s，72℃延伸40 s，35個循環(huán)，72℃延伸10 min。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析 使用SPSS 16.0軟件，計量資料執(zhí)行單因素方差分析或t檢驗，相關(guān)性分析采用Pearson檢驗；P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 結(jié)直腸癌組、腸息肉組、對照組血清NRP-1，NRP-2 mRNA水平 經(jīng)RT-PCR檢測，結(jié)直腸癌組NRP-1水平(36.51±4.62 μg/ml)高于腸息肉組(8.19±4.08 μg/ml)和健康對照組(7.92±4.05 μg/ml)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=50.32，P=0.000)；結(jié)直腸癌組NRP-2 mRNA水平(24.59±3.26 μg/ml)高于腸息肉組(5.47±1.11 μg/ml)和健康對照組(5.19±1.05 μg/ml)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=49.36，P=0.000)。腸息肉組和健康對照組NRP-1，NRP-2 mRNA水平比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(t=1.07，1.15，P=0.762，0.789，>0.05)。

2.2 結(jié)直腸癌患者血清中NRP-1，NRP-2 mRNA的水平與臨床病理的關(guān)系 見表1。經(jīng)RT-PCR檢測，隨著患者病理分期的增加、分化程度的降低，結(jié)直腸癌組血清NRP-1，NRP-2 mRNA水平呈升高趨勢。此外，結(jié)直腸癌組血清NRP-1，NRP-2 mRNA水平與患者是否伴肝轉(zhuǎn)移、出現(xiàn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)。伴肝轉(zhuǎn)移和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的結(jié)直腸癌患者，血清NRP-1，NRP-2 mRNA水平高于未出現(xiàn)肝轉(zhuǎn)移和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的結(jié)直腸癌患者(P<0.05)。結(jié)直腸癌患者血清NRP-1，NRP-2 mRNA水平與年齡未表現(xiàn)出明顯的相關(guān)性(P>0.05)。

2.3 相關(guān)性分析 將結(jié)直腸癌患者血清中NRP-1，NRP-2 mRNA等指標(biāo)進行相關(guān)性分析，結(jié)果顯示，結(jié)直腸癌患者血清NRP-1，NRP-2 mRNA水平呈正相關(guān)(r=0.415，P=0.015)。

3 討論

NRP-1，NRP-2為NRPs家族的成員，在多種生物學(xué)過程中扮演重要角色[8，9]。安吉洋等[10]發(fā)現(xiàn)，NRP-1在機體的神經(jīng)損傷及修復(fù)過程中發(fā)揮重要作用。亦有學(xué)者[11]發(fā)現(xiàn)，NRP-1在非小細(xì)胞肺癌中出現(xiàn)異常表達，NRP-1的水平異常變化與非小細(xì)胞肺癌的發(fā)病及進展密切相關(guān)。孫瑾等[6]的體內(nèi)外試驗研究顯示，抑制NRP-1的表達對抑制鼻咽癌細(xì)胞的增殖、促進鼻咽癌細(xì)胞的凋亡具有顯著作用。國外研究[11]發(fā)現(xiàn)，除了NRP-1，NRP-2在神經(jīng)損傷、修復(fù)甚至腫瘤疾病的發(fā)病進展中亦扮演重色角色。

表1 結(jié)直腸癌患者血清中NRP-1，NRP-2 mRNA的水平與臨床病理的關(guān)系

有關(guān)NRP-1，NRP-2的表達水平與結(jié)直腸癌關(guān)系及其在結(jié)直腸癌的發(fā)病和病理變化中的作用的相關(guān)研究較少，因此本研究對此進行探討。本研究采用RT-PCR技術(shù)檢測了結(jié)直腸癌、腸息肉及健康者血清中NRP-1和NRP-2的水平，檢測結(jié)果顯示，結(jié)直腸癌患者血清中NRP-1，NRP-2呈高水平，明顯高于腸息肉及健康人群。這表明NRP-1和NRP-2的表達水平與結(jié)直腸癌的發(fā)病亦有關(guān)。與相關(guān)研究[11]結(jié)果一致。

此外，我們亦檢測了不同臨床病理結(jié)直腸癌患者血清中NRP-1，NRP-2的表達水平。經(jīng)RT-PCR檢測，我們發(fā)現(xiàn)，NRP-1和NRP-2的表達水平與結(jié)直腸癌患者的年齡無明顯相關(guān)性，但NRP-1和NRP-2水平與結(jié)直腸癌患者的病理分期及分化程度明顯相關(guān)。結(jié)直腸癌患者出現(xiàn)肝轉(zhuǎn)移及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移預(yù)示著患者預(yù)后差，而我們在研究中發(fā)現(xiàn)，伴肝轉(zhuǎn)移和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者其血中NRP-1和NRP-2水平高于未出現(xiàn)肝轉(zhuǎn)移和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者。表明NRP-1，NRP-2的水平與結(jié)直腸癌患者的預(yù)后亦密切相關(guān)。而相關(guān)性顯示，結(jié)直腸癌患者血清NRP-1，NRP-2 mRNA水平呈正相關(guān)，這表明NRP-1，NRP-2在結(jié)直腸癌的發(fā)病及病理變化過程中可能共同發(fā)揮作用。

結(jié)合相關(guān)研究，我們推測，NRP-1，NRP-2可能通過下述途徑參與了結(jié)直腸癌的發(fā)病及病情進展：①NRP-1，NRP-2與VEGF家族有關(guān)成員相結(jié)合，促進惡性腫瘤細(xì)胞的增殖[12]；②NRP-1，NRP-2與配體SEMA家族成員相結(jié)合，促進結(jié)直腸癌腫瘤細(xì)胞的增殖及血管生成[13，14]；③NRP-1，NRP-2可以促進結(jié)直腸癌患者淋巴結(jié)的轉(zhuǎn)移和惡性腫瘤細(xì)胞的侵襲[15]。

本研究不足之處在于樣本量較少，因此對實驗結(jié)果可能會造成一定的影響。本研究結(jié)果顯示，結(jié)直腸癌血清NRP-1，NRP-2水平高于腸息肉及健康人群。血清NRP-1，NRP-2水平與結(jié)直腸癌的臨床病理及預(yù)后密切相關(guān)，NRP-1，NRP-2可能共同起作用。

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