不同脂肪源飼糧育成豬肝臟轉(zhuǎn)錄組差異分析

李建平秦貴信趙志輝張巧靈王大力孫博興姜海龍?（．吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，長(zhǎng)春08；2．河南牧業(yè)經(jīng)濟(jì)學(xué)院畜牧工程系，鄭州500；．吉林大學(xué)農(nóng)業(yè)試驗(yàn)基地，長(zhǎng)春0062；．吉林大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院，長(zhǎng)春0062；）

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不同脂肪源飼糧育成豬肝臟轉(zhuǎn)錄組差異分析

李建平1，2秦貴信1趙志輝3張巧靈4王大力3孫博興3姜海龍1?
（1．吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，長(zhǎng)春130118；2．河南牧業(yè)經(jīng)濟(jì)學(xué)院畜牧工程系，鄭州450011；3．吉林大學(xué)農(nóng)業(yè)試驗(yàn)基地，長(zhǎng)春130062；4．吉林大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院，長(zhǎng)春130062；）

摘 要：本試驗(yàn)旨在肥育豬飼糧中分別添加紅花籽油和椰子油，采集育成豬肝臟組織，進(jìn)行高通量轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，找出2種處理間的差異表達(dá)基因。利用Illumina HiSeqTM2500高通量RNA?seq測(cè)序技術(shù)對(duì)2種處理育成豬肝臟進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，使用TopHat2軟件將測(cè)序得到的Reads序列與豬參考基因組（Sscrofa 10．2）序列比對(duì)，找出差異表達(dá)基因，并在Nr、GO和KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行功能注釋、富集分析和聚類分析。結(jié)果顯示：紅花籽油組和椰子油組肝臟差異表達(dá)基因共有938個(gè)，與椰子油組相比，紅花籽油組表達(dá)上調(diào)基因有479個(gè)，下調(diào)基因有459個(gè)；GO功能分類注釋到細(xì)胞組成、生物學(xué)過(guò)程和分子功能數(shù)據(jù)庫(kù)中差異表達(dá)基因數(shù)分別有773、768和729個(gè)；注釋到KEGG通路中差異表達(dá)基因數(shù)346個(gè)，顯著富集通路為酮體生成與降解通路和類萜骨架生物合成通路（P＜0．05）。

關(guān)鍵詞：紅花籽油；椰子油；轉(zhuǎn)錄組；高通量RNA測(cè)序；差異表達(dá)基因；代謝通路；肝臟；育成豬

油脂脂肪酸按飽和程度可分為飽和脂肪酸、單不飽和脂肪酸和多不飽和脂肪酸，脂肪酸鏈長(zhǎng)和飽和程度都會(huì)影響脂肪吸收代謝機(jī)制［1－2］。Sun等［3］報(bào)道，長(zhǎng)鏈飽和脂肪酸能增加動(dòng)物脂肪沉積，長(zhǎng)鏈不飽和脂肪酸能調(diào)節(jié)脂肪代謝，中鏈飽和脂肪酸則降低動(dòng)物增重效果。Vallim等［4］證實(shí)多不飽和脂肪酸能調(diào)節(jié)脂肪代謝酶、載脂蛋白、轉(zhuǎn)錄因子等關(guān)鍵基因表達(dá)，這些基因的表達(dá)水平會(huì)直接影響豬肉脂肪組織中飽和脂肪酸與不飽和脂肪酸的組成比例［5］。飼喂富含多不飽和脂肪酸飼糧動(dòng)物的體脂肪沉積量要低于飼喂富含飽和脂肪酸飼糧的動(dòng)物［6］。油脂類型能調(diào)節(jié)脂肪組織基因表達(dá)和脂肪酸組成［7］。紅花籽油含有高品質(zhì)多不飽和脂肪酸，其亞油酸含量在70%～85%，而亞油酸是過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體（PPARs）的內(nèi)源性激活劑［8－10］。椰子油飽和脂肪酸含量豐富，超過(guò)90%，其中，短、中鏈飽和脂肪酸能被動(dòng)物直接吸收進(jìn)入肝臟快速代謝［11－12］。因此，選用這2種食用油研究不同類型油脂對(duì)相關(guān)基因表達(dá)調(diào)控機(jī)制具有一定意義。隨著測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，近年來(lái)開(kāi)始使用的高通量測(cè)序技術(shù)已經(jīng)顯示出其卓越的性能。高通量測(cè)序技術(shù)針對(duì)不同品種動(dòng)物和同一品種動(dòng)物不同組織間挖掘差異表達(dá)基因和顯著富集代謝通路方面的研究較多。但從動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)角度出發(fā)，飼喂不同處理飼糧，通過(guò)高通量測(cè)序技術(shù)找出組織中差異表達(dá)基因及顯著富集代謝通路的研究未見(jiàn)報(bào)道。因此，本研究針對(duì)肥育豬飼糧中添加富含短、中鏈飽和脂肪酸的椰子油和富含亞油酸的紅花籽油，通過(guò)使用Illumina測(cè)序技術(shù)對(duì)育成豬肝臟進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序和生物信息學(xué)分析，找出肝臟中差異表達(dá)基因和顯著富集代謝通路，進(jìn)一步了解脂肪代謝相關(guān)分子機(jī)制。

1　材料與方法

1．1 試驗(yàn)材料

1．1．1 試驗(yàn)動(dòng)物及飼養(yǎng)管理

本試驗(yàn)從5窩相同日齡軍牧一號(hào)母豬中選取18頭，體重為（59．11±1．73）kg，試驗(yàn)地在吉林大學(xué)農(nóng)業(yè)試驗(yàn)基地純種豬場(chǎng)。試驗(yàn)豬隨機(jī)分成2組，每組3個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)3頭豬，每欄為1個(gè)重復(fù)。豬舍每日清糞2次（04：00和13：00）。1組飼喂添加紅花籽油的飼糧，2組飼喂添加椰子油的飼糧。每日05：00、11：00和16：00飼喂，自由飲水。預(yù)試期7 d，正試期60 d。

1．1．2 試驗(yàn)飼糧

紅花籽油購(gòu)于新疆紅花緣科技有限公司，屬于壓榨一級(jí)食用油，亞油酸含量為76．66%；椰子油購(gòu)于秦皇島金海特種食用油工業(yè)有限公司，屬于精煉級(jí)食品加工用油，飽和脂肪酸含量超過(guò)90%，其中，短、中鏈飽和脂肪酸含量接近60%。試驗(yàn)飼糧參照NRC（1998）肥育豬營(yíng)養(yǎng)需要推薦營(yíng)養(yǎng)水平進(jìn)行配制。紅花籽油和椰子油脂肪酸百分組成見(jiàn)表1。試驗(yàn)飼糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平見(jiàn)表2。

表1　紅花籽油和椰子油脂肪酸百分組成Table 1　Percentage composition of fatty acids in safflower seed oil and coconut oil　%

表2　試驗(yàn)飼糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平（風(fēng)干基礎(chǔ)）Table 2　Composition and nutrient levels of experimental diets（air?dry basis）

1．1．3 組織樣品采集

試驗(yàn)結(jié)束后一次性屠宰，采集肝臟組織，切塊，用凍存管分裝，并迅速置于液氮中，然后于－80℃冰箱中冷凍保存，以備總RNA提取。

1．2 試驗(yàn)方法

1．2．1 總RNA提取、濃度測(cè)定和質(zhì)量檢測(cè)

總RNA提取前，對(duì)操作過(guò)程中用到的所有器械進(jìn)行去RNA酶處理。肝臟組織總RNA提取采用Trizol法按產(chǎn)品說(shuō)明進(jìn)行?？俁NA濃度用Qu?bit 2．0檢測(cè)，純度用Nanodrop 2000檢測(cè)，完整性用Agilent 2100檢測(cè)。然后干冰包裝送北京百邁客生物科技有限公司進(jìn)行高通量轉(zhuǎn)錄組測(cè)序。

1．2．2 上機(jī)文庫(kù)的制備

總RNA樣品檢測(cè)合格后，進(jìn)行文庫(kù)構(gòu)建，主要流程如下：1）用帶有Oligo（dT）的磁珠富集真核生物mRNA；2）加入Fragmentation Buffer將mR?NA進(jìn)行隨機(jī)打斷；3）以mRNA為模板，用六堿基隨機(jī)引物合成第1條cDNA鏈，然后加入緩沖液、dNTPs、RNase H和DNA polymeraseⅠ合成第2條cDNA鏈，利用AMPure XP beads純化cDNA；4）純化的雙鏈cDNA再進(jìn)行末端修復(fù)、加A尾并連接測(cè)序接頭，然后用AMPure XP beads進(jìn)行片段大小選擇；5）最后通過(guò)PCR富集得到cDNA文庫(kù)。文庫(kù)構(gòu)建完成后，分別使用Qubit 2．0和Agilent 2100對(duì)文庫(kù)的濃度和插入片段大小進(jìn)行檢測(cè)，使用qPCR方法對(duì)文庫(kù)的有效濃度進(jìn)行準(zhǔn)確定量，以保證文庫(kù)質(zhì)量。

1．2．3 測(cè)序、數(shù)據(jù)處理和生物信息學(xué)分析

檢測(cè)合格的文庫(kù)在Illumina cbot上進(jìn)行簇的生成，然后用Illumina HiSeqTM2500上機(jī)測(cè)序，測(cè)序讀長(zhǎng)為PE100。利用TopHat2序列比對(duì)軟件［13］將測(cè)序Reads與豬參考基因組（Sscrofa10．2）進(jìn)行序列比對(duì)，獲得Mapped Data?；贛apped Data，進(jìn)行插入片段長(zhǎng)度檢驗(yàn)、隨機(jī)性檢驗(yàn)等測(cè)序文庫(kù)質(zhì)量評(píng)估，進(jìn)行表達(dá)量分析、可變剪接分析、新基因發(fā)掘和基因結(jié)構(gòu)優(yōu)化等。在差異表達(dá)基因檢測(cè)過(guò)程中，將差異倍數(shù)（fold change，F(xiàn)C）≥2且錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率（false discovery rate，F(xiàn)DR）＜0．01作為篩選標(biāo)準(zhǔn)。FC表示2樣品（組）間表達(dá)量的比值。FDR是通過(guò)使用公認(rèn)的Benjamini?Hochberg校正方法對(duì)差異顯著性P值進(jìn)行校正得到的。根據(jù)基因在不同樣品中的表達(dá)量進(jìn)行差異表達(dá)分析、差異表達(dá)基因功能注釋和功能富集等生物信息學(xué)分析。

1．2．4 基因表達(dá)量計(jì)算

基因表達(dá)量計(jì)算使用FPKM值法［14］，F(xiàn)PKM計(jì)算公式為：

FPKM＝cDNA Fragments／［Mapped Fragments （Millions）×Transcript Lentth（kb）］。

式中：cDNA Fragments表示比對(duì)到某一轉(zhuǎn)錄本上的片段數(shù)目，即雙端Reads數(shù)目；Mapped Fragments（Millions）表示比對(duì)到轉(zhuǎn)錄本上的片段總數(shù)，以106為單位；Transcript Length（kb）：轉(zhuǎn)錄本長(zhǎng)度，以103個(gè)堿基為單位。

2　結(jié)果與分析

2．1 紅花籽油組與椰子油組RNA?Seq轉(zhuǎn)錄組和測(cè)序基因Nr、GO、KEGG注釋結(jié)果

基因需要轉(zhuǎn)錄為RNA和翻譯為蛋白質(zhì)才能發(fā)揮其功能，因此，基因的功能實(shí)際上是基因產(chǎn)物的功能。使用BLAST［15］軟件將測(cè)序基因與Nr［16］、GO［17］、KEGG［18］數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行序列比對(duì)，獲得已知和新發(fā)掘基因的功能注釋信息。

將紅花籽油組和椰子油組所有測(cè)序基因比對(duì)到Nr數(shù)據(jù)庫(kù)中，得出序列相似性分布情況，相似性在80%以上的序列占到了91%（圖略），可以從Nr數(shù)據(jù)庫(kù)中獲得較全的測(cè)序基因蛋白質(zhì)功能注釋信息。

GO數(shù)據(jù)庫(kù)適用于各個(gè)物種，能對(duì)基因、蛋白質(zhì)進(jìn)行限定和描述。GO數(shù)據(jù)庫(kù)包括3個(gè)一級(jí)功能數(shù)據(jù)庫(kù)，分別是：細(xì)胞組分（cellular component，CC）數(shù)據(jù)庫(kù)、分子功能（molecular function，MF）數(shù)據(jù)庫(kù)和生物學(xué)過(guò)程（biological process，BP）數(shù)據(jù)庫(kù)。對(duì)紅花籽油組與椰子油組所有測(cè)序基因做GO功能分類統(tǒng)計(jì)，結(jié)果表明差異表達(dá)基因與全部基因的富集趨勢(shì)不同（圖略）。

將紅花籽油組與椰子油組所有測(cè)序基因注釋到KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)中，可注釋到KEGG通路中所有基因數(shù)7 026個(gè)，其中差異表達(dá)基因數(shù)346個(gè)（圖略）。

2．2 紅花籽油組與椰子油組差異表達(dá)基因分析結(jié)果

紅花籽油組與椰子油組差異表達(dá)基因統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，肝臟組織中差異表達(dá)的基因共有938個(gè)，其中，與椰子油組相比，紅花籽油組表達(dá)上調(diào)基因有479個(gè)，表達(dá)下調(diào)基因有459個(gè)。差異表達(dá)基因Log2FC值范圍從－6．77到8．28。

與椰子油組比較，紅花籽油組上調(diào)或下調(diào)幅度前15位基因見(jiàn)表3。由表3可知，30個(gè)基因中有14個(gè)是本次測(cè)序發(fā)掘的新基因，有6個(gè)基因只在Ensembl數(shù)據(jù)庫(kù)中能查到，沒(méi)有基因名稱，也屬于新基因。在紅花籽油組上調(diào)幅度最大前15位基因中有5個(gè)是已知基因，分別是基質(zhì)金屬蛋白酶8（MMP8）、毒蕈堿型膽堿受體M1（CHRM1）、早幼粒細(xì)胞白血病鋅指蛋白（ZBTB16）、巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶4（FUT4）、促甲狀腺激素釋放激素降解酶（TRH?DE）；下調(diào)基因中有5個(gè)是已知基因，分別是AHNAK核蛋白（AHNAK）、Toll樣受體銜接分子2（TRAM2）、接觸蛋白3（CNTN3）、膽固醇7α－羥化酶（CYP7A1）、膽固醇1α－羥化酶（CYP1A1）。

表3　紅花籽油組與椰子油組相比上調(diào)／下調(diào)幅度最大前15位基因Table 3　The top 15 of up?or down?regulated differentially expressed genes in safflower seed oil group vs．coconut oil group

續(xù)表3

2．3 紅花籽油組與椰子油組差異表達(dá)基因GO功能富集分析結(jié)果

2．3．1 紅花籽油組與椰子油組差異表達(dá)基因GO－細(xì)胞組成富集分析

所有測(cè)序基因比對(duì)到CC數(shù)據(jù)庫(kù)中差異表達(dá)基因數(shù)773個(gè)。由表4可知，紅花籽油組與椰子油組GO－細(xì)胞組成中，顯著富集在過(guò)氧化物酶體中的差異表達(dá)基因（DEG）有12個(gè)，占該細(xì)胞組成基因數(shù)（EG）的14．81%，占比對(duì)到CC數(shù)據(jù)庫(kù)所有差異表達(dá)基因數(shù)的1．55%；顯著富集在高密度脂蛋白（HDL）顆粒中的差異表達(dá)基因有6個(gè)，占該細(xì)胞組成基因數(shù)的30%，占比對(duì)到CC數(shù)據(jù)庫(kù)所有差異表達(dá)基因數(shù)的0．78%；顯著富集在質(zhì)膜外側(cè)中的差異表達(dá)基因有21個(gè)，占該細(xì)胞組成基因數(shù)的10%，占比對(duì)到CC數(shù)據(jù)庫(kù)所有差異表達(dá)基因數(shù)的2．72%。

2．3．2 紅花籽油組與椰子油組差異表達(dá)基因GO－生物學(xué)過(guò)程富集分析

所有測(cè)序基因比對(duì)到BP數(shù)據(jù)庫(kù)中差異表達(dá)基因數(shù)768個(gè)。由表4可知，紅花籽油組與椰子油組GO－生物學(xué)過(guò)程中，顯著富集在細(xì)胞內(nèi)鋅離子動(dòng)態(tài)平衡中的差異表達(dá)基因有10個(gè)，占該生物過(guò)程基因數(shù)的41．67%，占比對(duì)到BP數(shù)據(jù)庫(kù)所有差異表達(dá)基因數(shù)的1．30%；顯著富集在鋅離子細(xì)胞應(yīng)答中的差異表達(dá)基因有5個(gè)，占該生物學(xué)過(guò)程基因數(shù)的100%，占比對(duì)到BP數(shù)據(jù)庫(kù)所有差異表達(dá)基因數(shù)的0．65%；顯著富集在促紅細(xì)胞生成素細(xì)胞應(yīng)答中的差異表達(dá)基因有4個(gè)，占該生物過(guò)程基因數(shù)的100%，占比對(duì)到BP數(shù)據(jù)庫(kù)所有差異表達(dá)基因數(shù)的0．52%；顯著富集在銅離子解毒作用中的差異表達(dá)基因有4個(gè)，占該生物學(xué)過(guò)程基因數(shù)的80%，占比對(duì)到BP數(shù)據(jù)庫(kù)所有差異表達(dá)基因數(shù)的0．52%。

2．3．3 紅花籽油組與椰子油組差異表達(dá)基因GO－分子功能富集分析

所有測(cè)序基因比對(duì)到MF數(shù)據(jù)庫(kù)中差異表達(dá)基因數(shù)729個(gè)。由表4可知，紅花籽油組與椰子油組GO－分子功能中，顯著富集在3－羥丁酸脫氫酶活性中的差異表達(dá)基因有7個(gè)，占該分子功能基因數(shù)的50%，占比對(duì)到MF數(shù)據(jù)庫(kù)所有差異表達(dá)基因數(shù)的0．96%；顯著富集在細(xì)胞因子受體活性中的差異表達(dá)基因有8個(gè)，占該分子功能基因數(shù)的29．63%，占比對(duì)到MF數(shù)據(jù)庫(kù)所有差異表達(dá)基因數(shù)的1．10%；顯著富集在蛋白質(zhì)谷氨酰胺γ－谷氨酰轉(zhuǎn)移酶活性中的差異表達(dá)基因有5個(gè)，占該分子功能基因數(shù)的50%，占比對(duì)到MF數(shù)據(jù)庫(kù)所有差異表達(dá)基因數(shù)的0．69%。

表4　紅花籽油組與椰子油組差異表達(dá)基因GO富集分析結(jié)果Table 4　Enriched analysis of differentially expressed genes in safflower seed oil group and coconut oil group in gene ontology

2．4 紅花籽油組與椰子油組差異表達(dá)基因KEGG功能富集分析結(jié)果

將紅花籽油組與椰子油組所有測(cè)序基因注釋到KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)中，可注釋到差異表達(dá)基因顯著富集通路2個(gè)（P＜0．05），即酮體生成與降解通路和類萜骨架生物合成通路，見(jiàn)表5。

表5　紅花籽油組與椰子油組差異表達(dá)基因顯著富集的通路Table 5　Enriched pathways of differentially expressed genes in safflower seed oil group and coconut oil group

3　討 論

3．1 紅花籽油組與椰子油組轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析

近年來(lái)，轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)已經(jīng)應(yīng)用于各種動(dòng)物組織的差異分析，在豬的肝臟、腹部脂肪、背最長(zhǎng)肌［19］、背部脂肪［20］，以及雞［21］、牛［22］、羊［23］、小鼠［24］、大鼠［25］等各種動(dòng)物組織上都有應(yīng)用。高通量測(cè)序的準(zhǔn)確性依賴于堿基質(zhì)量值和測(cè)序獲得Reads的數(shù)量和質(zhì)量，本研究中，紅花籽油組共獲得Reads總數(shù)是37 053 302個(gè)，椰子油組Reads總數(shù)是39 127 262個(gè)，2組堿基質(zhì)量值Q30均在93．95%以上。將測(cè)序Reads與參考基因組序列進(jìn)行比對(duì)，只有比對(duì)上的序列才能用于后續(xù)分析，所以比對(duì)效率直接決定測(cè)序序列的可利用性。本研究紅花籽油組的比對(duì)效率是82．71%，椰子油組的比對(duì)效率是83．92%，符合前人的相關(guān)報(bào)道［19，26－28］，說(shuō)明所選參考基因組能滿足后續(xù)分析的要求。之后，使用BLAST軟件將測(cè)序基因分別與Nr、GO、KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行序列比對(duì)，獲得基因的全面注釋信息。

3．2 紅花籽油組與椰子油組差異基因表達(dá)分析

本研究結(jié)果顯示，紅花籽油組與椰子油組肝臟組織中差異表達(dá)基因共有938個(gè)，與椰子油組相比，紅花籽油組表達(dá)上調(diào)的基因有479個(gè)，下調(diào)的基因有459個(gè)。紅花籽油組顯著上調(diào)的前2個(gè)差異表達(dá)基因是Pig＿newGene＿6102（log2FC＝8．28）和Pig＿newGene＿8843（log2FC＝6．71），分別比對(duì)到Nr數(shù)據(jù)庫(kù)中獲得功能注釋，Pig＿newGene＿6102預(yù)測(cè)功能是載脂蛋白B100，與脂肪的轉(zhuǎn)運(yùn)密切相關(guān)。Pig＿newGene＿8843預(yù)測(cè)功能是配子發(fā)育蛋白，與脂肪代謝間的聯(lián)系尚不清楚。紅花籽油組顯著下調(diào)的第1個(gè)差異表達(dá)基因是AHNAK （log2FC＝－6．77），AHNAK的研究相對(duì)較多，已發(fā)現(xiàn)與脂肪代謝有關(guān)聯(lián)。下面主要介紹4種差異表達(dá)顯著的基因。

3．2．1 載脂蛋白B100

Pig＿newGene＿6102是本試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)的新基因，其Nr蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)功能注釋是載脂蛋白B100。載脂蛋白B100分子由4 563個(gè)氨基酸組成，分子質(zhì)量約550 ku，分子結(jié)構(gòu)現(xiàn)在還不清楚［29］，是乳糜微粒（CM）、極低密度脂蛋白（VLDL）、中間密度脂蛋白（IDL）和低密度脂蛋白（LDL）的主要蛋白質(zhì)成分，在脂蛋白代謝過(guò)程中起核心作用。載脂蛋白B100是LDL受體的配體，參與它們的組裝和分泌［30－31］。LDL由脂類為核心，外層載脂蛋白B100單一肽鏈纏繞組成，是膽固醇的主要轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白［29］。載脂蛋白B100由肝細(xì)胞分泌，其分泌受到肝臟中脂肪酸和三酰甘油的調(diào)節(jié)，比如，油酸可以增強(qiáng)載脂蛋白B100的分泌，二十二碳六稀酸（DHA）則抑制載脂蛋白B100的分泌，棕櫚酸對(duì)載脂蛋白B100分泌的影響尚不清楚［32］。本試驗(yàn)中Pig＿newGene＿6102在椰子油中的表達(dá)量為0，在紅花籽油中的表達(dá)量為10．29，與載脂蛋白B100的分泌符合。

3．2．2 T復(fù)合物蛋白1γ（T?complex protein 1 sub?unit gamma，TCP1γ）

Pig＿newGene＿5 912的Nr蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)功能注釋是T復(fù)合物蛋白1γ。T復(fù)合物蛋白1屬于熱休克蛋白60家族蛋白，是一種在真核生物胞液中唯一鑒定到的伴侶蛋白，參與多種蛋白質(zhì)的細(xì)胞內(nèi)折疊［33］。目前，熱休克蛋白70家族和90家族分子伴侶的作用已經(jīng)闡明［34－35］，但60家族分子伴侶的作用還在探索中，僅有少數(shù)報(bào)道。T復(fù)合物蛋白1γ在生長(zhǎng)的四膜蟲纖毛的生物合成中起重要作用［36－37］。在細(xì)胞骨架蛋白，如肌動(dòng)蛋白和微管蛋白的折疊和組裝過(guò)程中起關(guān)鍵作用［38－39］。T復(fù)合物蛋白1除了折疊和組裝功能外，還參與細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的遷移、復(fù)性。有研究報(bào)道，神經(jīng)細(xì)胞的軸突神經(jīng)絲遷移到目的組織需要花幾周甚至幾個(gè)月時(shí)間，T復(fù)合物蛋白1γ作為分子伴侶結(jié)合以維持軸突神經(jīng)絲的結(jié)構(gòu)不變［40］。T復(fù)合物蛋白1γ在紅花籽油組中表達(dá)量比椰子油組顯著。

3．2．3 AHNAK

AHNAK也被看作橋粒連接蛋白（desmoyok?in），二者具有同源性。AHNAK是一種巨大蛋白質(zhì)，相對(duì)分子質(zhì)量600～700 ku，包括AHNAK1和AHNAK2 2個(gè)亞型。AHNAK蛋白包括3個(gè)結(jié)構(gòu)域：中間是4 400個(gè)氨基酸的中心結(jié)構(gòu)域，側(cè)翼是251個(gè)氨基酸的N端結(jié)構(gòu)域和1 002個(gè)氨基酸的C端結(jié)構(gòu)域。中心結(jié)構(gòu)域由多個(gè)高度保守的重復(fù)單元組成，每個(gè)重復(fù)單元包括128個(gè)氨基酸殘基。而128個(gè)氨基酸重復(fù)單元又呈現(xiàn)明顯的內(nèi)部重復(fù)結(jié)構(gòu)，每個(gè)重復(fù)結(jié)構(gòu)又由7個(gè)氨基酸殘基組成［41－44］。AHNAK在多種細(xì)胞組分中被發(fā)現(xiàn)，如肌肉細(xì)胞、上皮細(xì)胞、T細(xì)胞、質(zhì)膜［43］，在細(xì)胞和生物學(xué)水平發(fā)揮重要功能，目前已知的功能包括參與細(xì)胞分化、細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、質(zhì)膜修復(fù)、胞泌作用調(diào)節(jié)、Ca2＋通道調(diào)節(jié)和血腦屏障［45－46］。近年研究報(bào)道，AHNAK敲除鼠能阻礙老鼠生長(zhǎng)和減少脂肪組織，尤其是給老鼠飼喂高脂飼糧時(shí)，AHNAK敲除鼠比正常鼠的體重和脂肪重都要低，這說(shuō)明AHNAK與脂肪代謝可能相關(guān)［41］。

3．2．4 細(xì)胞色素P450家族（cytochrome P450 family）

細(xì)胞色素P450是一類含血紅素蛋白的酶，催化多種疏水化合物的單加氧作用，廣泛分布于動(dòng)物組織、植物和微生物中，目前，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)有18 687個(gè)編碼蛋白質(zhì)的細(xì)胞色素P450基因，其中，動(dòng)物中有5 442個(gè)基因，植物中超過(guò)6 800個(gè)基因，真菌中超過(guò)4 800個(gè)基因，原生動(dòng)物中247個(gè)基因，真細(xì)菌中超過(guò)1 200個(gè)基因，古細(xì)菌中48個(gè)，病毒中1個(gè)。細(xì)胞色素P450有家族和亞家族之分，本研究中差異顯著的基因涉及到CYP1A1和CYP7A1。有關(guān)研究已經(jīng)證明，細(xì)胞色素P450酶在腎上腺皮質(zhì)和肝臟中參與類固醇和脂肪酸羥基化作用［47－49］。CYP1A1在膽固醇和脂肪酸代謝中起重要作用，有助于脂肪酸和類固醇的信號(hào)分子與血管反應(yīng)分子的生成，從而影響甘油三酯的濃度［50］。本研究中CYP1A1的表達(dá)與Trapnell等［26］的報(bào)道一致。CYP7A1是肝臟特異性表達(dá)基因，編碼膽固醇7－α－羥化酶。7－α－羥化酶是膽汁酸生物合成途徑中催化第一步反應(yīng)的限速酶，通過(guò)把多余膽固醇轉(zhuǎn)化成膽汁酸，來(lái)維持膽固醇水平在體內(nèi)環(huán)境中的穩(wěn)定［51－53］。CYP7A1活性的變化會(huì)影響血漿膽固醇濃度和肝臟膽汁酸合成量。提高CYP7A1活性能使肝細(xì)胞內(nèi)膽固醇排空，膽汁酸合成增強(qiáng)，血漿膽固醇濃度下降；反之，降低CYP7A1活性則會(huì)使肝臟內(nèi)膽固醇積累，膽汁酸合成減少，血漿膽固醇濃度升高［54］。如人體內(nèi)CYP7A1基因突變導(dǎo)致膽固醇7－α－羥化酶活性缺失，會(huì)引起血漿低密度脂蛋白膽固醇濃度提高，膽固醇在肝臟中實(shí)質(zhì)性積累，膽汁酸分泌顯著下降［55］。本研究椰子油組中CYP7A1和CYP1A1表達(dá)量都高于紅花籽油組。

3．3 紅花籽油組與椰子油組差異表達(dá)基因GO和KEGG功能富集分析

3．3．1 差異表達(dá)基因GO功能富集分析

GO富集分析顯示，紅花籽油組與椰子油組差異表達(dá)基因比對(duì)到GO－細(xì)胞組成數(shù)據(jù)庫(kù)中，差異表達(dá)基因顯著富集在過(guò)氧化物酶體、HDL顆粒和質(zhì)膜外側(cè)。過(guò)氧化物酶體又叫微體，是一種細(xì)胞器，普遍存在于真核生物各類細(xì)胞中，在肝細(xì)胞和腎細(xì)胞中更多。過(guò)氧化物酶體含有40多種酶類，主要是氧化酶、過(guò)氧化物酶和過(guò)氧化氫酶，功能是催化脂肪酸的β氧化，將極長(zhǎng)鏈脂肪酸或支鏈脂肪酸分解代謝，動(dòng)物組織中有25%～50%的脂肪酸是在過(guò)氧化物酶體中氧化的，其他則是在線粒體中氧化。過(guò)氧化物酶體的標(biāo)志酶是過(guò)氧化氫酶，它的作用主要是將過(guò)氧化氫水解。過(guò)氧化氫是氧化酶催化的氧化還原反應(yīng)中產(chǎn)生的細(xì)胞毒性物質(zhì)，氧化酶和過(guò)氧化氫酶都存在于過(guò)氧化物酶體中，從而對(duì)細(xì)胞起保護(hù)作用。紅花籽油富含亞油酸，亞油酸是PPARs的激活劑，所以飼糧中添加紅花籽油能使過(guò)氧化物酶體中基因的表達(dá)差異顯著。HDL是血液中密度最高、顆粒最小的一種脂蛋白，主要在肝臟合成，由載脂蛋白、磷脂、膽固醇和少量脂肪酸組成。血液中多余的血脂是靠HDL來(lái)代謝的。HDL的主要功能是清除血液和細(xì)胞中過(guò)多的膽固醇和LDL，將沉積在血管壁的膽固醇、血小板顆粒剝離下來(lái)帶回肝臟，轉(zhuǎn)化為膽酸，最后變成膽汁，經(jīng)膽道－腸道排出體外。HDL能增強(qiáng)血脂代謝能力，保持血管暢通，使血管更清潔，且對(duì)血管沒(méi)有任何損傷，故HDL被美其名為“血管壁清潔工”。質(zhì)膜是指包圍在細(xì)胞表面的一層極薄的膜，主要由膜脂和膜蛋白組成，另外還有少量糖，主要以糖脂和糖蛋白的形式存在。質(zhì)膜外側(cè)常有膜糖類組分延伸與胞外蛋白形成糖－蛋白質(zhì)復(fù)合物，這種復(fù)合物與大多數(shù)細(xì)胞的表面行為有關(guān)，在接受外界信息以及細(xì)胞間相互識(shí)別方面具有重要作用［56］。在GO－生物學(xué)過(guò)程數(shù)據(jù)庫(kù)中顯著富集在細(xì)胞內(nèi)鋅離子動(dòng)態(tài)平衡、鋅離子細(xì)胞應(yīng)答、促紅細(xì)胞生成素細(xì)胞應(yīng)答和銅離子解毒作用。鋅是許多酶的必需成分，如核醣核酸聚合酶、醇脫氫酶、碳酸酐酶和堿性磷酸酯酶等，鋅缺乏會(huì)導(dǎo)致食欲下降，生長(zhǎng)遲緩，免疫異常等，鋅補(bǔ)充過(guò)量則會(huì)降低HDL的水平，因此，細(xì)胞內(nèi)鋅離子必須保持動(dòng)態(tài)平衡。銅離子也是許多酶的重要成分，如細(xì)胞色素c氧化酶、超氧化物歧化酶和尿酸酶等，研究已經(jīng)證明，飼糧中鋅銅比率與心血管疾病有關(guān)聯(lián)［57］。促紅細(xì)胞生成素是一種糖蛋白促細(xì)胞分裂劑和細(xì)胞因子，能特異地調(diào)節(jié)紅細(xì)胞先祖細(xì)胞的分化及增殖，刺激紅細(xì)胞的生成。在GO－分子功能數(shù)據(jù)庫(kù)中顯著富集在3－羥丁酸脫氫酶活性、細(xì)胞因子受體活性和蛋白質(zhì)谷氨酰胺γ－谷氨酰轉(zhuǎn)移酶活性。3－羥丁酸脫氫酶是一種以煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD＋）或煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADP＋）為受體、作用于供體CH?OH基團(tuán)上的氧化還原酶，主要參與酮體合成與降解以及丁酸的代謝過(guò)程。細(xì)胞因子是由多種細(xì)胞產(chǎn)生的，具有廣泛調(diào)節(jié)細(xì)胞功能作用的多肽分子。細(xì)胞因子通過(guò)結(jié)合細(xì)胞表面相應(yīng)的細(xì)胞因子受體而發(fā)揮生物學(xué)作用。細(xì)胞因子與其受體結(jié)合后啟動(dòng)復(fù)雜的細(xì)胞內(nèi)分子間的相互作用，最終引起細(xì)胞基因轉(zhuǎn)錄的變化。

3．3．2 差異表達(dá)基因KEGG功能富集分析

在生物體內(nèi)，不同的基因產(chǎn)物相互協(xié)調(diào)來(lái)行使生物學(xué)功能。因此進(jìn)行差異表達(dá)基因的通路注釋分析有助于進(jìn)一步解讀基因的功能。KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)是關(guān)于通路的主要公共數(shù)據(jù)庫(kù)。通過(guò)KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)富集分析，能夠找出差異表達(dá)基因主要代謝通路，通過(guò)通路差異來(lái)解釋表型差異的分子機(jī)制。本研究KEGG注釋和聚類分析結(jié)果顯示，差異表達(dá)基因顯著富集的通路是酮體生成與降解通路和類萜骨架生物合成通路。酮體是脂肪酸β－氧化的中間產(chǎn)物，包括乙酰乙酸、β－羥丁酸和丙酮，是肝外組織中迅速氧化供能的重要原料，是肝臟輸出能源的一種形式。類萜由2個(gè)或多個(gè)異戊二烯單位頭尾相連組成，可以是鏈狀，也可以是環(huán)狀，其低聚物如全順－視黃醛、β－胡蘿卜素、輔酶Q、鯊烯等都是機(jī)體代謝的重要物質(zhì)。視黃醛是維生素A的氧化產(chǎn)物；β－胡蘿卜素是維生素A原；鯊烯是膽固醇的前體；輔酶Q在體內(nèi)呼吸鏈電子傳遞中起重要作用，是細(xì)胞呼吸和細(xì)胞代謝的激活劑，也是重要的抗氧化劑和非特異性免疫增強(qiáng)劑。肝臟是脂肪代謝和脂肪酸β－氧化的主要場(chǎng)所，能調(diào)整外源性脂肪酸的碳鏈長(zhǎng)短、飽和度及合成新的必需脂肪酸，使之接近動(dòng)物組織特有的脂肪酸組成［56］。肝臟可以決定脂肪酸分解代謝過(guò)程中的各級(jí)代謝中間物在何種生理狀態(tài)下該往何處去，而不做無(wú)效和無(wú)用的工作。從這個(gè)意義上看，肝臟是調(diào)控脂肪酸代謝去向最理想的器官。本試驗(yàn)中，椰子油所含中鏈脂肪酸被小腸吸收后能直接通過(guò)門靜脈進(jìn)入肝臟，并在肝臟中快速氧化分解成終產(chǎn)物，不會(huì)有脂肪酸不完全氧化的情況發(fā)生，也就不會(huì)有酮體的生成。而紅花籽油中所含長(zhǎng)鏈不飽和脂肪酸被小腸吸收后，形成CM，通過(guò)淋巴管匯入血液大循環(huán)，運(yùn)輸?shù)街窘M織、肌肉和肝臟進(jìn)行氧化代謝。長(zhǎng)鏈脂肪酸在肝臟細(xì)胞中的氧化則不很完全，氧化的產(chǎn)物乙酰輔酶A既可以直接進(jìn)入三羧酸循環(huán)進(jìn)一步分解，也可以轉(zhuǎn)變成酮體以提高其在肝外組織中的利用率。肝臟中產(chǎn)生酮體的速度與肝外組織利用酮體的速度相關(guān)。因此，飼喂油脂類型不同，油脂在體內(nèi)代謝途徑不同，代謝通路也會(huì)有一定差異。

4　結(jié) 論

①高通量測(cè)序結(jié)果顯示，紅花籽油組與椰子油組肝臟差異表達(dá)基因共有938個(gè)，其中，上調(diào)幅度最大前15個(gè)基因和下調(diào)幅度最大前15個(gè)基因中各有10個(gè)是本次研究中新發(fā)掘的基因，在參考基因組中找不到已知基因序列，有待進(jìn)一步研究。

②從差異表達(dá)基因GO功能分類注釋結(jié)果看，細(xì)胞組分、分子功能和生物學(xué)過(guò)程數(shù)據(jù)庫(kù)中顯著富集基因都與脂類代謝相關(guān)。KEGG差異顯著富集代謝通路僅有酮體生成與降解通路和類萜骨架生物合成通路。

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Differentially Analysis of Liver Transcriptomes of Finishing Pigs Fed Different Dietary Fats Sources

LI Jianping

1，2

QIN Guixin

1

ZHAO Zhihui

3

ZHANG Qiaoling

4

WANG Dali

3

SUN Boxing

3

JIANG Hailong

1?

（責(zé)任編輯 武海龍）

（1．College of Animal Science and Technology，Jilin Agricultural University，Changchun 130118，China；2．Department of Animal Husbandry，Henan University of Animal Husbandry and Economy，Zhengzhou 450011，China；3．Agriculture Test Station，Jilin University，Changchun 130062，China；4．College of Animal Science and Veterinary Medicine，Jilin University，Changchun 130062，China）

Abstract：The study was to detect differentially expressed genes in liver of finishing pigs which were divided into two groups and separately fed safflower seed oil and coconut oil．The chosen pigs were slaughtered and liv?er tissue were isolated and their mRNA were respectively extracted．The liver transcriptomes were analyzed by Illumina HiSeq TM 2500 high?throughput RNA sequencing system．All RNA?Seq reads were mapped on the reference pig genome（Sscrofa10．2）using TopHat2 software．All of differentially expressed genes were anno?tated using Nr，GO and KEGG databases．The results showed that there were 938 differentially expressed genes in liver between two groups．479 genes were up?regulated and 459 genes were down?regulated in safflower seed oil group vs．coconut oil group．There were 773 differentially expressed genes annotated into database of cellu?lar component，768 into biological process，729 into molecular function in GO databases．There were 346 dif?ferentially expressed genes annotated into KEGG databases，and clustered pathways of differentially expressed genes included synthesis and degradation of ketone bodies and terpenoid backbone biosynthesis（P＜0．05）．［Chinese Journal of Animal Nutrition，2015，27（7）：2128?2134］

Key words：safflower seed oil；coconut oil；transcriptome；high?throughput RNA sequencing；differentially expressed gene；metabolism pathway；liver；finishing pig

Corresponding author?，associate professor，E?mail：hljiang＠jlau．edu．cn

通信作者：?姜海龍，副教授，碩士生導(dǎo)師，E?mail：hljiang＠jlau．edu．cn

作者簡(jiǎn)介：李建平（1976—），男，山西興縣人，講師，博士，研究方向?yàn)閯?dòng)物營(yíng)養(yǎng)與飼料科學(xué)，E?mail：sxljp2004＠126．com

基金項(xiàng)目：吉林省安全優(yōu)質(zhì)肉豬現(xiàn)代生產(chǎn)關(guān)鍵技術(shù)示范（20140301013ny）；國(guó)家科技支撐計(jì)劃課題生豬健康養(yǎng)殖模式構(gòu)建與示范（2012bad39b03）

收稿日期：2015－01－06

doi：10．3969／j．issn．1006?267x．2015．07．018

文章編號(hào)：1006?267X（2015）07?2128?12

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

中圖分類號(hào)：S828