不同培養(yǎng)模式下奶牛乳腺上皮細(xì)胞形態(tài)及酪蛋白表達(dá)的差異

詹 康 左曉昕 貢笑笑 陳銀銀 占今舜 趙國(guó)琦（揚(yáng)州大學(xué)動(dòng)物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，揚(yáng)州225009）

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不同培養(yǎng)模式下奶牛乳腺上皮細(xì)胞形態(tài)及酪蛋白表達(dá)的差異

詹 康 左曉昕 貢笑笑 陳銀銀 占今舜 趙國(guó)琦?
（揚(yáng)州大學(xué)動(dòng)物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，揚(yáng)州225009）

摘 要：本試驗(yàn)旨在研究二維和三維培養(yǎng)模式下奶牛乳腺上皮細(xì)胞形態(tài)及酪蛋白表達(dá)的差異。利用組織塊培養(yǎng)細(xì)胞來(lái)分離奶牛乳腺上皮細(xì)胞，利用有限稀釋法克隆奶牛乳腺上皮細(xì)胞。通過(guò)顯微鏡觀察細(xì)胞在基質(zhì)膠中的形態(tài)，并用Western blot法檢測(cè)酪蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)。結(jié)果表明：1）采用組織塊培養(yǎng)細(xì)胞能夠成功分離奶牛乳腺上皮細(xì)胞，克隆得到的細(xì)胞能穩(wěn)定傳至20代。2）細(xì)胞接種12 h之后，二維培養(yǎng)的奶牛乳腺上皮細(xì)胞并沒(méi)有形成明顯的細(xì)胞簇，細(xì)胞間也沒(méi)有相互連接；三維培養(yǎng)的奶牛乳腺上皮細(xì)胞形成明顯的細(xì)胞簇，在基質(zhì)膠內(nèi)的層黏連蛋白作用下形成交織網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。培養(yǎng)2 d細(xì)胞間交織網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)逐漸消失，細(xì)胞開(kāi)始形成單個(gè)的成細(xì)胞簇，使細(xì)胞間更加緊密的相連。3）二維培養(yǎng)奶牛乳腺上皮細(xì)胞不能誘導(dǎo)表達(dá)酪蛋白，但三維培養(yǎng)細(xì)胞可誘導(dǎo)表達(dá)κ－酪蛋白。綜上所述，三維培養(yǎng)奶牛乳腺上皮細(xì)胞能夠改變細(xì)胞的形態(tài)和功能，誘導(dǎo)κ－酪蛋白的表達(dá)，三維培養(yǎng)的奶牛乳腺上皮細(xì)胞可作為奶牛的泌乳機(jī)制研究的體外模型。

關(guān)鍵詞：奶牛乳腺上皮細(xì)胞；三維培養(yǎng)；酪蛋白；體外模型

三維培養(yǎng)已經(jīng)成為研究細(xì)胞基因表達(dá)調(diào)控和細(xì)胞分化一種重要方法［1－5］。因此，三維培養(yǎng)引起國(guó)內(nèi)外研究者的關(guān)注。Wang等［6］利用精氨酸來(lái)刺激奶牛乳腺上皮細(xì)胞研究中發(fā)現(xiàn)，精氨酸水平在556 mg／L時(shí)κ－酪蛋白mRNA表達(dá)量最高。田青等［7］在利用胰島素對(duì)奶牛乳腺上皮細(xì)胞酪蛋白合成調(diào)節(jié)機(jī)理的研究中發(fā)現(xiàn)，胰島素能夠促進(jìn)奶牛乳腺上皮細(xì)胞中αS1－酪蛋白的基因表達(dá)。李文清等［8］用不同培養(yǎng)方法來(lái)研究奶牛乳腺上皮細(xì)胞中β－酪蛋白mRNA表達(dá)，胰島素樣生長(zhǎng)因子1 （IGF?1）能夠促進(jìn)β－酪蛋白mRNA的表達(dá)。但是以上試驗(yàn)進(jìn)行奶牛乳腺上皮細(xì)胞培養(yǎng)都是以二維培養(yǎng)的方式進(jìn)行，這樣會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞去分化，細(xì)胞間分子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)受阻，許多功能性基因表達(dá)受到抑制。同時(shí)，以上試驗(yàn)對(duì)酪蛋白的表達(dá)都是通過(guò)對(duì)mRNA水平檢測(cè)進(jìn)行驗(yàn)證的。在二維培養(yǎng)的模式下，酪蛋白的mRNA可能已經(jīng)降解了，最終導(dǎo)致酪蛋白mRNA不能翻譯成具有功能活性的酪蛋白。原因在于基因轉(zhuǎn)錄成mRNA之后有許多內(nèi)部的mRNA水平的調(diào)控，如mRNA的轉(zhuǎn)錄速率、mRNA運(yùn)輸、mRNA穩(wěn)定性、mRNA定位、mRNA翻譯調(diào)控。因此，通過(guò)熒光定量PCR來(lái)檢測(cè)酪蛋白的mRNA豐度顯然不能夠準(zhǔn)確反映酪蛋白真正表達(dá)量。本試驗(yàn)旨在通過(guò)三維培養(yǎng)奶牛乳腺上皮細(xì)胞誘導(dǎo)酪蛋白的表達(dá)，并在體外建立奶牛泌乳模型，為研究奶牛泌乳機(jī)制提供科學(xué)的細(xì)胞模型。

1　材料與方法

1．1 材料

1．1．1 試劑

DMEM／F12完全培養(yǎng)基：10%胎牛血清（FBS）、0．05%胰蛋白酶－乙二胺四乙酸（trypsin?EDTA）、1×胰島素－轉(zhuǎn)鐵蛋白－硒－乙醇胺（ITS）溶液均為Gibco產(chǎn)品；青霉素、鏈霉素、4 mmol／L L－谷氨酰胺溶液、氫化可的松、催乳素均為Sigma產(chǎn)品；15 ng／mL表皮生長(zhǎng)因子（EGF）為Peprotech產(chǎn)品；β－肌動(dòng)蛋白（β?actin）為Abcam產(chǎn)品（1∶1 000稀釋?zhuān)?；辣根過(guò)氧化物酶（HRP）標(biāo)記的羊抗鼠免疫球蛋白G（IgG）為Santa cruz抗體；HRP標(biāo)記的兔抗αS1－酪蛋白、αS2－酪蛋白、β－酪蛋白、κ－酪蛋白多克隆抗體均為Bioss產(chǎn)品；皮克級(jí)和飛克級(jí)ECL發(fā)光液為T(mén)hermo產(chǎn)品；EHS基質(zhì)膠和細(xì)胞回收液為BD產(chǎn)品；RIPA裂解液和50×蛋白酶抑制劑為北京普利萊基因技術(shù)有限公司產(chǎn)品；二喹啉甲酸（BCA）蛋白質(zhì)濃度測(cè)定試劑盒為碧云天產(chǎn)品。

1．1．2 培養(yǎng)液

原代細(xì)胞培養(yǎng)基：DMEM／F12培養(yǎng)基中添加10%FBS、100 U／mL青霉素、100 mg／mL鏈霉素、4 mmol／L L－谷氨酰胺溶液、15 ng／mL EGF，1 μg／mL氫化可的松，1×ITS。

細(xì)胞分化培養(yǎng)基：在原代培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上加4 mg／mL催乳素和4%的EHS基質(zhì)膠。

1．2 方法

1．2．1 奶牛乳腺上皮細(xì)胞培養(yǎng)

對(duì)無(wú)乳房炎的荷斯坦奶牛活體采集乳腺組織立即放入含有300 U／mL的青霉素和300 μg／mL鏈霉素?zé)o血清DMEM／F12培養(yǎng)基中，上下顛倒混勻，立即帶回實(shí)驗(yàn)室。用酒精消毒并撕下封口膜，把組織放入培養(yǎng)皿中，用杜氏磷酸鹽緩沖液（DPBS）清洗乳腺組織數(shù)次，剔除結(jié)締組織和脂肪組織，將組織移至新培養(yǎng)皿中，用DPBS進(jìn)行清洗乳腺組織，直至上清液清亮。再用無(wú)血清的DMEM／F12培養(yǎng)基反復(fù)清洗組織，直至培養(yǎng)基上清液清亮無(wú)雜物，并轉(zhuǎn)移到100 mL小燒杯中，并用小剪刀將組織剪成＜1 mm3的碎片，靜置1～2 min自行沉淀，棄去上清液，繼續(xù)剪碎，加無(wú)血清DMEM／F12培養(yǎng)基懸浮組織塊，再轉(zhuǎn)移至15 mL的離心管中清洗，1 000 r／min離心5 min，棄上清。如上反復(fù)清洗組織塊，直至上清液澄清。加入DMEM／F12完全培養(yǎng)基懸浮組織塊，用擴(kuò)口移液管將組織塊轉(zhuǎn)入25 cm2培養(yǎng)瓶（瓶底面積）中，放入CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。加入培養(yǎng)基量非常重要，剛開(kāi)始加入一點(diǎn)點(diǎn)濕潤(rùn)組織即可，切記不能讓組織塊飄起來(lái)。

1．2．2 奶牛乳腺上皮細(xì)胞的純化和克隆

將培養(yǎng)瓶放在倒置顯微鏡下觀察，用記號(hào)筆只圈出一個(gè)上皮細(xì)胞集落，然后用一次性細(xì)胞刮刀將其他區(qū)域的細(xì)胞全部刮掉，并用DPBS清洗培養(yǎng)瓶去除雜細(xì)胞。繼續(xù)培養(yǎng)10 d之后，用胰酶分離消化細(xì)胞，完全培養(yǎng)基終止消化，吹打并懸浮細(xì)胞，計(jì)數(shù)，使細(xì)胞密度為5個(gè)／mL。采用有限稀釋法克隆細(xì)胞，取200 μL細(xì)胞懸液加入96孔板中，培養(yǎng)1周，如果沒(méi)有集落再培養(yǎng)1周，若仍然沒(méi)有集落形成，換液再培養(yǎng)1周，這時(shí)再?zèng)]有形成集落，就不會(huì)形成集落了。

1．2．3 奶牛乳腺上皮細(xì)胞的三維培養(yǎng)

4℃過(guò)夜使EHS基質(zhì)膠慢慢解凍。在鋪膠的全過(guò)程均在冰上操作。每孔加500 μL的EHS基質(zhì)膠于6孔板內(nèi)，左右來(lái)回?cái)[動(dòng)，不要產(chǎn)生氣泡，使膠均勻鋪開(kāi)。之后，放置在37℃培養(yǎng)箱孵育20～30 min，使膠成固體。在這個(gè)過(guò)程中，分離奶牛乳腺上皮細(xì)胞，使細(xì)胞成單細(xì)胞懸液，離心沉淀細(xì)胞，并用細(xì)胞分化培養(yǎng)基懸浮細(xì)胞并計(jì)數(shù)。接種細(xì)胞密度為3×105個(gè)／mL。其中3個(gè)孔作為二維培養(yǎng)，采用原代培養(yǎng)基，每隔1 d換培養(yǎng)基。

1．2．4 蛋白質(zhì)提取

吸棄培養(yǎng)基，用預(yù)冷的PBS清洗細(xì)胞3次。每35 mm2的培養(yǎng)皿加2 mL的細(xì)胞回收液，刮掉細(xì)胞膠層轉(zhuǎn)移到預(yù)冷的50 mL離心管中，放冰上再用預(yù)冷的2～4 mL的細(xì)胞回收液沖洗皿底，在轉(zhuǎn)移到預(yù)冷的50 mL離心管中顛倒離心管幾次，放冰上1 h，直到膠全部溶解。在此過(guò)程中不停來(lái)回?fù)u動(dòng)離心管，加速膠溶解。4℃250×g離心5 min使細(xì)胞沉淀，棄上清。預(yù)冷的PBS輕輕懸浮細(xì)胞，4℃250×g離心5 min，棄上清，重復(fù)2次。RIPA裂解液和50×蛋白酶抑制劑以50∶1濃度配制成100 μL加入到1．5 mL指形管中裂解細(xì)胞30 min，每隔5 min漩渦振蕩細(xì)胞，使細(xì)胞充分釋放出蛋白質(zhì)，4℃12 000×g離心10 min，吸取上清，即為所提取的蛋白質(zhì)，用BCA法測(cè)蛋白質(zhì)濃度。

1．2．5 Western blot法檢測(cè)酪蛋白表達(dá)

用含1×蛋白酶抑制劑的RIPA裂解液裂解細(xì)胞，分別從三維和二維培養(yǎng)的細(xì)胞提取總蛋白。每個(gè)孔加入等量的蛋白質(zhì)進(jìn)行12%的十二烷基四乙酸二鈉－聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS?PAGE），然后將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)到硝酸纖維素膜上。5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，之后吐溫Tris?HCl緩沖鹽溶液（TBST）清洗1次。加入HRP標(biāo)記的兔抗αS1－酪蛋白、αS2－酪蛋白、β－酪蛋白、κ－酪蛋白多克隆抗體和β?actin一抗孵育過(guò)夜。TBST清洗6次，每次5 min。對(duì)于β?actin加入HRP標(biāo)記的羊抗鼠二抗孵育2 h，TBST清洗6次，每次5 min。ECL發(fā)光液1∶1混合拍照。

2　結(jié) 果

2．1 奶牛乳腺上皮細(xì)胞培養(yǎng)

由圖1可知，12 h內(nèi)組織塊即可貼壁，并分裂出少量的成纖維細(xì)胞。培養(yǎng)6 d成纖維細(xì)胞迅速增殖并處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，同時(shí)輻射出少量的乳腺上皮細(xì)胞。由圖2可知，培養(yǎng)8～9 d乳腺上皮細(xì)胞增殖明顯，且活力較強(qiáng)。

圖1　組織塊種植大約12 h后發(fā)生貼壁，并有少量成纖維細(xì)胞分裂Fig．1　The tissue mass started the adherence and a few fibroblast cells divided after 12 h of inoculation（40×）

2．2 奶牛乳腺上皮細(xì)胞的純化和克隆

本試驗(yàn)利用多種純化方法可獲得奶牛乳腺上皮細(xì)胞系。刮除法、相差貼壁、相差消化法等3種方法聯(lián)合使用可獲得較純的奶牛乳腺上皮細(xì)胞。乳腺組織塊剛貼壁時(shí)首先從周?chē)椛涑龅氖浅衫w維細(xì)胞，而且增殖旺盛。之后奶牛乳腺上皮細(xì)胞從組織塊周?chē)椛涑錾倭康募?xì)胞，但是成纖維細(xì)胞占絕大多數(shù)。這時(shí)可以采用刮除法把大量的成纖維細(xì)胞刮掉，然后根據(jù)成纖維細(xì)胞和奶牛乳腺上皮細(xì)胞貼壁時(shí)間和對(duì)胰酶的敏感度不同，再進(jìn)一步純化上皮細(xì)胞。經(jīng)過(guò)2次以上操作，培養(yǎng)瓶中90%是奶牛乳腺上皮細(xì)胞。由圖3可知，利用96孔板有限稀釋法克隆細(xì)胞，已成功獲得克隆的乳腺上皮細(xì)胞株。乳腺上皮細(xì)胞形態(tài)呈現(xiàn)不規(guī)則形狀，細(xì)胞與細(xì)胞之間緊密相連，呈單層“鋪石路”生長(zhǎng)?？寺〉玫降募?xì)胞能穩(wěn)定傳至20代。

圖2　培養(yǎng)8～9 d乳腺上皮細(xì)胞增殖明顯Fig．2　At 8 to 9 days of cultivation，bovine mammary epithelial cells proliferated obviously（40×）

圖3　利用96孔板有限稀釋法獲得的單克隆奶牛乳腺上皮細(xì)胞系Fig．3　Monoclonal bovine mammary epithelial cell lines obtained using limiting dilution method（40×）

2．3 二維和三維培養(yǎng)模式下奶牛乳腺上皮細(xì)胞形態(tài)

細(xì)胞接種12 h之后，二維培養(yǎng)的奶牛乳腺上皮細(xì)胞并沒(méi)有形成明顯的細(xì)胞簇，細(xì)胞間也沒(méi)有相互連接；三維培養(yǎng)的奶牛乳腺上皮細(xì)胞在基質(zhì)膠內(nèi)的層黏連蛋白作用下形成交織網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，細(xì)胞之間開(kāi)始聚集并形成細(xì)胞簇（圖4）。這有利于細(xì)胞之間相互作用打開(kāi)信號(hào)分子的轉(zhuǎn)導(dǎo)，使細(xì)胞產(chǎn)生分化培養(yǎng)。培養(yǎng)2 d開(kāi)始細(xì)胞間交織網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)逐漸消失，細(xì)胞開(kāi)始形成單個(gè)的成細(xì)胞簇，使細(xì)胞間更加緊密的相連（圖5）。進(jìn)一步培養(yǎng)細(xì)胞，細(xì)胞在基質(zhì)膠中開(kāi)始形成腺泡內(nèi)腔，細(xì)胞腔內(nèi)的細(xì)胞開(kāi)始凋亡。結(jié)果提示，通過(guò)三維培養(yǎng)的奶牛乳腺上皮細(xì)胞能夠促使細(xì)胞間緊密連接，打開(kāi)分子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，有利于細(xì)胞的分化培養(yǎng)和基因的轉(zhuǎn)錄。

圖4　三維培養(yǎng)12 h之后，奶牛乳腺上皮細(xì)胞開(kāi)始聚集并形成交織網(wǎng)狀Fig．4　Bovine mammary epithelial cells began to aggregate and form interwoven mesh after12 h of 3D cultivation（100×）

圖5　培養(yǎng)2 d開(kāi)始細(xì)胞間交織網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)逐漸消失，細(xì)胞開(kāi)始形成單個(gè)的細(xì)胞團(tuán)Fig．5　At 2 days of cultivation，the mesh began to disappear and the cells began to form single cell mass（100×）

2．4 奶牛乳腺上皮細(xì)胞酪蛋白誘導(dǎo)表達(dá)

由圖6可知，通過(guò)Western blot法檢測(cè)奶牛乳腺上皮細(xì)胞內(nèi)αS1－酪蛋白、αS2－酪蛋白、β－酪蛋白、κ－酪蛋白表達(dá)情況，在二維培養(yǎng)的模式下均不表達(dá)；在三維培養(yǎng)模式下，αS1－酪蛋白、αS2－酪蛋白、β－酪蛋白均不表達(dá)，但是能夠檢測(cè)到κ－酪蛋白的表達(dá)。以上數(shù)據(jù)提示奶牛乳腺上皮細(xì)胞κ－酪蛋白的表達(dá)必須在三維培養(yǎng)的模式下才可以實(shí)現(xiàn)。

圖6　三維培養(yǎng)奶牛乳腺上皮細(xì)胞誘導(dǎo)酪蛋白的表達(dá)Fig．6　The induced expression of casein of 3D cultured bovine mammary epithelial cells

3　討 論

3．1 奶牛乳腺上皮細(xì)胞培養(yǎng)

利用組織塊培養(yǎng)原代細(xì)胞是最簡(jiǎn)單方便的方法。由于該方法未經(jīng)任何酶的處理，因此能夠獲得活性很高且增殖旺盛的細(xì)胞，這為建立永生化細(xì)胞系奠定基礎(chǔ)。國(guó)外研究人員通過(guò)離心泌乳奶牛的乳汁來(lái)培養(yǎng)原代乳腺上皮細(xì)胞，這種方法要求采樣時(shí)必須無(wú)菌，離心過(guò)的細(xì)胞活力強(qiáng)。王秀美等［9］通過(guò)不同時(shí)間來(lái)誘導(dǎo)乳腺上皮細(xì)胞酪蛋白基因的表達(dá)，結(jié)果表明酪蛋白的表達(dá)量在培養(yǎng)5 d是最佳的。本試驗(yàn)采取組織塊細(xì)胞培養(yǎng)法，并成功獲得奶牛乳腺上皮細(xì)胞株。組織塊細(xì)胞培養(yǎng)首先確保組織不能被污染。采樣結(jié)束后，應(yīng)立即帶回實(shí)驗(yàn)室處理，并用酒精噴灑離心管周?chē)⒔M織剪碎＜1 mm3的組織塊，然后用吸管將組織塊轉(zhuǎn)移到新的培養(yǎng)瓶。在這過(guò)程先用培養(yǎng)基濕潤(rùn)移液管，否則組織塊會(huì)黏在管的內(nèi)壁，將影響試驗(yàn)的進(jìn)程。組織塊接種到培養(yǎng)瓶的數(shù)量也是非常重要，過(guò)少導(dǎo)致細(xì)胞難以匯合，過(guò)多會(huì)導(dǎo)致培養(yǎng)基營(yíng)養(yǎng)成分相對(duì)降低，最重要的是會(huì)使大量組織塊飄起。本試驗(yàn)是每隔1 cm大約1個(gè)組織塊，并取得良好的效果。組織塊接種到培養(yǎng)瓶之后，培養(yǎng)基的用量是原代細(xì)胞培養(yǎng)成功的關(guān)鍵。剛開(kāi)始培養(yǎng)基的用量控制非常少，濕潤(rùn)組織即可，千萬(wàn)不可使組織的上層表面干涸。24 h之后可以再加1 mL DMEM／F12完全培養(yǎng)基，注意不能使組織塊漂起，48 h后可再加1 mL DMEM／F12完全培養(yǎng)基。原代培養(yǎng)過(guò)程中，要每天觀察細(xì)胞的培養(yǎng)狀況，如有污染應(yīng)立即丟棄。從培養(yǎng)箱拿出培養(yǎng)瓶的時(shí)候，要小心操作，禁止晃動(dòng)培養(yǎng)瓶。因?yàn)?，只要輕微的晃動(dòng)組織塊就可能會(huì)漂起來(lái)。組織塊培養(yǎng)過(guò)程中，霉菌和白色鏈球菌是最為常見(jiàn)污染源。本試驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)，采集乳腺組織時(shí)，先要摸下奶牛的乳房區(qū)，如果發(fā)現(xiàn)硬區(qū)，很可能奶?；加须[性乳房炎。一旦采集患有乳房炎的組織，經(jīng)試驗(yàn)驗(yàn)證，培養(yǎng)2 d培養(yǎng)基表面出現(xiàn)大量的白色鏈球菌污染。如果產(chǎn)生上述污染物，根本無(wú)法清除，應(yīng)立即丟棄以免污染整個(gè)細(xì)胞室。

3．2 奶牛乳腺上皮細(xì)胞的純化和克隆

組織塊細(xì)胞培養(yǎng)法最大的缺點(diǎn)是雜細(xì)胞太多，上皮細(xì)胞與成纖維細(xì)胞夾雜生長(zhǎng)。本實(shí)驗(yàn)室采用刮除法和相差消化、相差貼壁法來(lái)純化乳腺上皮細(xì)胞［10－11］。首先用細(xì)胞刮刀將大部分成纖維細(xì)胞刮掉，用DPBS清洗以去除雜細(xì)胞。這時(shí)，在上皮細(xì)胞生長(zhǎng)距離很近的成纖維細(xì)胞用刮除法是不可行，會(huì)導(dǎo)致上皮細(xì)胞也會(huì)被刮掉。采用0．05%胰酶來(lái)消化30 s，敲打皿壁，放入培養(yǎng)箱溫育1 min。在純化的過(guò)程中，胰蛋白酶的濃度和消化時(shí)間非常重要。由于，成纖維細(xì)胞和上皮細(xì)胞對(duì)胰蛋白酶的敏感性不同，0．05%胰酶就可以輕松把成纖維細(xì)胞消化下來(lái)，而乳腺上皮細(xì)胞只有一小部分皺縮發(fā)亮，但是不會(huì)脫落，仍繼續(xù)貼壁。消化時(shí)間是本實(shí)驗(yàn)室摸索出來(lái)的最佳時(shí)間，能夠最低限度減少上皮細(xì)胞的傷害。如果在純化過(guò)程中還有雜細(xì)胞生長(zhǎng)，可采用相差貼壁法。這是由于成纖維細(xì)胞比上皮細(xì)胞貼壁快。放入培養(yǎng)箱中20 min，成纖維基本上貼壁，上皮細(xì)胞沒(méi)有貼壁或貼壁不牢，輕輕晃動(dòng)培養(yǎng)瓶將培養(yǎng)基移入另一培養(yǎng)瓶中，此時(shí)培養(yǎng)瓶基本上是乳腺上皮細(xì)胞。我們也發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)基表面也漂浮著少量的死細(xì)胞，這可能是胰酶二次消化和吹打過(guò)程造成的，只要上皮細(xì)胞貼壁之后立即吸棄死細(xì)胞，基本對(duì)細(xì)胞無(wú)影響。然而，單克隆細(xì)胞才是我們做試驗(yàn)的理想細(xì)胞。許多國(guó)外的克隆細(xì)胞采用克隆環(huán)方法，但是本試驗(yàn)未獲得成功，可能是由于技術(shù)上不夠嫻熟，有待進(jìn)一步研究。利用有限稀釋法克隆細(xì)胞，最關(guān)鍵的是避免孔與孔之間的污染。每孔里面大約1個(gè)細(xì)胞，培養(yǎng)2 d觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況，直至細(xì)胞密度達(dá)到50%即可轉(zhuǎn)入到24孔板中，進(jìn)一步擴(kuò)大培養(yǎng)。

3．3 二維和三維培養(yǎng)模式下奶牛乳腺上皮細(xì)胞形態(tài)

三維培養(yǎng)是通過(guò)基質(zhì)膠與細(xì)胞在體外進(jìn)行共培養(yǎng)，使細(xì)胞能夠在基質(zhì)膠空間下產(chǎn)生細(xì)胞遷移、生長(zhǎng)，并產(chǎn)生三維的培養(yǎng)基、細(xì)胞、基質(zhì)膠復(fù)合物。在二維和三維培養(yǎng)模式下奶牛乳腺上皮細(xì)胞最大的不同點(diǎn)在于培養(yǎng)的細(xì)胞形態(tài)不一樣。三維培養(yǎng)的細(xì)胞在基質(zhì)膠內(nèi)層黏連蛋白、鈣黏蛋白作用下相互緊密連接，形成相互聯(lián)系的交織網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。同時(shí)產(chǎn)生高密度的類(lèi)腺泡的結(jié)構(gòu)［1，5］。三維培養(yǎng)的奶牛乳腺上皮細(xì)胞在12 h之后細(xì)胞間就開(kāi)始大量聚集。這時(shí)奶牛乳腺上皮細(xì)胞的形態(tài)發(fā)生改變已經(jīng)引起細(xì)胞的基因表達(dá)［12］。這是由于基質(zhì)膠含有大量的層黏連蛋白、鈣黏蛋白、整合蛋白，這些蛋白質(zhì)通過(guò)與細(xì)胞膜受體相結(jié)合，使細(xì)胞與細(xì)胞緊密結(jié)合，細(xì)胞表面的這些受體會(huì)聚集黏連蛋白，使細(xì)胞大量聚集并形成細(xì)胞簇。國(guó)外的研究表明，三維培養(yǎng)模式下的細(xì)胞會(huì)出現(xiàn)4種不同的形態(tài)，分別是圓形、塊狀形、葡萄樣形、星形［2］。奶牛乳腺上皮細(xì)胞的形態(tài)的改變?yōu)槔业鞍追置谔峁┝霜?dú)特天然的環(huán)境。然而，二維培養(yǎng)模式下的奶牛乳腺上皮細(xì)胞形態(tài)是“鋪路石”、多角形形狀。由于，胞外缺乏基質(zhì)膠內(nèi)層黏連蛋白、鈣黏蛋白、整合蛋白的作用，細(xì)胞間不會(huì)緊密相連，從而細(xì)胞間就不會(huì)產(chǎn)生細(xì)胞分子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。然而，三維培養(yǎng)的奶牛乳腺上皮細(xì)胞能夠很好地模擬奶牛乳腺內(nèi)泌乳壞境，符合奶牛泌乳的生理特點(diǎn)。本試驗(yàn)研究表明，三維培養(yǎng)的奶牛乳腺上皮細(xì)胞在形態(tài)上接近于奶牛體內(nèi)乳腺細(xì)胞的生理特征，很好地模擬了體內(nèi)奶牛乳腺泌乳生理環(huán)境。

3．4 奶牛乳腺上皮細(xì)胞酪蛋白誘導(dǎo)表達(dá)

奶牛乳腺上皮細(xì)胞在二維培養(yǎng)模式下，最大的缺陷是細(xì)胞培養(yǎng)去分化，導(dǎo)致許多功能性的基因不能夠表達(dá)［13－14］。目前，國(guó)內(nèi)進(jìn)行奶牛乳腺上皮細(xì)胞培養(yǎng)均以二維培養(yǎng)模式進(jìn)行，同時(shí)檢測(cè)αS1－酪蛋白、αS2－酪蛋白、β－酪蛋白、κ－酪蛋白都是通過(guò)熒光定量PCR檢測(cè)mRNA水平。然而，通過(guò)檢測(cè)αS1－酪蛋白、αS2－酪蛋白、β－酪蛋白、κ－酪蛋白的mRNA水平來(lái)證明奶牛乳腺上皮細(xì)胞酪蛋白的表達(dá)量并不科學(xué)。因?yàn)?，奶牛乳腺上皮?xì)胞酪蛋白作為營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，而且是分泌型蛋白質(zhì)，就要求檢測(cè)必須做到蛋白質(zhì)水平。同時(shí)，轉(zhuǎn)錄成的酪蛋白mRNA不一定能夠翻譯成相應(yīng)的蛋白質(zhì)。這是由于基因轉(zhuǎn)錄成mRNA之后有許多內(nèi)部的mRNA水平的調(diào)控，如mRNA的轉(zhuǎn)錄速率、mR?NA運(yùn)輸、mRNA穩(wěn)定性、mRNA定位、mRNA翻譯調(diào)控。在這幾個(gè)mRNA水平的調(diào)控中，對(duì)于酪蛋白調(diào)控而言，mRNA穩(wěn)定性對(duì)酪蛋白是否能夠正常表達(dá)產(chǎn)生至關(guān)重要作用［15］。本試驗(yàn)在三維模式培養(yǎng)的奶牛乳腺上皮細(xì)胞內(nèi)αS1－酪蛋白、αS2－酪蛋白、β－酪蛋白均不表達(dá)，然而κ－酪蛋白在三維培養(yǎng)的誘導(dǎo)下能夠表達(dá)，但是表達(dá)量比較低。在二維培養(yǎng)的模式下的αS1－酪蛋白、αS2－酪蛋白、β－酪蛋白、κ－酪蛋白均不表達(dá)。這種差異可能和自身的基因結(jié)構(gòu)有關(guān)系αS1－酪蛋白、αS2－酪蛋白、β－酪蛋白基因組結(jié)構(gòu)含有較多的內(nèi)含子，這樣mRNA剪切過(guò)程中極易造成mRNA降解。雖然，分化培養(yǎng)基含有催乳素刺激奶牛乳腺上皮細(xì)胞能夠使酪蛋白的mRNA水平顯著增加，但是大部分酪蛋白的翻譯合成并不是酪蛋白的轉(zhuǎn)錄速率所控制而是酪蛋白mRNA半衰期所引起［15］。然而，κ－酪蛋白含有較少的內(nèi)含子，這為mRNA成功翻譯為κ－酪蛋白創(chuàng)造前提。同時(shí)，三維培養(yǎng)奶牛乳腺上皮細(xì)胞為酪蛋白的表達(dá)提供良好的環(huán)境。細(xì)胞表面的這些受體與胞外黏連蛋白結(jié)合，會(huì)改變細(xì)胞膜的受體結(jié)構(gòu)，將細(xì)胞膜分子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)到細(xì)胞內(nèi)，引起胞內(nèi)一系列的蛋白質(zhì)的磷酸化。在細(xì)胞間的層黏連蛋白，直接和肌動(dòng)蛋白或細(xì)胞骨架蛋白相互作用，使細(xì)胞在基質(zhì)膠內(nèi)發(fā)生移動(dòng)，促使細(xì)胞間相互傳遞分子信號(hào)［16－18］，實(shí)現(xiàn)了細(xì)胞在基質(zhì)中遷移聚集。細(xì)胞間的分子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)進(jìn)一步激活胞內(nèi)蛋白質(zhì)的磷酸化。以上數(shù)據(jù)提示，奶牛乳腺上皮細(xì)胞能夠正常表達(dá)酪蛋白與是否為三維培養(yǎng)、mRNA的穩(wěn)定性，同時(shí)還與催乳素、細(xì)胞傳代數(shù)相關(guān)。綜上所述，三維培養(yǎng)奶牛乳腺上皮細(xì)胞對(duì)κ－酪蛋白表達(dá)至關(guān)重要。

4　結(jié) 論

本試驗(yàn)利用組織塊細(xì)胞培養(yǎng)法成功分離了奶牛乳腺上皮細(xì)胞，且細(xì)胞活力較強(qiáng)，并能夠進(jìn)行繼續(xù)傳代。三維培養(yǎng)奶牛乳腺上皮細(xì)胞能夠改變細(xì)胞的形態(tài)和功能，誘導(dǎo)κ－酪蛋白的表達(dá)，三維培養(yǎng)的奶牛乳腺上皮細(xì)胞可作為奶牛的泌乳機(jī)制研究的體外模型。

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Differences of Morphology and Casein Expression of Bovine Mammary Epithelial Cells under Different Culture Models

ZHAN Kang ZUO Xiaoxin GONG Xiaoxiao CHEN Yinyin ZHAN Jinshun ZHAO Guoqi

?

（責(zé)任編輯 王智航）

（College of Animal Science and Technology，Yangzhou University，Yangzhou 225009，China）

Abstract：This research aimed to study the differences of morphology and casein expression of bovine mamma?ry epithelial cells under two?and three?dimensional culture models．Bovine mammary epithelial cells were isola?ted by tissue mass culture，and were cloned by limiting dilution mehod．Morphology was observed in matrigel using microscopy．The induced casein expression was determined by Western blot method．The results showed as follows：1）Bovine mammary epithelial cells could be successfully isolated by tissue mass culture，and the clones were passaged 20 generations stably．2）After 12 h cultivation，the two?dimensional cultured bovine mammary epithelial cells neither formed apparent clusters nor produced interconnection，however，the three?di?mensional cultured cells formed apparent clusters and produced interconnection under the action of laminin in matrigel．The bovine mammary epithelial cells in matrigel started to form network structure and produce inter?connection．After 2 d of cultivation，the network structure among cells began to disappear，and single clusters started to appear，which made the connection among cells tighter．3）The bovine mammary epithelial cells in two?dimensional culture did not express casein，but the expression of κ?casein could be induced in three?dimen?sional culture．It is concluded that the bovine mammary epithelial cells are able to change the morphology and function by three?dimensional culture，and can induce the κ?casein expression，can be used as an in vitro model for cows’lactating mechanism research．［Chinese Journal of Animal Nutrition，2015，27（7）：2241?2247］

Key words：bovine mammary epithelial cells；three?dimensional culture；casein；in vitro model

Corresponding author?，professor，E?mail：jszhaoguoqi＠hotmail．com

通信作者：?趙國(guó)琦，教授，博士生導(dǎo)師，E?mail：jszhaoguoqi＠hotmail．com

作者簡(jiǎn)介：詹 康（1988—），男，江蘇南京人，博士研究生，從事動(dòng)物分子營(yíng)養(yǎng)研究。E?mail：zhankang0305＠163．com

基金項(xiàng)目：江蘇省高校優(yōu)勢(shì)學(xué)科建設(shè)工程資助項(xiàng)目；江蘇省科技支撐項(xiàng)目（BE2013387）

收稿日期：2015－01－08

doi：10．3969／j．issn．1006?267x．2015．07．031

文章編號(hào)：1006?267X（2015）07?2241?07

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

中圖分類(lèi)號(hào)：S823