不同來源的蛋白水解物對(duì)凡納濱對(duì)蝦生長及非特異性免疫的影響

■張婷婷 陳效儒 梁萌青 鄭珂珂 徐后國 陳齊勇

(1.中國水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所，山東青島266071；2.通威股份有限公司，四川成都610063；3.大連海洋大學(xué)，遼寧大連116021)

水產(chǎn)飼料長期以來依賴魚粉為主要優(yōu)質(zhì)蛋白源，但隨著集約化水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的擴(kuò)大與發(fā)展，魚粉的需求量急劇上升，導(dǎo)致魚粉的價(jià)格不斷攀升，單純依靠魚粉為飼料蛋白源已經(jīng)難以滿足水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展要求[1-2]。國內(nèi)外相關(guān)研究表明，蛋白水解物在酶解和加熱處理過程中能夠消除大部分植物蛋白源中抗?fàn)I養(yǎng)因子，同時(shí)蛋白水解物通過水解后脂肪含量、灰分含量很低，且富含低分子小肽和游離氨基酸，目前已經(jīng)成為解決魚粉短缺問題的一個(gè)重要途徑[3-6]。魚蛋白水解物含有豐富的生物活性肽和游離氨基酸，并且具有促進(jìn)生長、提高抗氧化性、增強(qiáng)免疫力等生理功能[7-8]，魚蛋白水解物可增強(qiáng)花鱸(Lateolabrax japonicus)的非特異性免疫[9]；豬血蛋白水解物是一種具備保健功能、經(jīng)濟(jì)效益高、游離氨基酸含量高的氨基酸營養(yǎng)液[10]，將新鮮豬血徹底水解后，產(chǎn)物是一種對(duì)機(jī)體具有免疫增強(qiáng)活性且長度不等的小肽混合物[11]；豆粕經(jīng)酶水解可去除其中大部分抗?fàn)I養(yǎng)因子、可溶性碳水化合物和粗纖維等[3]，大豆蛋白水解物可提高仔豬的生長性能、營養(yǎng)物質(zhì)消化率及免疫功能[3]；酵母水解物富含小肽、游離氨基酸、核苷酸及豐富的B族維生素[12]，飼料中添加酵母水解物可提高大菱鲆(Scophthalmus maximus)幼魚非特異性免疫能力[13]。

本研究以凡納濱對(duì)蝦(Litopenaeus vannamei)為對(duì)象，研究飼料中分別以魚蛋白水解物(Fish protein hydrolysate，F(xiàn)PH)、豬血蛋白水解物(Pig blood protein hydrolysate，PBPH)、豆粕蛋白水解物(Soybean protein hydrolysate，SPH)、酵母蛋白水解物(Yeast protein hydrolysate ，YPH)替代魚粉(Fish meal,FM)，對(duì)其生長性能、飼料利用、體組成成分及非特異性免疫的影響，為蛋白水解物在對(duì)蝦飼料中的應(yīng)用提供技術(shù)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 蛋白水解物的制備

以鱈魚排、豬血粉、豆粕粉、啤酒酵母粉為原料，參考Zheng等(2012)的方法，采用酶解技術(shù)，利用風(fēng)味蛋白酶(Flavourzyme)和堿性蛋白酶(Alcalase)聯(lián)合水解，然后冷凍干燥得到四種蛋白水解物，分別為魚蛋白水解物(Fish protein hydrolysate，F(xiàn)PH)、豬血蛋白水解物(Pig blood protein hydrolysate，PBPH)、大豆蛋白水解物(Soybean protein hydrolysate，SPH)和酵母蛋白水解物(Yeast protein hydrolysate，YPH)。置于-20 ℃冰箱，保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 實(shí)驗(yàn)飼料

實(shí)驗(yàn)以魚粉和豆粕為主要蛋白源，魚油為主要脂肪源，對(duì)照組(FM組)魚粉含量為25%，實(shí)驗(yàn)組分別以魚蛋白水解物、豬血蛋白水解物、豆粕蛋白水解物、酵母蛋白水解物替代10%的魚粉蛋白，記作FPH組、PBPH、SPH和YPH組，配置成5組等氮、等脂的配合飼料，實(shí)驗(yàn)飼料原料均粉碎過80目篩后，加工制成直徑為1.2 mm的5種等氮、等脂的配合飼料，55℃烘飼料至水分5%～10%，置于-20℃冰箱中保存?zhèn)溆茫暳吓浞胶蜖I養(yǎng)水平如表1所示，飼料氨基酸組成見表2。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及飼養(yǎng)管理

養(yǎng)殖實(shí)驗(yàn)在中國水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所鰲山衛(wèi)養(yǎng)殖基地進(jìn)行，實(shí)驗(yàn)開始前，暫養(yǎng)兩周使其適應(yīng)養(yǎng)殖環(huán)境。實(shí)驗(yàn)開始時(shí)，停食24 h，選擇大小均勻、健康且體表無病的凡納濱對(duì)蝦(2.39±0.10)g，隨機(jī)將蝦分于15個(gè)養(yǎng)殖桶(水體體積120 L)內(nèi)，每桶20尾。實(shí)驗(yàn)過程中按對(duì)蝦體重的5%～10%進(jìn)行投喂，然后根據(jù)每天各桶的攝食情況進(jìn)行適當(dāng)調(diào)整，每天投喂4次，投喂時(shí)間為7：30、12：00、16：00和21：00，各時(shí)間點(diǎn)投喂量占日總投量的比例分別為30%、20%、30%、20%。養(yǎng)殖實(shí)驗(yàn)共進(jìn)行68 d，飼養(yǎng)期間連續(xù)充氣，每日換水1次，日換水量為桶內(nèi)水量的1/3，水溫27～30℃，鹽度30左右，pH 值為7.2～7.5，溶解氧含量在7 mg/l左右，氨氮低于0.5 mg/l。

表1 飼料配方及營養(yǎng)水平(%)

1.4 樣品采集

實(shí)驗(yàn)開始前，取12尾對(duì)蝦用于體成分分析。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，停食24 h，稱重并記錄尾數(shù)，然后每桶中隨機(jī)選取5尾對(duì)蝦，保存于-20℃冰箱中，用于全蝦體成分分析；每桶再另取10尾蝦，用1 ml無菌注射器從對(duì)蝦頭胸甲后緣圍心竇入針取血，注入1.5 ml離心管中，置于4℃冰箱中靜置24 h后10 000 r/min離心，取上清液保存于-80℃冰箱中備用；采血后剝?nèi)ジ我认?，將取出的肝胰腺放?.5 ml離心管中，置于-80℃低溫冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 測定指標(biāo)

1.5.1 體成分分析

蛋白水解物、飼料和全蝦樣品在105℃烘干至恒重，通過失重法測定干物質(zhì)含量，然后進(jìn)行生化測定。粗蛋白采用凱式定氮法(凱氏定氮儀，意大利，VELP UDK142)測得；粗脂肪采用索氏提取法(索氏抽提儀，丹麥，SOXTECTM2050)測得，以石油醚作為抽提液；灰分測定先將樣品炭化至無煙，然后放入馬福爐中550℃燃燒16 h，失重法測定灰分含量；蛋白水解物、飼料中氨基酸的含量測定，樣品均經(jīng)冷凍干燥(冷凍干燥機(jī)，日本，F(xiàn)DU-1100)24 h后，采用全自動(dòng)氨基酸分析儀(日本，日立L-8900型)測得。

表2 實(shí)驗(yàn)飼料氨基酸組成(%干物質(zhì))

1.5.2 血清和肝胰臟非特異性免疫相關(guān)酶活性的測定

從-80℃超低溫冰箱中取出肝胰臟樣品，轉(zhuǎn)移到4℃冰箱中，待其解凍后備用。準(zhǔn)確稱量肝胰臟0.5 g，然后按1∶10的質(zhì)量體積比加入預(yù)冷的生理鹽水，在冰浴條件下，用勻漿器勻漿，將勻漿液在4℃下3 000 r/min離心10 min所得上清液即為粗酶液，并于24 h內(nèi)測定。血清和肝胰臟中的酸性磷酸酶(ACP)、堿性磷酸酶(AKP)、超氧化物歧化酶(SOD)、一氧化氮合酶(NOS)活性和肝臟蛋白濃度均采用南京建成生物工程研究所生產(chǎn)的試劑盒(酶標(biāo)儀，瑞士，Tecan Infinite M200)檢測，總抗氧化能力(T-AOC)、過氧化物酶(POD)和溶菌酶(LZM)活性采用南京建成生物工程研究所生產(chǎn)的試劑盒通過分光光度計(jì)檢測。

1.5.3 計(jì)算及統(tǒng)計(jì)分析方法

對(duì)蝦的存活率、增重率、特定生長率、攝食率、飼料效率、蛋白效率比、蛋白質(zhì)沉積率參考以下公式：

式中：N0、Nt——分別為初始和死亡的對(duì)蝦尾數(shù)；

W、W0、Wt——分別為每尾蝦攝食的飼料干物質(zhì)重(g)、實(shí)驗(yàn)開始時(shí)對(duì)蝦的體重(g)和實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)對(duì)蝦的體重(g)；

P、P0、Pt——分別表示飼料粗蛋白含量(干重%)、實(shí)驗(yàn)開始時(shí)蝦體粗蛋白含量(濕重%)和實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)蝦體粗蛋白含量(濕重%)；

t——養(yǎng)殖實(shí)驗(yàn)天數(shù)(d)。

各組試驗(yàn)數(shù)據(jù)，均采用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差分析(One-way ANOVA)，若差異顯著進(jìn)行鄧肯氏多重比較(Duncan's multiple range tests)，P＜0.05被認(rèn)為差異顯著，所有數(shù)據(jù)均以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤(Mean±SE)”表示。

2 結(jié)果

2.1 不同來源蛋白水解物對(duì)凡納濱對(duì)蝦生長和飼料利用的影響（見表3）

表3 不同來源蛋白水解物對(duì)凡納濱對(duì)蝦生長和飼料利用的影響(平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤)

由表3可知，各處理組實(shí)驗(yàn)魚存活率為93.33%～96.67%之間，沒有顯著性差異(P＞0.05)；FPH組和FM組的末重和特定生長率最高，兩組之間沒有顯著差異(P＞0.05)，但顯著高于PBPH組、SPH組和YPH組(P＜0.05)；FPH組和FM組的攝食率顯著低于PBPH組和SPH組(P＜0.05)，但與 YPH組無顯著性差異(P＞0.05)；飼料效率和蛋白效率比在各處理間的趨勢相同，即在FPH組與FM組顯著高于PBPH組和SPH組(P＜0.05)，但與YPH組無顯著差異 (P＞0.05)；FPH組、FM組和YPH組的蛋白質(zhì)沉積率沒有顯著性差異(P＞0.05)，但FPH組與FM組顯著高于SPH組(P＜0.05)。

2.2 不同來源蛋白水解物對(duì)凡納濱對(duì)蝦體組成的影響（見表4）

表4 不同來源蛋白水解物對(duì)凡納濱對(duì)蝦體組成的影響(平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤)(%)

由表4可知，凡納濱對(duì)蝦蝦體干物質(zhì)含量范圍在22.26%～22.83%之間，粗蛋白含量范圍在78.73%～80.74%之間，粗脂肪含量范圍在3.55%～3.77%之間，灰分含量范圍在11.63%～13.04%之間。各處理組蝦體中干物質(zhì)和灰分含量沒有顯著性差異(P＞0.05)；FPH組、FM組、YPH組和PBPH組的粗蛋白含量沒有顯著差異(P＞0.05)，但FM組顯著高于SPH組(P＜0.05)；FPH組和FM組粗脂肪含量顯著高于YPH組和SPH組(P＜0.05)，但FPH組與PBPH組無顯著差異(P＞0.05)。

2.3 不同來源蛋白水解物對(duì)凡納濱對(duì)蝦血清和肝胰臟非特異性免疫的影響（見表5）

由表5可知，在血清中，堿性磷酸酶、酸性磷酸酶和一氧化氮合酶活性FPH組顯著高于FM組(P＜0.05)，F(xiàn)PH組和YPH組顯著高于SPH組(P＜0.05)；超氧化物歧化酶和過氧化物酶活性FPH組和YPH組高于FM組，但沒有顯著性差異(P＞0.05)，F(xiàn)PH組和YPH組顯著高于SPH組(P＜0.05)；溶菌酶FPH組和YPH組高于FM組，但沒有顯著性差異(P＞0.05)，F(xiàn)PH組和YPH組顯著高于PBPH組和SPH組(P＜0.05)；總抗氧化能力FPH組顯著高于FM組(P＜0.05)，F(xiàn)PH組和YPH組顯著高于PBPH組和SPH組(P＜0.05)。在肝胰臟中，堿性磷酸酶和超氧化物歧化酶活性FPH組和YPH組高于FM組，但沒有顯著性差異(P＞0.05)，F(xiàn)PH組和YPH組顯著高于PBPH組和SPH組(P＜0.05)；酸性磷酸酶活性FPH組和YPH組高于FM組，但沒有顯著性差異(P＞0.05)，F(xiàn)PH組和YPH組顯著高于SPH組(P＜0.05)；溶菌酶活性FPH組顯著高于FM組(P＜0.05)，F(xiàn)PH組和YPH組顯著高于PBPH和SPH組(P＜0.05)；總抗氧化能力FPH組顯著高于FM組(P＜0.05)，F(xiàn)PH組和YPH組顯著高于SPH組(P＜0.05)；過氧化物酶活性FPH組和YPH組高于FM組，但沒有顯著性差異(P＞0.05)，F(xiàn)PH組和YPH組顯著高于PBPH組和SPH組(P＜0.05)。

表5 不同來源蛋白水解物對(duì)凡納濱對(duì)蝦血清和肝胰臟中免疫相關(guān)酶活性的影響(平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤)

3 討論

3.1 不同來源蛋白水解物對(duì)凡納濱對(duì)蝦生長和飼料利用的影響

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在生長方面，添加魚蛋白水解物的FPH組末期均重和特定生長率與以魚粉為唯一蛋白源的FM組無顯著性差異(P＞0.05)，添加PBPH、SPH和YPH組的末期均重和特定生長率顯著低于FM組(P＜0.05)；在飼料利用方面，添加魚蛋白水解物的FPH組和添加酵母蛋白水解物的YPH組與FM組在攝食率、飼料效率、蛋白效率比和蛋白質(zhì)沉積率方面均沒有顯著性差異(P＞0.05)。研究發(fā)現(xiàn)，相比YPH和PBPH，F(xiàn)PH更有利于金頭鯛(Sparus aurata)和歐洲鱸魚(Dicentrarchus labrax)幼魚的生長[4-5]，這與本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果是基本一致，添加魚蛋白水解物和酵母蛋白水解物組的飼料利用效果要優(yōu)于添加豬血蛋白水解物和豆粕蛋白水解物組。Gisbert等(2012)指出，酵母蛋白水解物和豬血蛋白水解物有可能替代魚蛋白水解物來制作海洋仔稚魚飼料[4]。在本實(shí)驗(yàn)中，豬血蛋白水解物、豆粕蛋白水解物的生長和飼料利用效果不如魚蛋白水解物與酵母蛋白水解物，推測影響對(duì)蝦生長和飼料利用效果的主要原因是氨基酸平衡被破壞，“水桶效應(yīng)”產(chǎn)生，導(dǎo)致生長緩慢，蛋白效率比降低，蛋白源缺乏某種或某些必需氨基酸，會(huì)產(chǎn)生對(duì)生長的抑制作用[14-16]。凡納濱幼蝦對(duì)飼料中氨基酸的的需求量分別為1.51%蘇氨酸、2.05%賴氨酸、0.89%蛋氨酸、2.16%精氨酸[17-19]；實(shí)驗(yàn)飼料氨基酸含量經(jīng)檢測，F(xiàn)PH中含1.45%蘇氨酸，PBPH中含0.64%蛋氨酸、1.99%精氨酸，SPH中含1.39%蘇氨酸、0.66%蛋氨酸、1.73%賴氨酸，YPH中含0.70%蛋氨酸、1.83%賴氨酸，其氨基酸含量均低于對(duì)蝦實(shí)際需求量。

3.2 不同來源蛋白水解物對(duì)凡納濱對(duì)蝦血清和肝胰臟非特異性免疫的影響

實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明，在血清和肝胰臟中，添加魚蛋白水解物和酵母蛋白水解物組的堿性磷酸酶、酸性磷酸酶、溶菌酶、一氧化氮合酶、過氧化氫酶、超氧化物歧化酶活性和總抗氧化能力要優(yōu)于添加豬血蛋白水解物和豆粕蛋白水解物組。研究發(fā)現(xiàn)，飼料中添加5%魚蛋白水解物替代魚粉時(shí)，中國對(duì)蝦(Penaeus chinensis)肝胰臟中堿性磷酸酶、酸性磷酸酶和溶菌酶活性顯著高于其他組(P＜0.05)[20]，飼料中添加2%酵母蛋白水解物替代魚粉時(shí)，試驗(yàn)組大菱鲆幼魚血清溶菌酶、肝臟酸性磷酸酶、一氧化氮合酶及肝臟超氧化物歧化酶活性均顯著高于對(duì)照組(P＜0.05)[13]，這與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果是基本一致的。本實(shí)驗(yàn)中魚蛋白水解物和酵母蛋白水解物在免疫相關(guān)酶活性和抗氧化能力方面效果要優(yōu)于豬血蛋白水解物和豆粕蛋白水解物，推測可能與水解過程中產(chǎn)生的活性小肽有關(guān)，其具有抗氧化性、增強(qiáng)免疫力等生理功能[7]；水解過程中產(chǎn)生的生物活性肽具有免疫增強(qiáng)和抗菌性，其對(duì)提高大西洋鱈魚(Gadus morhua)魚苗的非特異性免疫有一定作用[21,6]；YPH在一定程度上能提高對(duì)蝦的免疫能力，除了生物活性肽影響之外，核苷酸和B族維生素也具有提高機(jī)體免疫力和抗氧化能力的作用[22-24]。許丹丹等研究表明，飼料中添加核苷酸混合物可顯著提高凡納濱對(duì)蝦肝胰腺堿性磷酸酶活性[23]。周小秋指出，B族維生素可以通過提高血清溶菌酶和酸性磷酸酶活性增強(qiáng)殺菌能力[24]。本實(shí)驗(yàn)中，添加豬血蛋白水解物和豆粕蛋白水解物堿性磷酸酶、酸性磷酸酶、溶菌酶、一氧化氮合酶、過氧化氫酶、超氧化物歧化酶活性和總抗氧化能力低于添加魚蛋白水解物和酵母蛋白水解物組，推測因其生長不理想從而抑制了非特異性免疫的表達(dá)效果。研究表明，豬血水解獲得豬血多肽或游離氨基酸，豬血多肽具有抗氧化性、增強(qiáng)免疫功能活性等功能[25]。周學(xué)文發(fā)現(xiàn)酶解豬血粉可以增強(qiáng)肉雞抗病能力[26]，豆粕經(jīng)酶解獲得多肽及游離氨基酸等蛋白消化產(chǎn)物，同時(shí)大豆多肽可以增強(qiáng)水產(chǎn)動(dòng)物免疫力，具體表現(xiàn)在提高其存活率及調(diào)節(jié)動(dòng)物免疫系統(tǒng)的功能[27-28]。

4 小結(jié)

在本實(shí)驗(yàn)條件下，適量的四種不同來源蛋白水解物替代魚粉后投喂凡納濱對(duì)蝦幼體，綜合生長、飼料利用及血清和肝胰臟免疫相關(guān)酶活性的結(jié)果表明，魚蛋白水解物替代魚粉的效果最好，其次是酵母蛋白水解物、豬血蛋白水解物和豆粕蛋白水解物。