BARF1表達(dá)下調(diào)通過(guò)活化caspase依賴(lài)的線粒體通路誘導(dǎo)EBV陽(yáng)性胃癌細(xì)胞凋亡

BARF1表達(dá)下調(diào)通過(guò)活化caspase依賴(lài)的線粒體通路誘導(dǎo)EBV陽(yáng)性胃癌細(xì)胞凋亡

劉俊1，張雪林2，任永生3，鄭新1△

(1湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬東風(fēng)醫(yī)院胃腸外科，湖北 十堰 442008； 湖北醫(yī)藥學(xué)院2護(hù)理學(xué)院，3基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，湖北 十堰 442000)

[摘要]目的： 研究BARF1表達(dá)下調(diào)對(duì)EBV陽(yáng)性胃癌細(xì)胞凋亡的影響，以及BARF1基因沉默介導(dǎo)細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制。方法: siRNA和NCsiRNA分別轉(zhuǎn)染NUGC3和SNU719細(xì)胞，運(yùn)用Western blot測(cè)定細(xì)胞中BARF1、Bcl-2、Bax、細(xì)胞色素C、caspase 3和caspase 9的蛋白表達(dá)；RT-PCR測(cè)定BARF1、Bcl-2和Bax mRNA的表達(dá)；臺(tái)盼藍(lán)染色法測(cè)定細(xì)胞存活率；Annexin V-FITC/PI染色法和流式細(xì)胞儀測(cè)定細(xì)胞凋亡；細(xì)胞凋亡因子抗體芯片分析細(xì)胞中凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)；線粒體膜電位檢測(cè)試劑盒測(cè)定線粒體膜電位；免疫共沉淀檢測(cè)細(xì)胞中Apaf-1和caspase 9的相互作用。結(jié)果: 與空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組相比， BARF1基因沉默顯著誘導(dǎo)NUGC3和SNU719細(xì)胞凋亡，而線粒體膜電位顯著降低。BARF1沉默基因能促進(jìn)促凋亡蛋白的表達(dá)并抑制抗凋亡蛋白的表達(dá)，Bcl-2/Bax比例顯著降低；而caspase抑制劑能抑制由BARF1基因沉默介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。在siRNA轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中，caspase 3和caspase 9蛋白發(fā)生裂解，細(xì)胞色素C的濃度顯著高于陰性對(duì)照組，Apaf-1蛋白與caspase 9蛋白在細(xì)胞質(zhì)中能夠發(fā)生相互作用。結(jié)論: BARF1基因沉默通過(guò)線粒體途徑調(diào)節(jié)Bcl-2和Bax蛋白的表達(dá)進(jìn)而誘導(dǎo)NUGC3和SNU719細(xì)胞凋亡，并呈caspase通路依賴(lài)關(guān)系。

[關(guān)鍵詞]BARF1； EB病毒； 胃癌； 細(xì)胞凋亡； 線粒體通路

[中圖分類(lèi)號(hào)]R730.23[文獻(xiàn)標(biāo)志碼]A

doi:10.3969/j.issn.1000-4718.2015.11.008

[文章編號(hào)]1000-4718(2015)11-1979-07

[收稿日期]2015-04-28[修回日期] 2015-07-14

通訊作者△Tel: 0472-2178435; E-mail: xbkld@163.com

Down-regulated BARF1 expression induces EBV-positive gastric carcinoma cell apoptosis via activating caspase-dependent mitochondrial pathwayLIU Jun1, ZHANG Xue-lin2, REN Yong-sheng3, ZHENG Xin1

(1DepartmentofGastrointestinalSurgery,TheAffiliatedDongfengHospital,HubeiUniversityofMedicine,Shiyan442008,China;2CollegeofNursing，3CollegeofBasicMedicine,HubeiUniversityofMedicine,Shiyan442000,China.E-mail:Zhengxin19740912@163.com)

ABSTRACT[]AIM: To investigate the effects of BARF1 down-regulation on EBV-positive gastric carcinoma cell apoptosis, and the molecular mechanisms by BARF1 silencing-mediated apoptosis. METHODS: After NUGC3 and SNU719 cells were transfected with NCsiRNA and siRNA, respectively, the protein levels of BARF1, Bcl-2, Bax, cytochrome C, caspase 3 and capase 9 were detected by Western blot, and the mRNA expression of BARF1, Bcl-2 and Bax was determined by RT-PCR. The cell viability was measured by the method of Trypan blue exclusion and the cell apoptosis was analyzed by flow cytometry analysis with Annexin V-FITC/PI staining. The expression of the apoptosis-related proteins in the cells transfected with siRNA and NCsiRNA was examined by human apoptosis antibody arrays. Mitochondrial membrane potential was determined by flow cytometry. The interaction between Apaf-1 and caspase 9 was confirmed by immunoprecipitation. RESULTS: Compared with untreated and NCsiRNA groups, BARF1 gene silencing significantly inhibited the cell viability， induced apoptosis, and reduced the mitochondrial membrane potential in the NUGC3 and SNU719 cells transfected with siRNA. BARF1 gene silencing up-regulated the expression of pro-apoptotic proteins and down-regulated the expression of anti-apoptotic proteins, and the Bcl-2/Bax ratio was significantly decreased. In BARF1 gene silencing cells, the caspase inhibitor z-VAD-fmk inhibited BARF1 silencing-mediated apoptosis, and significantly increased the levels of cleaved caspase 3 and caspase 9. The concentration of cytochrome C significantly increased as compared with NCsiRNA group, and Apaf-1 interacted with caspase 9 in the cytoplasm. CONCLUSION: BARF1 silencing induces apoptosis via the mitochondrial pathway through regulating the expression of Bcl-2 and Bax proteins in a caspase-dependent manner in the NUGC3 and SNU719 cells.

[KEY WORDS]BARF1; Epstein-Barr virus; Gastric carcinoma; Apoptosis; Mitochondrial pathway

EB病毒(Epstein-Barr virus，EBV)屬于癌癥病毒家族，由于EBV與多種惡性腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)而備受關(guān)注[1]。EBV編碼的LMP1癌基因和BARF1癌基因在調(diào)控關(guān)鍵基因表達(dá)以及參與EBV介導(dǎo)的腫瘤發(fā)生中具有重要作用[2]。研究發(fā)現(xiàn)，在B細(xì)胞淋巴瘤和鼻NK/T細(xì)胞淋巴瘤中能檢測(cè)到BARF1的表達(dá)[3-4]。此外，BARF1在鼻咽癌細(xì)胞、EBV相關(guān)胃癌細(xì)胞以及EBV陽(yáng)性永生化表皮細(xì)胞中高表達(dá)[5-6]。

大量研究表明，BARF1基因高表達(dá)能夠誘導(dǎo)鼠成纖維細(xì)胞和人EBV陰性B細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化[7]。攜帶BARF1基因的EBV重組體感染的EBV陰性細(xì)胞對(duì)裸鼠的致瘤能力顯著增強(qiáng)，但細(xì)胞中Bcl-2的表達(dá)無(wú)變化[8]。有研究發(fā)現(xiàn)純化的BARF1蛋白具有很高的促有絲分裂原活性，BARF1能促進(jìn)鼠成纖維細(xì)胞和EBV陰性人B細(xì)胞中抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)，提示BARF1具有抗凋亡作用[9-10]。另有研究發(fā)現(xiàn)，BARF1通過(guò)增加Bcl-2和Bax的比例抑制胃癌細(xì)胞凋亡[11]。BARF1能促進(jìn)多種癌細(xì)胞增殖，其可能作為一種促癌因子并能夠抑制細(xì)胞凋亡通路進(jìn)而抑制細(xì)胞凋亡[12]。但是，BARF1抑制胃癌細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制仍不完全清楚。因此，本文以EBV陽(yáng)性胃癌細(xì)胞系NUGC3和SNU719細(xì)胞為研究對(duì)象，體外研究BARF1抗細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制。

材料和方法

1細(xì)胞株和材料

EBV陽(yáng)性胃癌細(xì)胞系NUGC3和SNU719細(xì)胞購(gòu)自ATCC；胎牛血清、胰蛋白酶和RPMI-1640培養(yǎng)基(Gibco)；雙抗購(gòu)自北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司；DMSO和MTT購(gòu)自Sigma；脂質(zhì)體2000、RT-PCR試劑盒、TRIzol試劑和Annexin V-FITC/PI試劑盒購(gòu)自Invitrogen；BCA蛋白濃度檢測(cè)試劑盒購(gòu)自Thermo；抗體(BARF1、Bcl-2、Bax、PARP、caspase 9、caspase 3、細(xì)胞色素C和Apaf-1)購(gòu)自CST；GAPDH抗體和Ⅱ抗IgG購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；APO LOGIX JC-1線粒體膜電位檢測(cè)試劑盒購(gòu)自上海博升生物科技有限公司；RayBio?人細(xì)胞凋亡因子抗體芯片試劑盒購(gòu)自廣州瑞博奧生物科技有限公司；其它試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

2主要方法

2.1細(xì)胞培養(yǎng)NUGC3和SNU719細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清、1%青霉素和1%鏈霉素的RPMI-1640 培養(yǎng)基中，置于37 ℃、5% CO2及飽和濕度的培養(yǎng)箱內(nèi)。待細(xì)胞融合度達(dá)到80%～90%時(shí)進(jìn)行細(xì)胞傳代，按細(xì)胞密度轉(zhuǎn)到相應(yīng)細(xì)胞培養(yǎng)瓶中正常培養(yǎng)。

2.2siRNA合成從GenBank獲得BARF1基因序列(GenBank:V01555)，針對(duì)BARF1基因開(kāi)放閱讀框序列的3個(gè)不同位置 (189-207、409-427和545-563 bp)，運(yùn)用Ambion公司的網(wǎng)上在線軟件(http://www.ambion.com/techlib/misc/siRNA_finder.html)篩選獲得3條不同的siRNA序列，由上海生工合成。通過(guò)實(shí)驗(yàn)篩選能顯著干擾BARF1 mRNA表達(dá)的siRNA序列，即針對(duì)BARF1基因序列409～427 bp區(qū)間的siRNA序列，見(jiàn)表1，同時(shí)設(shè)計(jì)陰性對(duì)照siRNA(negative control siRNA，NCsiRNA)序列。

表1　 BARF1基因的siRNA序列

2.3siRNA轉(zhuǎn)染通過(guò)siRNA干擾NUGC3和SNU719細(xì)胞中BARF1基因表達(dá)，觀察BARF1基因沉默對(duì)細(xì)胞活力和細(xì)胞凋亡的影響。將生長(zhǎng)良好的NUGC3細(xì)胞和SNU719細(xì)胞消化計(jì)數(shù)后，以細(xì)胞密度為2.5×105cells/well接種到6孔板中，置于37 ℃、5% CO2及飽和濕度的培養(yǎng)箱中，待細(xì)胞融合度達(dá)到80%～90%時(shí)按照脂質(zhì)體2000說(shuō)明書(shū)進(jìn)行siRNA轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染的細(xì)胞培養(yǎng)4 h后換成完全培養(yǎng)基，以轉(zhuǎn)染NCsiRNA為陰性對(duì)照，未轉(zhuǎn)染(untreated)的細(xì)胞為空白對(duì)照，細(xì)胞置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.4RT-PCR轉(zhuǎn)染的細(xì)胞經(jīng)消化，離心后收集細(xì)胞，按照TRIzol試劑說(shuō)明書(shū)提取總RNA，分光光度計(jì)測(cè)定其吸光度(A)值，A260/A280的比值在1.8～2.0之間表示RNA純度滿足實(shí)驗(yàn)需求，通過(guò)電泳驗(yàn)證RNA的完整性，RNA保存于-80 ℃。按照RT-PCR試劑盒說(shuō)明書(shū)合成cDNA，反應(yīng)條件為42 ℃ 1 h；70 ℃ 5 min；4 ℃放置10 min，合成的cDNA置于-80 ℃保存。取1 μL cDNA進(jìn)行PCR反應(yīng)，Bcl-2、Bax和GAPDH引物見(jiàn)表2。PCR反應(yīng)條件為94 °C 5 min； 94 ℃ 30 s，56 ℃ 40 s，72 ℃ 30 s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min。PCR產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳，拍照，運(yùn)用Quantity-One軟件進(jìn)行結(jié)果分析，Bcl-2和Bax的表達(dá)量經(jīng)GAPDH標(biāo)準(zhǔn)化表示。

表2Bcl-2、Bax和GAPDH的RT-PCR擴(kuò)增引物

Table 2. The primers of Bcl-2, Bax and GAPDH for RT-PCR amplification

NameForwardprimer(5’-3’)Reverseprimer(5’-3’)Bcl-2CCTGTGGATGACT-GAGTACCGAGACAGCCAG-GAGAA-ATCABaxGTTTCATCCAG-GATCG-AGCAGCATCTTCTTCCA-GATGG-TGAGAPDHTGCCTCCTGCAC-CACC-AACTCGCCTGCTTCAC-CACCTTC

2.5臺(tái)盼藍(lán)染色計(jì)數(shù)法轉(zhuǎn)染的細(xì)胞分別在0 h、48 h和72 h進(jìn)行臺(tái)盼藍(lán)染色后計(jì)數(shù)。細(xì)胞經(jīng)消化離心后加入PBS制成細(xì)胞懸液，取50 μL細(xì)胞懸液加入450 μL 0.4%臺(tái)盼藍(lán)輕輕混勻，室溫染色5 min。取10 μL染色后的細(xì)胞懸液加入到細(xì)胞計(jì)數(shù)板，選擇3個(gè)不同區(qū)域計(jì)數(shù)。按照下列公式計(jì)算細(xì)胞存活率：細(xì)胞存活率(%)=平均活細(xì)胞數(shù)/平均總細(xì)胞數(shù)×100%。

2.6流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡為了研究BARF1表達(dá)下調(diào)是否通過(guò)激活caspase通路誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，選擇caspase抑制劑z-VAD-fmk處理經(jīng)siRNA轉(zhuǎn)染的胃癌細(xì)胞，觀察細(xì)胞凋亡情況。轉(zhuǎn)染的細(xì)胞培養(yǎng)72 h后棄掉培養(yǎng)基，PBS洗滌，細(xì)胞經(jīng)無(wú)EDTA的胰酶消化收集細(xì)胞，加入PBS制成細(xì)胞懸液。按照Annexin V試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，先加入500 μL的binding buffer重懸細(xì)胞，再加入5 μL FITC標(biāo)記的Annexin V和5 μL PI混勻，室溫下避光孵育15 min，運(yùn)用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡。

2.7Western blot檢測(cè)蛋白水平轉(zhuǎn)染的細(xì)胞培養(yǎng)72 h后經(jīng)胰酶消化，離心收集細(xì)胞，加入RIPA細(xì)胞裂解液重懸細(xì)胞，超聲破碎、12 000 r/min，4 ℃離心10 min，按照BCA試劑盒說(shuō)明書(shū)測(cè)定總蛋白濃度。按照線粒體分離試劑盒說(shuō)明書(shū)分離細(xì)胞中的線粒體，并提取線粒體中的總蛋白；收集細(xì)胞培養(yǎng)液，5 000 r/min，4 ℃離心10 min去除細(xì)胞碎片，PBS洗滌；加入10 mL無(wú)血清培養(yǎng)基輕輕吹打混勻，超濾濃縮至10 μL，測(cè)定總蛋白濃度。每個(gè)樣本取50 μg進(jìn)行10% SDS-PAGE，轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上，5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，分別孵育Ⅰ抗(BARF1、Bcl-2、Bax、PARP、caspase 9、caspase 3、細(xì)胞色素C和Apaf-1)，以GAPDH為內(nèi)參照，4 ℃過(guò)夜。洗膜，分別孵育AP偶聯(lián)或HRP偶聯(lián)的Ⅱ抗，室溫孵育1 h。AP偶聯(lián)的膜經(jīng)KPL顯影后掃描，HRP偶聯(lián)的膜經(jīng)ECL顯影后掃描，蛋白相對(duì)表達(dá)量經(jīng)內(nèi)參照歸一化后經(jīng)Quantity One軟件分析。

2.8線粒體膜電位變化的測(cè)定線粒體膜電位變化能激活細(xì)胞凋亡通路使細(xì)胞發(fā)生凋亡，因此運(yùn)用線粒體膜電位測(cè)定試劑盒和流式細(xì)胞儀測(cè)定NUGC3和SNU719細(xì)胞中BARF1表達(dá)下調(diào)對(duì)線粒體膜電位的影響。JC-1陽(yáng)離子熒光染料與線粒體結(jié)合呈紅色(線粒體膜電位減小)，與凋亡細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)結(jié)合呈綠色(線粒體膜電位升高)。按照APO LOGIX JC-1線粒體膜電位檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)測(cè)定細(xì)胞中線粒體膜電位。細(xì)胞經(jīng)胰酶消化，離心收集細(xì)胞，加入1× JC-1溶液重懸細(xì)胞，輕輕混勻；細(xì)胞懸液置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中孵育15 min，5 000 r/min，離心5 min收集細(xì)胞；加入2 mL 1×buffer溶液，輕輕混勻，離心后棄上清；加入1 mL 1×buffer溶液，輕輕混勻后立即用流式細(xì)胞儀進(jìn)行測(cè)定分析。FL2通道檢測(cè)正常細(xì)胞中紅色JC-1標(biāo)記的線粒體，F(xiàn)L1通道檢測(cè)凋亡細(xì)胞中綠色JC-1標(biāo)記的線粒體。

2.9細(xì)胞凋亡因子抗體芯片實(shí)驗(yàn)為了研究胃癌細(xì)胞中BARF1表達(dá)下調(diào)對(duì)細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響，將NCsiRNA和siRNA分別轉(zhuǎn)染NUGC3和SNU719細(xì)胞后運(yùn)用RayBio?人細(xì)胞凋亡因子抗體芯片試劑盒測(cè)定細(xì)胞中與細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)。按照RayBio?人細(xì)胞凋亡因子抗體芯片試劑盒說(shuō)明書(shū)測(cè)定胃癌細(xì)胞中細(xì)胞凋亡相關(guān)因子的表達(dá)變化，該試劑盒能檢測(cè)細(xì)胞中至少43種不同的細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白和GAPDH蛋白，靈敏度達(dá)到ng/L。采用G2505C微列陣掃描儀(安捷倫科技公司)對(duì)激發(fā)Cy3綠色熒光信號(hào)的玻片載體進(jìn)行掃描，運(yùn)用6.1.0.4 版本GenePix?微陣列采集分析軟件(安捷倫科技公司)對(duì)圖片和數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，使用背景校正法對(duì)原始強(qiáng)度值進(jìn)行分析。生物素標(biāo)記的蛋白能發(fā)出熒光作為檢測(cè)信號(hào)，通過(guò)熒光信號(hào)強(qiáng)弱比較不同孔板之間細(xì)胞凋亡蛋白的相對(duì)表達(dá)量，陽(yáng)性對(duì)照為生物素標(biāo)記的抗體。生物素標(biāo)記的IgG直接結(jié)合在玻片芯片載體上，如果芯片上的變量相同，則陽(yáng)性對(duì)照的熒光強(qiáng)度相等。運(yùn)用RayBio抗體列陣分析工具對(duì)圖片和數(shù)據(jù)進(jìn)行背景校正和標(biāo)準(zhǔn)化。

2.10免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)將siRNA轉(zhuǎn)染NUGC3和SNU719細(xì)胞后，運(yùn)用caspase 9 抗體免疫共沉淀caspase 9蛋白，隨后用Apaf-1抗體檢測(cè)細(xì)胞凋亡蛋白復(fù)合體。收集細(xì)胞，并提取細(xì)胞總蛋白，向蛋白濃度為400 μg的溶液中加入caspase 9抗體和20 μL的Protein A凝膠將caspase 9蛋白免疫共沉淀出來(lái)。沉淀物經(jīng)蛋白提取試劑洗滌5次，PBS洗滌1次；加入1×樣品緩沖液(50 mmol/L Tris，pH 6.8, 100 mmol/L溴酚藍(lán),10%甘油)重懸，混勻后90 °C水浴5 min，之后進(jìn)行SDS-PAGE，除 I 抗是Apaf-1抗體外，后續(xù)步驟同2.8。

3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行相關(guān)數(shù)據(jù)分析，結(jié)果用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，2組之間的比較采用t檢驗(yàn)，多組間的比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

1siRNA沉默NUGC3和SNU719細(xì)胞中BARF1的表達(dá)

RT-PCR結(jié)果顯示，NCsiRNA和siRNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞72 h后，與NCsiRNA和untreated組比較，siRNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞中BARF1 mRNA的表達(dá)量顯著降低(P<0.01)；而NCsiRNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞和空白細(xì)胞中BARF1的mRNA表達(dá)量無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。Western blot結(jié)果顯示，NUGC3和SNU719細(xì)胞中內(nèi)源性表達(dá)BARF1蛋白，而siRNA下調(diào)BARF1蛋白表達(dá)，NCsiRNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞中BARF1蛋白表達(dá)無(wú)明顯變化。在細(xì)胞培養(yǎng)上清中沒(méi)有檢測(cè)到BARF1蛋白的表達(dá)。研究結(jié)果表明，siRNA顯著降低NUGC3和SNU719細(xì)胞中BARF1的mRNA和蛋白表達(dá)，見(jiàn)圖1。

Figure 1.siRNA-mediated BARF1 down-regulation in the NUGC3 cells and SNU719 cells transfected with NCsiRNA and siRNA. Mean±SD.n=6.**P<0.01vsuntreated and NCsiRNA groups.

圖1siRNA介導(dǎo)NUGC3 和SNU719細(xì)胞中BARF1 mRNA和蛋白表達(dá)下調(diào)

2BARF1表達(dá)下調(diào)抑制胃癌細(xì)胞存活

運(yùn)用臺(tái)盼藍(lán)染色法測(cè)定siRNA轉(zhuǎn)染NUGC3和SNU719細(xì)胞后的細(xì)胞存活率。結(jié)果顯示，與空白對(duì)照和陰性對(duì)照組比較，細(xì)胞存活率顯著降低(P<0.05)，并呈時(shí)間依賴(lài)關(guān)系，見(jiàn)圖2。

Figure 2.Down-regulation of BARF1 inhibited the viability of NUGC3 and SNU719 cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05,**P<0.01vsuntreated and NCsiRNA groups.

圖2BARF1表達(dá)下調(diào)抑制NUGC3和SNU719細(xì)胞活力

3BARF1表達(dá)下調(diào)誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞凋亡

利用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，siRNA轉(zhuǎn)染的NUGC3和SNU719細(xì)胞凋亡率顯著高于陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組細(xì)胞(P<0.01)，轉(zhuǎn)染72 h的細(xì)胞凋亡率NUGC3細(xì)胞為43.62%，SNU719細(xì)胞為40.96%，空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組之間的細(xì)胞凋亡率無(wú)顯著差異。進(jìn)一步觀察NUGC3和SNU719細(xì)胞中BARF1表達(dá)下調(diào)后對(duì)典型的細(xì)胞凋亡生物標(biāo)志物PARP蛋白表達(dá)的影響，結(jié)果顯示，siRNA轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中PARP蛋白發(fā)生裂解，明顯觀察到116 kD和89 kD兩條帶，而空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組細(xì)胞中PARP蛋白未發(fā)生裂解。研究結(jié)果表明，NUGC3和SNU719細(xì)胞中BARF1的低表達(dá)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，見(jiàn)圖3。

Figure 3.Silencing ofBARF1 expression induced apoptosis in the NUGC3 cells and SNU719 cells. Mean±SD.n=3.**P<0.01vsuntreated group and NCsiRNA group.

圖3沉默BARF1表達(dá)誘導(dǎo)NUGC3細(xì)胞和 SNU719 細(xì)胞凋亡

4BARF1表達(dá)下調(diào)改變線粒體膜電位誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞凋亡

線粒體膜電位檢測(cè)結(jié)果如圖4所示。siRNA轉(zhuǎn)染的NUGC3和SNU719細(xì)胞中紅色JC-1化合物濃度顯著低于空白對(duì)照和陰性對(duì)照組細(xì)胞(P<0.01)，提示細(xì)胞中線粒體膜電位降低。siRNA轉(zhuǎn)染的細(xì)胞凋亡率(JC-1熒光強(qiáng)度)分別為81.8%(NUGC3細(xì)胞)和79.6%(SNU719細(xì)胞)，顯著高于空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組(P<0.01)。研究結(jié)果表明， BARF1表達(dá)下調(diào)導(dǎo)致NUGC3和SNU719細(xì)胞線粒體膜電位減小，進(jìn)而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。

5BARF1表達(dá)下調(diào)能促進(jìn)促凋亡蛋白和抑制抗凋亡蛋白的表達(dá)

與NCsiRNA轉(zhuǎn)染組細(xì)胞比較，siRNA轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中Bax、caspase 3、p21和p27的表達(dá)增高，而B(niǎo)cl-2、cIAP-2和survivin的表達(dá)降低。蛋白定量分析發(fā)現(xiàn)，NUGC3和SNU719細(xì)胞中Bax的表達(dá)量分別增加2.24倍和2.11倍，而B(niǎo)cl-2的表達(dá)量分別增加2.25倍和2.56倍。RT-PCR結(jié)果顯示，siRNA轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中Bax的mRNA表達(dá)量增加，而B(niǎo)cl-2的mRNA表達(dá)量降低，空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組細(xì)胞中Bax 和Bcl-2 mRNA的表達(dá)量無(wú)明顯變化；Bcl-2/Bax mRNA比分別為41.4%(NUGC3細(xì)胞)和32.8%(SNU719細(xì)胞)，顯著低于陰性對(duì)照組(P<0.01)。Western blot結(jié)果進(jìn)一步表明，siRNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞中Bax蛋白表達(dá)增加，而B(niǎo)cl-2蛋白表達(dá)降低，空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組細(xì)胞中Bax 和Bcl-2 蛋白表達(dá)量無(wú)明顯變化；Bcl-2/Bax 蛋白比分別為21.4%(NUGC3細(xì)胞)和34.3%(SNU719細(xì)胞)，顯著低于陰性對(duì)照組(P<0.01)，見(jiàn)圖5。

Figure 4.The effects of down-regulated BARF1 expression on mitochondrial membrane potential in the NUGC3 cells and SNU719 cells. Mean±SD.n=3.**P<0.01vsuntreated group and NCsiRNA group.

圖4BARF1表達(dá)下調(diào)對(duì)NUGC3和SNU719細(xì)胞線粒體膜電位的影響

6BARF1表達(dá)下調(diào)激活caspase通路誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞凋亡

siRNA轉(zhuǎn)染的細(xì)胞線粒體膜電位降低，細(xì)胞凋亡率顯著高于陰性對(duì)照組；當(dāng)加入z-VAD-fmk后，siRNA+z-VAD-fmk組的細(xì)胞凋亡率顯著低于siRNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞(P<0.01)，提示z-VAD-fmk能抑制由BARF1表達(dá)下調(diào)誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。以上結(jié)果表明， BARF1表達(dá)下調(diào)誘導(dǎo)的胃癌細(xì)胞凋亡具有caspase通路依賴(lài)性，見(jiàn)圖6。

7BARF1表達(dá)下調(diào)促進(jìn)細(xì)胞色素C從線粒體釋放到細(xì)胞質(zhì)中形成細(xì)胞凋亡復(fù)合體

運(yùn)用Western blot測(cè)定BARF1表達(dá)下調(diào)誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞凋亡過(guò)程中caspase 3和caspase 9的表達(dá)模式。結(jié)果如圖7所示，BARF1表達(dá)下調(diào)的NUGC3和SNU719細(xì)胞中caspase 3和caspase 9蛋白發(fā)生裂解，其裂解程度顯著高于陰性對(duì)照組。Western blot測(cè)定線粒體和細(xì)胞質(zhì)中細(xì)胞色素C的表達(dá)量，結(jié)果顯示siRNA轉(zhuǎn)染組細(xì)胞質(zhì)中的細(xì)胞色素C濃度顯著高于陰性對(duì)照組，而線粒體中的細(xì)胞色素C濃度顯著低于陰性對(duì)照組。將siRNA轉(zhuǎn)染NUGC3和SNU719細(xì)胞后，運(yùn)用caspase 9抗體免疫共沉淀caspase 9蛋白，隨后用Apaf-1抗體檢測(cè)細(xì)胞凋亡蛋白復(fù)合體，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Apaf-1抗體能與caspase 9蛋白共沉淀，且siRNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞中Apaf-1 蛋白的表達(dá)量顯著高于陰性對(duì)照，提示有細(xì)胞凋亡蛋白復(fù)合體形成。

討論

研究表明EBV編碼的BARF1基因在NPC、EBV相關(guān)胃癌細(xì)胞、B細(xì)胞淋巴瘤和鼻NK/T細(xì)胞淋巴瘤中表達(dá)，因此被視為一種癌基因[13]。BARFl能夠誘導(dǎo)原代猴腎上皮細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化和人B細(xì)胞的永生化[14]。已有研究表明分泌型BARF1蛋白能夠促進(jìn)細(xì)胞增殖，通過(guò)促進(jìn)抗凋亡蛋白Bcl-2和抑制促凋亡蛋白Bax的表達(dá)從而抑制細(xì)胞凋亡[15]。然而，BARF1蛋白抑制細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制仍不完全清楚。因此，本研究運(yùn)用siRNA沉默BARF1基因表達(dá)對(duì)EBV陽(yáng)性胃癌細(xì)胞系NUGC3和SNU719細(xì)胞凋亡的影響，探討B(tài)ARF1基因沉默誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制。

本研究結(jié)果顯示，NUGC3和SNU719細(xì)胞內(nèi)源性表達(dá)BARF1蛋白，而siRNA轉(zhuǎn)染能夠有效沉默BARF1 mRNA和蛋白的表達(dá)。但是，在細(xì)胞培養(yǎng)液中沒(méi)有檢測(cè)到分泌型BARF1的表達(dá)，其可能的原因在于用于實(shí)驗(yàn)的細(xì)胞培養(yǎng)液較少、濃縮倍數(shù)小(1 000倍)，遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于文獻(xiàn)報(bào)道[16]的濃縮倍數(shù)(6 000倍)。本研究利用臺(tái)盼藍(lán)染色發(fā)現(xiàn)，NUGC3和SNU719細(xì)胞中BARF1表達(dá)下調(diào)顯著抑制細(xì)胞存活率，與文獻(xiàn)[16]報(bào)道一致。磷脂酰絲氨酸外翻是細(xì)胞凋亡的早期事件，而caspase介導(dǎo)的PARP蛋白裂解是細(xì)胞凋亡的主要特征[17]。本研究同時(shí)利用流式細(xì)胞術(shù)和PARP蛋白裂解結(jié)果也證實(shí)，BARF1基因沉默使BARF1表達(dá)下調(diào)能夠誘導(dǎo)NUGC3和SNU719細(xì)胞凋亡。

Figure 5.The effect of BARF1 down-regulation on the expression of apoptosis-related proteins in the NUGC3 cells and SNU719 cells transfected with NCsiRNA and siRNA. A: the expression of pro-apoptotic and anti-apoptotic proteins was analyzed using human apoptosis antibody arrays; B: the mRNA expression of Bcl-2 and Bax was determined by RT-PCR; C: Western blot analysis of Bcl-2 and Bax protein expression. Mean±SD.n=3.**P<0.01vsuntreated group and NCsiRNA group.

圖5BARF1表達(dá)下調(diào)對(duì)NUGC3和SNU719細(xì)胞中細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

經(jīng)典的細(xì)胞凋亡途徑包括死亡受體通路和線粒體通路，研究證實(shí)線粒體在細(xì)胞凋亡過(guò)程中發(fā)揮著重要作用，線粒體膜電位降低是線粒體介導(dǎo)細(xì)胞凋亡的主要原因[18]。而本研究中發(fā)現(xiàn)BARF1表達(dá)下調(diào)能夠?qū)е翹UGC3和SNU719細(xì)胞線粒體膜電位顯著降低，說(shuō)明BARF1表達(dá)下調(diào)誘導(dǎo)NUGC3和SNU719細(xì)胞凋亡可能通過(guò)線粒體途徑發(fā)揮作用。bcl-2基因家族是細(xì)胞凋亡通路重要的調(diào)節(jié)子，在線粒體介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡事件中，bcl-2基因家族與線粒體協(xié)同作用促進(jìn)細(xì)胞色素C從線粒體向細(xì)胞質(zhì)釋放[19]。以往的研究表明，bcl-2基因家族中的促凋亡蛋白(Bax、Bak和Bim)和抗凋亡蛋白(Bcl-2和Bcl-xL)參與了線粒體介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡過(guò)程，而B(niǎo)cl-2/Bax比值是判斷細(xì)胞凋亡的重要依據(jù)[20]。本研究中發(fā)現(xiàn)在NUGC3和SNU719細(xì)胞中BARF1表達(dá)下調(diào)后， Bcl-2/Bax比值顯著降低，說(shuō)明BARF1表達(dá)下調(diào)能促細(xì)胞凋亡是通過(guò)抑制線粒體途徑bcl-2基因家族中抗凋亡蛋白表達(dá)、促進(jìn)促凋亡蛋白表達(dá)而發(fā)揮作用的。

Figure 6.Caspase pathway activated byBARF1 gene silencing induced apoptosis of the NUGC3 cells and SNU719 cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05vssiRNA group.

圖6BARF1基因沉默激活caspase通路誘導(dǎo)NUGC3和SNU719細(xì)胞凋亡

Figure 7.Silencing ofBARF1 expression induced the formation of apoptotic complex. IgG was added to the cell lysates as a negative control.

圖7沉默BARF1表達(dá)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡復(fù)合體的形成

本研究發(fā)現(xiàn)，caspase抑制劑z-VAD-fmk處理siRNA轉(zhuǎn)染的NUGC3和SNU719細(xì)胞，其細(xì)胞凋亡率顯著低于陰性對(duì)照組，說(shuō)明BARF1表達(dá)下調(diào)誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡具有caspase依賴(lài)關(guān)系。線粒體膜電位降低說(shuō)明線粒體膜受到損傷，線粒體中細(xì)胞色素C釋放到細(xì)胞質(zhì)中，進(jìn)而與Apaf-1和 caspase 9結(jié)合形成細(xì)胞凋亡蛋白復(fù)合體[21]。Western blot結(jié)果顯示，BARF1表達(dá)下調(diào)能夠促進(jìn)caspase 3 和caspase 9 的表達(dá)，Apaf-1抗體能夠?qū)aspase 9 共沉淀出來(lái)，說(shuō)明BARF1表達(dá)下調(diào)促進(jìn)細(xì)胞凋亡復(fù)合體的形成。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)siRNA能夠有效抑制EBV陽(yáng)性胃癌細(xì)胞系NUGC3和SNU719細(xì)胞中BARF1的表達(dá)；并首次證實(shí)BARF1表達(dá)下調(diào)通過(guò)線粒體途徑調(diào)節(jié)促凋亡蛋白Bcl-2和抗凋亡蛋白Bax的表達(dá)進(jìn)而誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞凋亡，且具有caspase通路依賴(lài)關(guān)系。但是，本研究目前僅限于體外研究，BARF1表達(dá)下調(diào)介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡和涉及相關(guān)的信號(hào)通路是否存在于機(jī)體內(nèi)有必要進(jìn)一步研究。

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(責(zé)任編輯： 陳妙玲， 羅森)