頭針結(jié)合艾灸對(duì)缺血缺氧性腦損傷幼鼠學(xué)習(xí)記憶能力及腦內(nèi)BDNF的影響

頭針結(jié)合艾灸對(duì)缺血缺氧性腦損傷幼鼠學(xué)習(xí)記憶能力及腦內(nèi)BDNF的影響

周鈺1,牛相來(lái)1,林子歆1,方麗娜1,周偉1,霍新慧2*

(1.新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院，烏魯木齊 830054；2.新疆醫(yī)科大學(xué)，烏魯木齊 830054)

摘要：目的觀察頭針結(jié)合艾灸對(duì)腦癱幼鼠學(xué)習(xí)記憶能力的作用以及對(duì)腦源性神經(jīng)生長(zhǎng)因子(BDNF)的影響。方法7日齡清潔級(jí)新生SD幼鼠7窩共40只，隨機(jī)分為假手術(shù)組(A組)、模型組(B組)、頭針組(C組)、艾灸組(D組)和頭針結(jié)合艾灸組(E組),造模成功后，采用頭針、艾灸治療2周后，對(duì)幼鼠的運(yùn)動(dòng)功能進(jìn)行評(píng)價(jià)，行為學(xué)觀察各組幼鼠Y迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果;術(shù)后18 d通過(guò)免疫組化法檢測(cè)大腦皮質(zhì)BDNF陽(yáng)性表達(dá)結(jié)果。結(jié)果假手術(shù)組Y迷宮實(shí)驗(yàn)耗時(shí)和BDNF陽(yáng)性表達(dá)結(jié)果均低于模型組；各治療組之間比較,Y迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果頭針結(jié)合艾灸組(67.71±7.60)優(yōu)于頭針組(74.73±8.06)(P=0.39<0.05)和艾灸組(81.18±10.1)(P=0.00<0.01);BDNF陽(yáng)性表達(dá)結(jié)果頭針結(jié)合艾灸組(20.46±2.03)與頭針組(18.95±1.62)相比,P=0.43<0.05。結(jié)論治療組均能改善幼鼠的學(xué)習(xí)記憶能力和提高BDNF陽(yáng)性表達(dá)結(jié)果，以頭針結(jié)合艾灸組效果最好；頭針結(jié)合艾灸治療可以提高BDNF水平的表達(dá)并發(fā)揮其生物活性，從而促進(jìn)神經(jīng)功能缺損的恢復(fù)，改善學(xué)習(xí)記憶能力。

關(guān)鍵詞：頭針；艾灸；缺血缺氧性腦損傷；BDNF；幼鼠

DOI:10.13463/j.cnki.jlzyy.2015.02.026

中圖分類號(hào)：R245.32文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號(hào)：1003-5699(2015)02-0181-03

基金項(xiàng)目:新疆烏魯木齊市科技廳資助項(xiàng)目(Y121310018)。

作者簡(jiǎn)介:周鈺(1972-)，女，碩士，副主任醫(yī)師，主要從事針灸治療腦病的研究。

收稿日期:(責(zé)任編輯：趙玉芝2014-07-08)

*通信作者:霍新慧，電話-13565908032，電子信箱-349532885@qq.com

Effect of scalp acupuncture combined moxibustion on learning and memory ability with

hypoxic-ischemic brain damage rats and brain BDNF

ZHOU Yu1,NIU Xianglai1,LIN Zixin1,FANG Lina1,ZHOU Wei1,HUO Xinhui2*

(1.The First Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University,Urumqi 830054,China;

2.Xinjiang Medical University,Urumqi 830054,China)

Abstract:ObjectiveObserved scalp acupuncture combined with moxibustion on learning and memory ability of rats with cerebral palsy as wellas for brain-derived neurotrophic factor (BDNF) impact.Methodshypoxic-ischemic brain damage in young rats were randomly divided into sham operation group (A),model group (group B),scalp acupuncture group (group C),moxibustion group (group D) and Scalp combined with moxibustion group (E),Using scalp acupuncture,moxibustion treatment after two weeks,motor function of rats to evaluate the behavior observed in young rats in each group Y maze test results;18d after by immunohistochemical assay cerebral cortex BDNF expression results.ResultsThe sham group Y maze consuming and BDNF expression results were lower than the untreated group;Comparison,Y maze test results scalp acupuncture combined with moxibustion group(67.71±7.60) than among the treatment groups scalp acupuncture group (74.73±8.06)(P=0.39<0.05) and moxibustion group (81.18±10.1)(P=0.00<0.01),BDNF expression results scalp acupuncture combined with moxibustion group (20.46±2.03)compared with scalp acupuncture group (18.95±1.62),P=0.43<0.05.ConclusionThe treatment group rats can improve learning and memory ability and increase the BDNF expression results to scalp acupuncture combined with moxibustion group best effect;Scalp therapy combined with moxibustion can increase the level of expression of BDNF and exert their biological activity,thus contributing to the recovery of neurological deficit,improve learning and memory abilities.

Keywords:scalp acupuncture;moxibustion;hypoxic-ischemic brain injury;BDNF;rat

新生兒缺氧缺血性腦損傷(hypoxic-ischemicbrain damage,HIBD)是由于出生前或出生時(shí)缺氧所造成的，患兒多留有腦癱、癲癇等神經(jīng)系統(tǒng)后遺癥[1]。目前，對(duì)于新生兒缺氧缺血性腦損傷的有效治療方法一直是國(guó)內(nèi)新生兒科學(xué)的研究熱點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)以腦源性神經(jīng)生長(zhǎng)因子(Brain-derived neurotrophic factor，BDNF)基因蛋白表達(dá)為指標(biāo)，結(jié)合幼鼠學(xué)習(xí)記憶能力的觀察，探討頭針結(jié)合艾灸治療的腦保護(hù)作用機(jī)制。

1材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組7日齡清潔級(jí)新生SD幼鼠7窩共40只，雌雄不拘,體質(zhì)量11.4～17.2 g，平均(13.9±2.5) g，動(dòng)物由新疆醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物許可證號(hào):FYXK(新2003-0001)，所有幼鼠自由攝食和飲水，生活在晝夜節(jié)律為12 h/12 h且保持一定濕度和25 ℃的空間內(nèi)。隨機(jī)分為假手術(shù)組(A組)、模型組(B組)、頭針組(C組)、艾灸組(D組)和頭針結(jié)合艾灸組(E組)各8只。BDNF蛋白免疫組化檢測(cè)試劑盒和DBA顯色劑試劑(武漢博士德生物工程有限公司)，華佗牌不銹鋼一次性毫針，規(guī)格0.30 mm×25 mm(蘇州醫(yī)療用品有限公司)。

1.2模型制備5組幼鼠在氯胺酮復(fù)合麻醉劑麻醉狀態(tài)下，在手術(shù)顯微鏡下，A組僅分離頸總動(dòng)脈不結(jié)扎，B、C、D、E 4組分離左頸總動(dòng)脈并結(jié)扎，均縫合切口。術(shù)后復(fù)蘇30 min將幼鼠放入37 ℃的恒溫密閉的缺氧箱中，以1 L/min的速度通入低氧氣體(體積濃度為8%的氧氣和92%的氮?dú)?2 h后取出，繼續(xù)保溫1 h后送回母鼠籠中自由飲食[2]。

模型成功判定方法采用Longa評(píng)分法進(jìn)行神經(jīng)行為學(xué)評(píng)定：1)無(wú)神經(jīng)損傷癥狀為0分；2)不能完全伸展手術(shù)對(duì)側(cè)前爪或后爪為1分；3)行走時(shí)，向手術(shù)對(duì)側(cè)轉(zhuǎn)圈為2分；4)行走時(shí)，向手術(shù)對(duì)側(cè)傾倒為3分；5)不能自發(fā)行走，意識(shí)喪失為4分。將得分為2～3分的幼鼠視為成功模型。

1.3實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1頭針治療頭針選穴依據(jù)《頭針國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)化方案》,選取頂顳后斜線、頂顳前斜線，根據(jù)華氏介紹的大鼠穴位圖譜[3]并模擬人體經(jīng)穴定位。頂顳后斜線:“百會(huì)”至“曲鬢”(“百會(huì)”穴在頂骨正中點(diǎn)，“曲鬢”穴為耳緣直上與耳尖水平線的交點(diǎn))；頂顳前斜線：頂顳后斜線向前平移0.1寸。直徑0.25 mm×25 mm毫針常規(guī)消毒,針體與皮膚成15°角至帽狀腱膜下。30 min/次，1次/d，期間捻轉(zhuǎn)3次，每次1 min,以200 r/min速度捻針。

1.3.2艾灸治療選穴百會(huì)、夾脊、足三里，參照標(biāo)準(zhǔn)同前。艾條溫和灸，5 min/穴，1次/d。

1.3.3頭針結(jié)合艾灸治療：上述頭針治療與艾灸治療同時(shí)進(jìn)行。

1.4行為學(xué)測(cè)試幼鼠在術(shù)后16 d進(jìn)行Y迷宮訓(xùn)練,術(shù)后17 d進(jìn)行Y迷宮試驗(yàn)測(cè)定。Y迷宮訓(xùn)練使幼鼠訓(xùn)練至各個(gè)方向都能最終到達(dá)。參數(shù)調(diào)節(jié)：電壓50～60 V,延時(shí)5 s。實(shí)驗(yàn)前先將幼鼠放入迷宮中適應(yīng)3～5 min，然后以無(wú)規(guī)則次序變換安全區(qū)。幼鼠受電擊后逃到安全區(qū)后，燈光繼續(xù)作用10～15 s。然后，以幼鼠所在支臂就作為下一次測(cè)試的起始位置進(jìn)行下一次測(cè)試。記錄幼鼠從打開燈到逃到安全區(qū)所需時(shí)間。每只檢測(cè)3次，取平均值,評(píng)定腦癱幼鼠學(xué)習(xí)記憶能力。

1.5免疫組化檢測(cè)于術(shù)后18 d分別取出各組幼鼠,10%水合氯醛腹腔麻醉，切開胸腔，心臟快速灌流生理鹽水100 mL，然后用4%多聚甲醛50 mL灌流固定。參照《大鼠腦立體定位圖譜》取前額2 mm至視交叉部位的腦片進(jìn)行脫水、浸臘、包埋、切片、烤片、烘片、脫蠟、免疫組織化學(xué)染色。BDNF陽(yáng)性反應(yīng)定位在胞膜/胞漿,呈棕黃色或棕褐色。顯微鏡下(40×10倍)對(duì)每張切片任選5個(gè)不重疊視野進(jìn)行攝像。測(cè)量每個(gè)視野內(nèi)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù),再計(jì)算該切片平均陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，多樣本計(jì)量資料進(jìn)行單因素方差分析(ANOVA-one way)，方差不齊時(shí)，用近似F檢驗(yàn)，兩兩比較采用LSD法。

2結(jié)果

2.1Y迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果各組反應(yīng)時(shí)間明顯小于B組(P<0.01),C、D、E組之間比較，C組大于E組(P=0.39<0.05)，D組也大于E組(P=0.00<0.01),說(shuō)明各治療組均能改善幼鼠的學(xué)習(xí)記憶能力，但以頭針結(jié)合艾灸組效果最好，見表1。

表1　各組幼鼠Y迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果

注：各組與B組比較，#P<0.01；C、D與E組之間比較，△P<0.05，△△P<0.01

2.2BDNF基因蛋白陽(yáng)性表達(dá)結(jié)果A組明顯小于B組(P=0.003<0.01),C、D、E組均明顯大于B組；治療組之間比較，C組小于E組(P=0.43<0.05)。

表2　各組幼鼠BDNF陽(yáng)性表達(dá)結(jié)果

注：各組與B組比較，#P<0.01；C、D與E組之間比較，△P<0.05，△△P<0.01

3討論

研究表明，針灸治療能改善缺血性腦卒中患者的神經(jīng)功能缺損程度,提高ADL和認(rèn)知能力[4]。艾葉及其生成物具有清除自由基和過(guò)氧化脂質(zhì)的作用，艾的燃燒生成物可附著在皮膚上并滲透進(jìn)去，而起到治療疾病的作用[5]。針灸治療可促進(jìn)腦電活動(dòng)和神經(jīng)遞質(zhì)分泌，改善血液供應(yīng)，改善腦細(xì)胞功能[6]。腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(BDNF)對(duì)腦損傷的影響是現(xiàn)在研究腦部疾病的一個(gè)熱點(diǎn)，廣泛分布于中樞神經(jīng)系統(tǒng)，對(duì)神經(jīng)元的存活、分化、生長(zhǎng)發(fā)育起著重要作用，并能防止神經(jīng)元受損后死亡、改善神經(jīng)元的病理狀態(tài)、促進(jìn)受損傷神經(jīng)元再生及分化等生物效應(yīng)[7]。杜繼平[8]強(qiáng)調(diào)采用調(diào)和陰陽(yáng)針刺法治療痙攣型腦癱，龍于飛[9]指出經(jīng)筋的通利與否及督脈的氣血運(yùn)行狀況與小兒腦癱的發(fā)生和發(fā)展有重要的關(guān)聯(lián)，通過(guò)理筋通督推拿法以醒神開竅可作為治療小兒腦癱的重要方法。劉振寰等[10]研究表明：神經(jīng)生長(zhǎng)因子注射能促進(jìn)腦功能的代償作用，都為針刺治療腦癱提供了理論參考。

本研究為了探索頭針結(jié)合艾灸對(duì)缺血缺氧性腦損傷幼鼠學(xué)習(xí)記憶能力及腦內(nèi)BDNF基因蛋白表達(dá)的影響，在中醫(yī)基礎(chǔ)理論的指導(dǎo)下，以頭針和艾灸作為干預(yù)手段，以缺血缺氧性腦損傷幼鼠為研究對(duì)象，對(duì)幼鼠的學(xué)習(xí)記憶能力綜合評(píng)定，對(duì)幼鼠BDNF陽(yáng)性表達(dá)結(jié)果對(duì)比分析，把中醫(yī)的整體觀念、辨證論治應(yīng)用到微觀的、具體的物質(zhì)中去，深入探討針灸治療小兒腦癱作用機(jī)理。我們的研究發(fā)現(xiàn)，頭針、艾灸療法均可有效的改善HIBD幼鼠學(xué)習(xí)記憶能力，增強(qiáng)BDNF基因蛋白的表達(dá)，但以二者的聯(lián)合治療效果更佳，這與臨床治療小兒腦癱綜合療法優(yōu)于單一療法的臨床實(shí)踐一致。此外，頭針結(jié)合艾灸治療可以提高BDNF基因蛋白水平的表達(dá)并發(fā)揮其生物活性，從而保護(hù)中樞神經(jīng)系統(tǒng)對(duì)抗自由基和抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡，促進(jìn)受損神經(jīng)細(xì)胞功能恢復(fù)，進(jìn)而促進(jìn)神經(jīng)功能缺損的恢復(fù)。這可能是頭針結(jié)合艾灸治療可以促進(jìn)HIBD幼鼠學(xué)習(xí)記憶能力改善的機(jī)理之一。

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