超臨界CO2萃取復(fù)方中草藥飼料添加劑及GC-MS分析

■艾君濤 曹授俊 張 浩 雷莉輝

（北京農(nóng)業(yè)職業(yè)學(xué)院，北京102442）

我國(guó)肉雞產(chǎn)品在產(chǎn)量上有很大的優(yōu)勢(shì)，但是由于藥物殘留原因，實(shí)際市場(chǎng)優(yōu)勢(shì)并不是很大。因此，提高品質(zhì)是我國(guó)的肉雞養(yǎng)殖業(yè)必經(jīng)之路，而降低抗生素等藥物使用最為有效。中草藥飼料添加劑的出現(xiàn)為這個(gè)問題的解決提供了契機(jī)，其具有提高飼料消化吸收率和畜禽抗病能力、抑制有害菌的生長(zhǎng)等功能，且無毒副作用、無抗藥性、無污染、無殘留，且多為常見藥物，價(jià)格低廉，優(yōu)于抗生素，因而成為人們研究開發(fā)的首選對(duì)象（李喆，2011；吳漢東，2013；王國(guó)強(qiáng)等，2014；彭玉麟，2001）。但是中草藥受品種、產(chǎn)地、收購(gòu)季節(jié)和貯存條件等影響，質(zhì)量波動(dòng)較大，因此，如何控制中草藥質(zhì)量是保證中草藥飼料添加劑質(zhì)量的前提。

超臨界CO2流體萃取技術(shù)是利用CO2在高壓下處于超臨界狀態(tài)而萃取分離各種有機(jī)物的一種先進(jìn)技術(shù)，具有低溫不破壞有效成分、無有機(jī)溶劑殘留、環(huán)境友好、分離效率高等優(yōu)點(diǎn)，廣泛運(yùn)用于中草藥成分的分離（孟舒獻(xiàn)，2004；吳小瓊，2014）。本文采用超臨界CO2流體萃取技術(shù)提取一種綠色增強(qiáng)肉雞免疫復(fù)方中草藥飼料添加劑中揮發(fā)性成分，并應(yīng)用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（GC-MS）技術(shù)對(duì)其化學(xué)成分進(jìn)行分析，用色譜峰面積歸一化法計(jì)算各組分相對(duì)含量，為中草藥飼料添加劑開發(fā)的質(zhì)量控制提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 設(shè)備與材料

SFT-100XW超臨界CO2流體萃取儀，附1 000 ml萃取釜（SFT公司，美國(guó)），7890A/5975C氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（Agilent公司，美國(guó)），高純CO2（99.99%），高純氦氣（99.999%）。

一種綠色增強(qiáng)肉雞免疫復(fù)方中草藥飼料添加劑（如下簡(jiǎn)稱綠色飼料添加劑），主要成分為黃芪、黨參、白術(shù)、茯苓、扁豆、神曲、山楂和麥芽原料藥組成。

1.2 方法

1.2.1 中草藥提取

稱取50 g綠色飼料添加劑，粉碎、過40目篩，置萃取釜中，分別控制超臨界二氧化碳流體溫度、壓力、流速、夾帶劑，動(dòng)態(tài)收集提取物。取0.1 g提取物，用甲醇定容至10 ml，上機(jī)檢測(cè)。

1.2.2 氣相色譜-質(zhì)譜條件

色譜柱HP-5ms（30 m×0.25 mm，0.25 μm），進(jìn)樣口溫度280℃，檢測(cè)器溫度240℃，流速1.0 ml/min，升溫程序：60℃保持3 min，5℃/min升溫至80℃，5℃/min升溫至120℃，保持10 min；3℃/min升溫至240℃，保持15 min；進(jìn)樣量1 μl，分流比10∶1。

EI離子源溫度230℃，電子能量70 eV，全掃描模式（SCAN），掃描范圍40～450 m/z。

1.2.3 樣品鑒定

取0.1 g提取物放入10 ml容量瓶中，用甲醇定容，超聲溶劑，上機(jī)，得總離子流圖。再經(jīng)Nist譜圖庫(kù)自動(dòng)檢索，人工譜圖解析，面積歸一化法對(duì)各成分含量進(jìn)行初步定量。

2 結(jié)果與分析

2.1 超臨界CO2萃取條件優(yōu)化

在經(jīng)驗(yàn)值的基礎(chǔ)上，分別對(duì)萃取壓力、萃取溫度、萃取時(shí)間進(jìn)行了優(yōu)化，隨著壓力升高，萃取效率先升高后降低，25 MPa最優(yōu)；在35℃和40℃差別不大；當(dāng)4.0 h后，萃取量沒有變化。因此選擇萃取壓力3 625 psi（25 MPa），溫度35℃，萃取時(shí)間4.0 h，得率為1.90%(見表1)。運(yùn)用此條件，添加70%乙醇作為夾帶劑，結(jié)果沒有明顯差異（P＞0.05）。

表1 不同超臨界CO2萃取條件下的萃取效果（%）

2.2 成分鑒定結(jié)果

樣品上機(jī)后得到的總離子圖(見圖1)。在譜圖庫(kù)自動(dòng)檢索基礎(chǔ)上，對(duì)色譜行為進(jìn)行分析，按各色譜峰的質(zhì)譜裂片圖與文獻(xiàn)核對(duì)，查閱有關(guān)質(zhì)譜及其他有關(guān)天然活性成分解析的文獻(xiàn)，比較基峰、質(zhì)荷比和相對(duì)豐度等，對(duì)各色譜峰加以確認(rèn)，并采用面積歸一化法確定各組分的相對(duì)百分含量，共分析出23種揮發(fā)性成分，結(jié)果見表2，其中相對(duì)含量較高的有：己醛（11.41%）、己酸甲酯（13.22%）、9-氧-壬酸甲酯（9.09%）、萘-1,2,3,4,4a,5,6,8a-八氫-4a,8-二甲基-l-2-異丙烯基-[2R-(2α.,4aα.,8aβ)]（13.73%）和壬二酸二甲酯（8.86%）等。

3 討論

中草藥飼料添加劑一般具有提高抗病能力、促進(jìn)肉雞脂肪代謝和保護(hù)肝等多種功能（于翠平，2014；劉彥慈，2011），通常都有多種中草藥組成，如該中草藥飼料添加劑就有黃芪、黨參、白術(shù)、茯苓等中草藥組成，在對(duì)每種原材料把好關(guān)的同時(shí)，找到簡(jiǎn)單有效混合物監(jiān)測(cè)方法是品質(zhì)的重要保障。超臨界CO2流體萃取和氣質(zhì)聯(lián)用結(jié)合使用為解決這個(gè)問題提供了契機(jī)，已廣泛運(yùn)用到中藥的分離、純化和品質(zhì)監(jiān)控（葉春林，2010；楊虎，2014），但在飼料添加劑應(yīng)用還較少。本研究在萃取壓力3 625 Psi(25 MPa)，溫度35℃，萃取時(shí)間4.0 h條件下，萃取、分離、鑒定出己醛、己酸甲酯、9-氧-壬酸甲酯、萘-1,2,3,4,4a,5,6,8a-八氫-4a,8-二甲基-l-2-異丙烯基-[2R-(2α.,4aα.,8aβ)]和壬二酸二甲酯等成分含量較高，在后期研究中可以通過對(duì)不同批次、產(chǎn)地、品種等進(jìn)行分析，進(jìn)一步確定其指紋圖譜，從而為其質(zhì)量控制提供依據(jù)。

圖1 綠色飼料添加劑總離子流圖

表2 綠色飼料添加劑成分及相對(duì)含量