外濕對大鼠各腸段菌群的影響

外濕對大鼠各腸段菌群的影響

王菁1,劉曉燕2*，黃曉宇2

(1.北京市宣武中醫(yī)醫(yī)院,北京 100050;2.北京中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，北京 100029)

摘要：目的通過人工控制濕度，觀察大鼠空腸、回腸和結(jié)腸的大腸桿菌、乳酸桿菌和雙歧桿菌的菌落數(shù)，進(jìn)而闡述外濕對腸道的影響，為濕邪致病闡明機(jī)制。方法將SD雄性大鼠隨機(jī)分為常濕組、高濕組、低濕組，飼養(yǎng)21 d后，取空腸、回腸和結(jié)腸，分別進(jìn)行大腸桿菌、乳酸桿菌和雙歧桿菌平板計數(shù)。結(jié)果高濕組大鼠的空腸〔(4.50±0.09) logN/mL〕和結(jié)腸中大腸桿菌菌落值〔(7.30±0.38) logN/mL〕明顯升高(均為P<0.05);低濕組大鼠空腸乳酸桿菌明顯增多〔(6.09±0.13) logN/mL〕,P<0.01；低濕組空腸、回腸和結(jié)腸的雙歧桿菌均非常明顯的增多〔(5.86±0.31),(5.94±0.33) ,(7.07±0.16) logN/mL〕,均為P<0.01；高濕組結(jié)腸雙歧桿菌的菌落值較為明顯的升高〔(6.60±0.22) logN/mL〕,P<0.05。結(jié)論外濕對機(jī)體腸道內(nèi)環(huán)境有明顯的影響作用，改變了腸道菌群結(jié)構(gòu)，從而導(dǎo)致疾病的產(chǎn)生。

關(guān)鍵詞：外濕；中醫(yī)脾臟；腸道菌群；大鼠

DOI:10.13463/j.cnki.jlzyy.2015.10.023

中圖分類號：R223.1文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號：1003-5699(2015)10-1046-03

基金項(xiàng)目:國家科技支撐計劃課題(2012BAJ02B05)；國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81001482)。

作者簡介:王菁(1987-)，女，碩士，醫(yī)師，主要從事脾胃病相關(guān)機(jī)制的研究。

收稿日期:(責(zé)任編輯：趙玉芝2015-01-26)

*通信作者:劉曉燕，電話-13693318075，電子信箱-liuxy1088@sina.com

Effects of exopathic dampness on intestinal flora of rat

WANG Jing1,LIU Xiaoyan2*,HUANG Xiaoyu2

(1.Beijing Xuanwu TCM Hospital,Beijing 100050,China;

2.Preclinical Medical College of Beijing University of Chinese Medicine,Beijing 100029,China)

Abstract:ObjectiveTo obverse the number of E.coil,lactobacillus,bifidobacterium in jejunum,ileum and colon by controlling the relative humidity,and then to reveal the effect of exopathic dampness towards intestinal tract.MethodsThe mice were divided into normal temperature normal humidity environment (NNE),normal temperature high humidity environment (NHE),and normal temperature low humidity environment (NLE) group,6 mice in each group.After 21 days feed,5 cm samples were taken out from jejunum,ileum and colon respectively,and then put the three samples in 4ml normal saline.Finally test the number of E.coil,LBA and BFB in the three samples by using plate count method.ResultsThe numbers of jejunum 〔(4.50±0.09) logN/mL〕 and colon E.coil 〔(7.30±0.38) logN/mL〕 in NHE group were obviously higher than those of NNE group (P<0.05).The number of jejunum lactobacillus in NLE group was much increased,compared with that of NNE group 〔(6.09±0.13) logN/mL〕,P<0.01.The numbers of jejunum 〔(5.86±0.31) logN/mL〕,ileum 〔(5.94±0.33) logN/mL〕 and 〔(7.07±0.16) logN/mL〕 were obviously higher in NLE group than those of NNE group (P<0.01).The number of colon bifidobacterium in NLE group was higher,contrasted with that of NNE group 〔(6.60±0.22) logN/mL〕,P<0.05.ConclusionExopathic dampness impacted obviously on intestinal environment,change the structure of intestinal flora to cause disease.

Keywords:exopathic dampness;spleen of TCM;intestinal flora;mouse

濕邪有內(nèi)外之分。外濕作為外感病的致病因素，屬六淫之一，多為外傷霧露、冒雨涉水、坐臥濕地、居處潮濕、汗出貼衣、氣候潮濕等所感受的外界濕邪。濕邪是引起人體疾病的常見重要因素和發(fā)病條件之一?！端貑枴り庩枒?yīng)象大論》有云“風(fēng)勝則動，熱勝則腫，寒勝則浮，燥勝則干，濕勝則濡瀉”。外濕侵入機(jī)體易傷脾。脾胃為水谷之海，可化生精微、津液，對津液的輸布至關(guān)重要[1]，故濕邪外感，留滯體內(nèi)，常先困脾，而使脾陽不振，運(yùn)化無權(quán)，水濕停聚，發(fā)為腹瀉[2]。而現(xiàn)代研究證明[3-5]，中醫(yī)脾與腸道正常菌群之間存在著十分密切的關(guān)系，脾虛泄瀉與腸道菌群的失調(diào)密切相關(guān)。因此，本研究嘗試從腸道菌群的角度，探討外濕影響機(jī)體腸道功能的作用機(jī)制。

1材料

SD大鼠，雄性，體質(zhì)量180～200 g，由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司提供，許可證號碼:SCXK(京)2006-0009。磷酸鹽緩沖液(PBS)、結(jié)晶紫中性紅膽鹽瓊脂(VRBA)、結(jié)晶紫中性紅膽鹽-4-甲基傘形酮-β-D-葡萄糖苷瓊脂(VRBA-MUG)、生理鹽水、MRS瓊脂、莫匹羅星鋰鹽(Li-Mupirocin)、10%水合氯醛、雙蒸水。恒溫培養(yǎng)箱、冰箱、無菌操作臺、天平、三洋高壓滅菌鍋、水浴鍋、微量移液器及吸頭、移液器及移液管、無菌培養(yǎng)皿、錐形瓶、量筒、試管。

2研究方法

2.1動物分組將實(shí)驗(yàn)動物隨機(jī)分組常濕組、低濕組、高濕組，每組各6只，飼養(yǎng)于溫度(25±1) ℃，飼養(yǎng)21 d，喂普通飼料。常濕組:濕度控制在(60±5)%的人工模擬環(huán)境。低濕組：濕度控制在(30±5)%的人工模擬環(huán)境。高濕組：濕度控制在(90±5)%的人工模擬環(huán)境。

2.2取材21 d后，用10%水合氯醛，按30～40 mg/kg腹腔注射麻醉，固定，無菌操作,開腹腔取出空腸、回腸和結(jié)腸，取每段腸段上端5 cm剖開，在4 mL的生理鹽水中涮洗，取得樣品液體4 mL。

2.3細(xì)菌平板計數(shù)將樣品液體稀釋到100，10-1，10-2，10-3，10-4，10-5，10-6，10-7，選擇4個連續(xù)的適宜稀釋度,每個稀釋度接種2個無菌平皿,每皿1 mL。同時取1 mL稀釋液加入無菌平皿做空白對照，接種到大腸桿菌、乳酸桿菌和雙歧桿菌的平板培養(yǎng)，大腸桿菌的平板在(36±1) ℃培養(yǎng)18～24 h，雙歧桿菌和乳酸桿菌的平板在(36±1) ℃，厭氧培養(yǎng)(48±2) h后計數(shù)，報告每mL樣品中菌數(shù)的對數(shù)值，以Log N/mL表示。

3結(jié)果

3.1外濕對各個腸段大腸桿菌的影響通過人工控制濕度，觀察濕度對大鼠各個腸道的大腸桿菌的影響，見表1。

logN/mL

注：與常濕組比較，#P<0.05

3.2外濕對各個腸段乳酸桿菌的影響人工調(diào)控環(huán)境濕度對大鼠進(jìn)行干預(yù)，見表2。

logN/mL

注：與常濕組比較，##P<0.01

3.3外濕對各個腸段雙歧桿菌的影響調(diào)控環(huán)境濕度，觀察大鼠空腸、回腸和結(jié)腸的雙歧桿菌變化，見表3。

logN/mL

注：與常濕組比較，#P<0.05，##P<0.01

4討論

中醫(yī)學(xué)認(rèn)為，人體的生命活動會受到外界環(huán)境的影響，如《靈樞·邪客》中：“此人與天地相應(yīng)者也”，揭示了在預(yù)防疾病及診治疾病時，應(yīng)注意自然環(huán)境及陰陽、四時、氣候等諸因素對疾病的影響。無論是正常氣候還是異常氣候，都與季節(jié)、時令的變化相關(guān)，故六淫致病與季節(jié)、時令有關(guān)。如春季多為風(fēng)邪致病，夏季多暑熱病邪致病，長夏多濕邪致病，秋季多燥邪致病，冬季多寒邪致病?，F(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)[6-7]，季節(jié)氣候變化會對機(jī)體腸道免疫功能產(chǎn)生影響，在長夏季節(jié)空腸和回腸的免疫因子明顯升高。長夏多濕邪，特別是高濕環(huán)境下[8],初期大鼠的免疫自穩(wěn)狀態(tài)發(fā)生變化，免疫功能升高，隨著時間的推移，機(jī)體又通過自我的調(diào)整，逐漸恢復(fù)，免疫功能逐漸降低到正常水平。

人體不僅僅是一個人的細(xì)胞構(gòu)成的軀體，它也是一個由人的細(xì)胞和共生微生物細(xì)胞共同構(gòu)成的復(fù)雜生物體。二者相互影響，共同作用于人體的免疫、營養(yǎng)、代謝和遺傳等過程。人體自身免疫情況與腸道菌群關(guān)系極為密切。許多細(xì)菌產(chǎn)物能夠作為免疫調(diào)節(jié)劑，調(diào)節(jié)控制人體的免疫系統(tǒng)[9]。一旦體外環(huán)境發(fā)生變化，腸道中正常的微生物群落的種群、活性就會發(fā)生異?；蚨ㄎ晦D(zhuǎn)移，出現(xiàn)菌群失調(diào)，可進(jìn)一步引發(fā)宿主免疫功能出現(xiàn)改變，免疫功能紊亂或低下又會影響到菌群，也就是中醫(yī)學(xué)所謂的邪正相爭、消長進(jìn)退、病情虛實(shí)轉(zhuǎn)化的客觀過程與關(guān)系[10]。

六淫邪氣自外而來，多從肌表、口鼻侵襲人體，引起外感疾病。六淫致病初起多為表證，表證不除，由表及里，由淺入深傳變。正如《素問·繆刺論》所說：“夫邪之客于形也，必先舍于皮毛；留而不去，入舍于孫脈；留而不去，入舍于絡(luò)脈；留而不去，入舍于經(jīng)脈；內(nèi)連五臟，散于腸胃，陰陽俱感，五臟乃傷，此邪之從皮毛而入，極于五臟之次也。”六淫之濕邪來源于水的意象，與周圍環(huán)境濕度增高有關(guān)。外濕所致疾病，從皮膚肌腠而浸入，內(nèi)合脾臟，脾為濕土，濕必歸脾而害脾，阻礙脾胃運(yùn)化，津液不得運(yùn)化傳輸，停聚而生濕邪，進(jìn)而出現(xiàn)腹瀉、皮疹、胸痹心痛等癥狀[11-15]。本研究通過人工調(diào)控濕度，對大鼠生存環(huán)境進(jìn)行干預(yù)，觀察大鼠空腸、回腸和結(jié)腸不同腸段的大腸桿菌、乳酸桿菌和雙歧桿菌的數(shù)量變化，以探討外濕對腸道菌群的影響。

研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，高濕度的時候，大鼠的空腸和結(jié)腸中大腸桿菌明顯增多。大腸桿菌為條件致病菌，隨著其數(shù)量的增多，就意味著疾病發(fā)生的可能性加大。外部環(huán)境影響內(nèi)部環(huán)境，外部濕度加大使得腸道中的環(huán)境發(fā)生改變，更有利于大腸桿菌的繁殖，損害機(jī)體健康。不同濕度下，回腸中的大腸桿菌數(shù)量無明顯變化，說明外部濕度改變對回腸影響不大。低濕度時候，空腸中的乳酸桿菌菌落數(shù)明顯增多，而未在回腸、結(jié)腸這兩個腸段發(fā)現(xiàn)這種現(xiàn)象。這可能是低濕度對空腸內(nèi)部環(huán)境影響更大，更有利于乳酸桿菌的繁殖。在研究不同濕度對大鼠各個腸段中的雙歧桿菌影響的時候，發(fā)現(xiàn)低濕度對大鼠空腸、回腸以及結(jié)腸中的雙歧桿菌有明顯的影響作用，雙歧桿菌菌落數(shù)明顯增多。這說明低濕度的環(huán)境更有利于整個腸段中的雙歧桿菌的繁殖。乳酸桿菌和雙歧桿菌作為益生菌的重要菌種，它們的增多表明生物機(jī)體的腸道功能非常健康，甚至可以說明整個的機(jī)體生理功能都很正常。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果還發(fā)現(xiàn)，高濕度對結(jié)腸中雙歧桿菌的菌落數(shù)亦有影響，其數(shù)量也有較為明顯的增多。這可能是由于結(jié)腸對外界濕度改變所作出的反應(yīng)造成的，具體機(jī)制尚有待進(jìn)一步研究。

張六通等[16]研究發(fā)現(xiàn)，高濕組、高溫高濕組及低溫高濕組雙歧桿菌數(shù)均明顯低于正常對照組，但3組之間卻無明顯差異。進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)[17]發(fā)現(xiàn)，潮濕環(huán)境下，大鼠腸道雙歧桿菌、乳桿菌、腸球菌的數(shù)量都相對減少，大腸桿菌的數(shù)量卻相對增加，其認(rèn)為外濕致病不僅與潮濕氣候環(huán)境有關(guān)，同時也與潮濕環(huán)境影響病原微生物的繁殖和傳播有關(guān)。這些研究都與本研究結(jié)論相吻合，而本研究發(fā)現(xiàn)空腸對外濕影響更敏感，空腸的主要作用是消化和吸收，正好符合脾的運(yùn)化功能。朱丹溪在《金匱鉤玄·泄瀉從濕治有多法》中記載：“得此證者，或因于內(nèi)傷，或感于外邪，皆能動乎脾濕。脾病則升舉之氣下陷，濕變下注，并出大腸之道，以胃與大腸同乎陽明一經(jīng)也”?？漳c先受濕邪影響，而后濕邪下傳影響到大腸，引起腹瀉。

綜上所述，外界濕度的改變對機(jī)體腸道內(nèi)環(huán)境有明顯的影響作用，改變了腸道菌群結(jié)構(gòu)，從而導(dǎo)致疾病的產(chǎn)生。高濕度更有利于條件致病菌大腸桿菌的繁殖，不利于機(jī)體健康；低濕度更有利于益生菌乳酸桿菌和雙歧桿菌的繁殖，有益于機(jī)體健康；而機(jī)體不同腸段對外界濕度改變的反應(yīng)敏感度有所不同，空腸中3種菌的菌落數(shù)都有明顯改變，說明空腸對外界濕度改變更為敏感。

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