補中益氣丸對糖尿病大鼠胃黏膜誘導型一氧化氮合酶及環(huán)氧化酶2表達的影響

補中益氣丸對糖尿病大鼠胃黏膜誘導型一氧化氮合酶及環(huán)氧化酶2表達的影響

王寧丁1，劉曉秋2，伍軍軍1，陳嘉1，周錢糧1，陳英杰3，張永斌1*

(1.廣州中醫(yī)藥大學實驗動物中心，廣州 510405；2.廣州中醫(yī)藥大學脾胃研究所，廣州 510405；

3.廣州中醫(yī)藥大學第一臨床醫(yī)學院，廣州 510405)

摘要：目的觀察補中益氣丸對糖尿病大鼠胃黏膜誘導型一氧化氮合酶(iNOS)和環(huán)氧化酶2(COX-2)表達的影響，分析補中益氣丸胃黏膜保護的作用機制。方法腹腔注射鏈脲佐菌素(STZ)結合30%乙醇灌胃建立糖尿病大鼠胃黏膜損傷模型,第5周起開始給藥連續(xù)12周，觀察大鼠體重及血糖變化，采用RT-PCR法和western-blot檢測胃組織COX-2、iNOS的表達。結果大鼠持續(xù)消瘦且血糖居高不下,糖尿病成模率為75%。模型組COX-2mRNA、iNOSmRNA和中藥組iNOSmRNA值均大于正常組(P<0.01),而中藥組COX-2mRNA值小于模型組(P<0.05)。Western blot結果顯示，模型組COX-2蛋白表達量大于正常組(P<0.05)，中藥組COX-2與正常組差異不顯著(P>0.05)，模型組和中藥組iNOS均大于正常組(P<0.05)。結論糖尿病大鼠胃黏膜損傷嚴重,補中益氣丸能調節(jié)COX-2和iNOS的表達，阻止胃黏膜損傷和糖尿病的進一步發(fā)展。

關鍵詞：糖尿病;大鼠;胃黏膜;一氧化氮合酶;環(huán)氧化酶;補中益氣丸

DOI:10.13463/j.cnki.jlzyy.2015.03.020

中圖分類號：R587.1文獻標志碼： A

文章編號：1003-5699(2015)03-0279-04

基金項目:廣東省科技計劃資助項目(2010B060500013,2011B060300007)；國家級大學生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓練計劃項目(201310572021)。

作者簡介:王寧丁(1990-)，女，碩士研究生，主要從事人類疾病模型建立及藥效研究。

收稿日期:(責任編輯：張瑞彬2014-08-18)

*通信作者:張永斌，電話-(020)39358528，電子信箱-zyb-73@163.com

Effects of Buzhong yiqi pills on expression of iNOS and COX-2 in gastric tissue of diabetic rats

WANG Ningding1,LIU Xiaoqiu2,WU Junjun1,CHEN Jia1,ZHOU Qianliang1,CHEN Yingjie3,ZHANG Yongbin1*

(1.Laboratory Animal Research Center,Guangzhou University of Traditional Chinese Medicine,Guangzhou 510405,China;

2.Spleen and Stomach Institute,Guangzhou University of Traditional Chinese Medicine,Guangzhou 510405,China;

3.First Clinical Medical College,Guangzhou University of Traditional Chinese Medicine,Guangzhou 510405,China)

Abstract:ObjectiveTo observe the effects of Buzhong yiqi pills on the expression of iNOS and COX-2 in gastric tissue of diabetic rats,and to analyze the gastric mucosa protection mechanism of Buzhong yiqi pills.MethodsThe diabetic rat gastric mucosa damage model was established by intraperitoneal injection of streptozotocin (STZ) combined with orally administered ethanol.At the fifth week,drugs were given for 12 weeks,and body weight and blood sugar changes of rats were observed and the expressions of iNOS and COX-2 in gastric tissue were detected by RT-PCR and western blot.ResultsRats pine away in succession and their blood sugar was staying at a high level,and the success rate of diabetes model was 75%.Absorbance ratio of COX-2mRNA and iNOSmRNA in model group and TCM group were higher than that in normal group(P<0.01),COX-2mRNA absorbance ratio in TCM group is lower than that of model group (P<0.05).The result of western blot analysis showed that COX-2 protein expression levels in the model group COX-2 were higher than that in the normal group (P<0.05),but COX-2 in TCM group had no significant differences with normal group (P>0.05).iNOS in model group and TCM group were significant higher than that in normal group (P<0.05).ConclusionGastric mucosa of diabetic rats was seriously damaged,buzhong yiqi pills can regulate the expression of iNOS and COX-2,preventing development of gastric mucosal lesion and diabetes.

Keywords:diabetes;rats;gastric mucosa;nitric oxide synthase;cyclooxygenase;Buzhong yiqi pills

胃腸疾病是糖尿病的常見并發(fā)癥之一，該并發(fā)癥常影響口服降糖藥物及其他藥物的療效，以及食物代謝吸收,進而影響糖尿病的控制。鏈脲佐菌素(STZ)糖尿病大鼠普遍存在胃、小腸黏膜氧化應激和損傷[1-3],腸黏膜屏障的減弱和腸滲透性的增加將提高患1型糖尿病的風險。NOS和COX均存在結構性(cNOS和COX-1)和誘導型(iNOS和COX-2)[4-5]，NOS和COX在胃腸黏膜各層均有分布[6],通過相互協(xié)作和相互介導，催化產(chǎn)生一氧化氮(NO)和前列腺素(PGs),構成胃腸黏膜防御系統(tǒng)，在維持基本的胃黏膜血流、發(fā)展對有害刺激的充血反應及在胃黏膜的修復中起關鍵性作用[7]，但NO和PGs產(chǎn)生過多，將導致胃腸黏膜損傷[8]。補中益氣丸是益氣健脾的代表方,有諸多研究用補中益氣丸來治療胃潰瘍、糖尿病性胃輕癱、糖尿病性腹瀉等病癥,均取得了較好的療效[9-12]，實驗將對糖尿病胃黏膜損傷機制及補中益氣丸的作用進行探索。

1實驗材料

SPF級SD大鼠100只，雄性，體質量180～220 g，購于廣州中醫(yī)藥大學實驗動物中心，動物生產(chǎn)許可證號：SCXK(粵)2008-0020。補中益氣丸(九芝堂股份有限公司)，鏈脲佐菌素(STZ)、氯仿和焦炭酸二乙酯(Sigma公司)，穩(wěn)毫型血糖試紙(強生上海醫(yī)療器材公司)，CDNA試劑盒(Fermentas公司)，Trizol reagent(Invitrogen公司),引物(上海英濰捷基公司)，兔抗鼠COX-2抗體、羊抗兔IgG(武漢博士德公司)，兔抗鼠iNOS抗體(北京博奧森公司)。

2實驗方法

2.1動物造模及分組大鼠禁食不禁水12 h后腹腔注射1%STZ溶液(用0.1 mol/L,pH 4.2的檸檬酸鈉-檸檬酸緩沖配制成10 g/L的溶液)，劑量5.5 mL/kg，正常組大鼠腹腔注射0.1 mol/L檸檬酸鈉緩沖液5.5 mL/kg。注射STZ72 h后監(jiān)測隨機血糖，連續(xù)3次血糖值≥16.8 mmol/L，且有多飲、多尿，多食癥狀，入選糖尿病動物模型，造模同時每周大鼠灌胃30%乙醇1次,劑量10 mL/kg，連4周，制成糖尿病胃黏膜損傷模型。4周后，隨機分為正常組，模型組，模型+補中益氣丸組(中藥組)。實驗第5周起開始給藥，正常組及模型組等體積生理鹽水(20 mL/kg·d)灌胃,連續(xù)12周，中藥組給予補中益氣丸灌胃(3.75 g/kg·d)，連續(xù)12周。各組大鼠予自由飲食和充足飲水,上、下午各更換墊料1次，定期監(jiān)測動物體質量及血糖變化。

2.2標本提取及處理實驗第16周末,動物空腹過夜，第2天處死動物，剖腹取胃，沿胃大彎剪開并翻轉胃腔，漂洗于4 ℃生理鹽水，除去胃腸腔內容物，濾紙吸干，用4%多聚甲醛固定后石蠟包埋，制備4 μm切片作HE染色，觀察胃黏膜損傷的病理變化，剪1/3胃組織-80 ℃低溫保存，用于RT-PCR和western-blot測定。

2.3RT-PCR法測定COX-2、iNOS的mRNA水平組織RNA經(jīng)Trizol裂解進行常規(guī)的RNA提取后，按試劑盒操作，反轉錄PCR擴增，產(chǎn)物最后經(jīng)瓊脂糖電泳鑒定。選擇GAPDH為內參照，利用軟件Primer premier 5.0進行引物設計,引物由上海英濰捷基公司合成，iNOS上下游引物序列分別為:5’-CGGTCTTTTCCTATGGAGTGA-3’，5’-CTCTCCAAACCCCTCAACTG-3’，預擴增長度為125。COX-2上下游引物序列分別為：5’-GGTGTCCCTTCGCCTCTT-3’，5’-TTCCACATCGGTTGCTC

C-3’，預擴增長度為565。GAPDH上下游引物序列分別為：5’-TATCGGACGCCTGGTTAC-3’，5’-GGAAGATGGTGATGGGTTT-3’，預擴增長度為194。Quantity one軟件測定iNOS/GAPDH及COX-2/GAPDH的相對表達量。

2.4Western-blot檢測iNOS、COX-2蛋白的表達取40 mg組織剪碎后加入0.5 mL裂解液充分裂解，勻漿破碎組織，14 000 r/min，4 ℃離心10 min，取上清進行BCA蛋白定量,測定蛋白濃度后行10%SDS-PAGE凝膠電泳，樣品上樣20～30 μg，電泳100 V恒壓后轉120 V，轉移到PVDF膜300 mA電流恒流濕轉，5%脫脂奶粉室溫封閉1 h,TBST洗3次，每次5 min，加入稀釋后的兔抗鼠一抗(COX-2、iNOS,1∶2 000)，室溫孵育1 h，TBST洗3次，每次5 min，加入稀釋后的羊抗兔二抗(1∶5 000)室溫孵育40 min，化學發(fā)光自顯影，以GAPDH為內參對照，進行iNOS和COX-2蛋白的表達分析。

3結果

3.1動物造模的一般情況注射STZ后，大鼠血糖持續(xù)升高并陸續(xù)發(fā)生死亡,糖尿病成模率為75%(診斷標準:非空腹血糖≥16.8 mmol/L)，造模組動物精神倦怠，毛色枯黃，肛周污穢，體型消瘦，飲水、排尿增多，出現(xiàn)糖尿病典型的“三多一少”癥狀，且通過病理觀察發(fā)現(xiàn)模型組大鼠出現(xiàn)條索狀的胃黏膜糜爛和出血灶，胃壁逐漸變薄，變輕，見有潰瘍，胃黏膜層上皮細胞黏液變薄、缺失、細胞間隙變大、有輕度的壞死，胞漿有空泡變形成，毛細血管可見有擴張，炎細胞浸潤。大鼠血糖和體質量情況見圖1～2。

圖1　各組大鼠注射STZ后血糖變化

圖2　各組大鼠注射STZ后體重變化

3.2RT-PCR檢測胃組織iNOSmRNA、COX-2mRNA的結果瓊脂糖凝膠檢測到125 bp、565 bp和194 bp 3個條帶的產(chǎn)物,各基因片段與預期目的片段長度相符，通過凝膠成像掃描系統(tǒng)做半定量分析，結果顯示，與正常組比較，模型組COX-2mRNA、iNOSmRNA、COX-2/GAPDH和iNOS/GAPDH的值均大于正常組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，中藥組iNOSmRNA和iNOS/GAPDH的值大于正常組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)；與模型組比較，中藥組COX-2mRNA、iNOSmRNA和COX-2/GAPDH的值小于模型組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01，P<0.05)，見表1。

表1　各組大鼠胃組織iNOSmRNA、COX-2mRNA的相對表達量( n=4)

注:與正常組比較,△△P<0.01；與模型組比較，#P<0.05，##P<0.01

圖3　大鼠胃組織iNOS、COX-2的相對表達量

3.3胃組織iNOS、COX-2蛋白的Western blot檢測結果胃組織COX-2、iNOS的蛋白表達結果見圖3，COX-2/GAPDH和iNOS/GAPDH的比值作比較得出:模型組COX-2/GAPDH的比值高于正常組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，中藥組COX-2/GAPDH的比值與正常組差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，說明補中益氣丸能調節(jié)COX-2的表達；模型組和中藥組的iNOS/GAPDH的比值明顯高于正常組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

4討論

胃腸屏障是抵抗胃腸病理及相關疾病的關鍵，胃腸屏障破壞，將增加胃腸腔潛在的毒性物質如抗原、毒素、炎性分子等的吸收,促進疾病的發(fā)生發(fā)展?？崭箍蓪е耂TZ糖尿病大鼠胃黏膜黏附層胃黏膜胃腸蛋白(MUC)總量減少,引起胃黏膜損傷[13]。實驗研究表明[14],STZ糖尿病大鼠高血糖組(STZ注射后3周)iNOS的磷酸化和iNOS活性顯著降低。實驗證明STZ糖尿病鼠COX-1或COX-2沒完全損害[15-16]。MUC、NOS、COX是胃腸黏膜結構性和誘導性的防御屏障。MUC活躍在胃腸黏膜表面，是碳水化合物豐富的糖蛋白，在MUC家族中，MUC1起最主要的作用，cNOS、iNOS、COX-1、COX-2在胃腸黏膜各層均有分布，通過相互協(xié)作和相互介導保全胃黏膜的完整性。 COX與NOS之間的相互作用已獲得證實，如ATAR S等[17]發(fā)現(xiàn)，ATV的心肌保護作用，是通過激活iNOS和COX-2,iNOS是COX-2的上游信號，iNOS通過S-硝基化激活COX-2，免疫共沉淀發(fā)現(xiàn)，COX-2和iNOS共存，而不與eNOS共存。LI X等[18]發(fā)現(xiàn)磷脂酶A2、iNOS和COX-2形成多蛋白復合物導致磷脂酶A2 S-硝基化和激活。COX-2能加強iNOS誘導的磷脂酶A2的S-硝基化，而最大的PGs合成是通過iNOS、磷脂酶A2和COX-2協(xié)作的相互作用獲得。在糖尿病狀態(tài)，大鼠胃黏膜的MUC1、COX-2、iNOS均發(fā)生顯著變化，MUC1隨病程進展逐漸降低，iNOS和COX-2的變化可能主要與病程有關，表現(xiàn)為早期活性可能降低，而晚期活性可能升高。二者相互協(xié)作和相互介導的關系，持續(xù)催化產(chǎn)生大量NO和6-酮前列腺素Fla，致使黏膜變薄和出血性損傷,黏膜層MUC累積降低。上述結果表明iNOS和COX-2在糖尿病胃黏膜損傷方面起著重要作用，而補中益氣丸的胃黏膜保護作用可能這幾種蛋白之間的相互作用有關。

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