基于生物信息學(xué)技術(shù)分析老年人頸動(dòng)脈不穩(wěn)定斑塊差異基因表達(dá)譜

基于生物信息學(xué)技術(shù)分析老年人頸動(dòng)脈不穩(wěn)定斑塊差異基因表達(dá)譜

奈文青丁宇張克偉1王媛媛單蘭蘭傅友吳洪淵丁燕戴萌

(南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院，廣東廣州510515)

摘要〔〕目的探討老年患者頸動(dòng)脈不穩(wěn)定斑塊發(fā)生的分子機(jī)制。方法從ArrayExpress數(shù)據(jù)庫下載基因表達(dá)譜數(shù)據(jù)集E-MTAB-2055。該數(shù)據(jù)包含24例頸動(dòng)脈不穩(wěn)定斑塊和24例穩(wěn)定斑塊，分別來源于24例老年頸動(dòng)脈粥樣硬化患者。通過系列數(shù)據(jù)分析從中篩選差異表達(dá)基因，并通過富集分析獲取與不穩(wěn)定斑塊有關(guān)的生物學(xué)過程和通路。同時(shí)，通過構(gòu)建差異表達(dá)基因的生物網(wǎng)絡(luò)尋找與該疾病高度相關(guān)的風(fēng)險(xiǎn)模塊。結(jié)果不穩(wěn)定斑塊中發(fā)生顯著性差異表達(dá)變化的基因共有439個(gè)，其中上調(diào)基因?yàn)?32個(gè)，下調(diào)基因?yàn)?07個(gè)。涉及到的生物學(xué)過程和通路大部分與炎癥和免疫應(yīng)答有關(guān)。生物網(wǎng)絡(luò)和模塊分析提示CXCR4、VCL和TYROBP 可能在老年患者不穩(wěn)定斑塊發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮著重要作用。結(jié)論本研究比較完整地揭示了老年患者頸動(dòng)脈不穩(wěn)定斑塊差異表達(dá)譜特征和涉及的生物學(xué)過程及信號(hào)通路，其中CXCR4、VCL和TYROBP可能參與不穩(wěn)定斑塊發(fā)生發(fā)展。

關(guān)鍵詞〔〕不穩(wěn)定斑塊；動(dòng)脈粥樣硬化；基因表達(dá)譜；差異表達(dá)基因；生物信息學(xué)

中圖分類號(hào)〔〕R543.4〔文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼〕A〔

基金項(xiàng)目：南方-哈佛“健康醫(yī)療云服務(wù)”平臺(tái)關(guān)鍵技術(shù)創(chuàng)新、集成與應(yīng)用(2013J4500040穗科信字〔2013〕184號(hào))

通訊作者：戴萌(1963-)，女，博士，教授，碩士生導(dǎo)師，主要從事血管衰老早期干預(yù)研究。

1河南省人民醫(yī)院

第一作者：奈文青(1988-)，女，在讀碩士，主要從事動(dòng)脈粥樣硬化早期干預(yù)研究。

越來越多的研究表明，急性心腦血管事件的發(fā)生不僅取決于動(dòng)脈管腔的狹窄程度，更重要的決定因素是動(dòng)脈粥樣硬化(AS)不穩(wěn)定斑塊的形成〔1〕。不穩(wěn)定斑塊形成的病理生理學(xué)機(jī)制主要包括斑塊內(nèi)炎癥反應(yīng)的增加、新生血管形成和細(xì)胞大量凋亡，而誘導(dǎo)這些病理生理過程改變的分子機(jī)制并不完全清楚〔2，3〕。基因表達(dá)芯片技術(shù)可同時(shí)比較成千上萬個(gè)基因的表達(dá)變化，全面篩選某一表型或某一疾病的所有相關(guān)基因，還可揭示不同基因表達(dá)變化之間的相互關(guān)系，從而為研究基因與基因之間的內(nèi)在聯(lián)系提供線索。本研究通過基因芯片技術(shù)分析獲取老年患者不穩(wěn)定斑塊和穩(wěn)定斑塊間差異表達(dá)基因(DEGs)，并運(yùn)用生物信息學(xué)方法分別在基因本體(GO)、通路和蛋白互作網(wǎng)絡(luò)中分析不穩(wěn)定斑塊形成的分子機(jī)制，旨在尋找該疾病相關(guān)生物學(xué)過程、通路和風(fēng)險(xiǎn)模塊。

1材料與方法

1.1數(shù)據(jù)來源及樣本描述本研究使用的E-MTAB-2055數(shù)據(jù)集來源于ArrayExpress數(shù)據(jù)庫(http://www.ebi.ac.uk/arrayexpress/)，采用的芯片是A-MEXP-931-Illumina HumanRef-8 v2 Expression BeadChip。

該芯片數(shù)據(jù)的樣本包含24例晚期穩(wěn)定斑塊組織和24例不穩(wěn)定斑塊組織，均來源于經(jīng)頸動(dòng)脈內(nèi)膜剝脫術(shù)后患者病變血管，獲取的斑塊組織經(jīng)病理學(xué)鑒定分為穩(wěn)定斑塊和不穩(wěn)定斑塊兩部分，病人年齡61~83歲，平均68.69歲，上述所取血管組織包含血管內(nèi)膜和中膜，不包含血管外膜〔4〕。

1.2數(shù)據(jù)處理方法

1.2.1表達(dá)譜數(shù)據(jù)預(yù)處理從ArrayExpress數(shù)據(jù)庫中下載E-MTAB-2055的CEL文件后，分別在R軟件(R3.0.0)中運(yùn)行Lumi包〔5〕和Limma包〔6〕，并使用包中的線性模型方法、經(jīng)驗(yàn)Bayes算法和歸一化算法分別對探針?biāo)降男盘?hào)值進(jìn)行質(zhì)控、變異穩(wěn)定性分析、背景矯正、數(shù)據(jù)歸一化和基因注釋，最終轉(zhuǎn)化為基因水平的表達(dá)值。

1.2.2獲取DEGs使用t檢驗(yàn)和倍比法(FC)識(shí)別DEGs。DEGs篩選閾值為P≤0.01且|logFC|>1。

1.2.3DEGs功能富集分析通過DAVID網(wǎng)站〔7〕(http://david.abcc.ncifcrf.gov/home.jsp)提交基因表達(dá)譜獲取的DEGs分別進(jìn)行GO語義〔8〕和KEGG通路〔9〕富集分析。篩選富集分析GO語義和KEGG通路的閾值分別為FDR≤0.01和P≤0.05。

1.2.4蛋白互作網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建和尋找疾病相關(guān)模塊首先從string〔10〕(版本號(hào)9.1)網(wǎng)站下載人類所有的蛋白互作關(guān)系列表，通過在R軟件中對蛋白互作列表進(jìn)行預(yù)處理如去冗余、自身互作等并保留互作可信度得分> 0.7的蛋白互作對，然后映射DEGs到蛋白互作網(wǎng)絡(luò)，僅保留DEGs間的互作關(guān)系，獲取DEGs在蛋白互作層面的生物網(wǎng)絡(luò)。最后，將DEGs構(gòu)建的生物網(wǎng)絡(luò)導(dǎo)入到Cytoscape〔11〕(版本號(hào)2.8.2)實(shí)現(xiàn)生物網(wǎng)絡(luò)可視化，并進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)度的計(jì)算和查找疾病相關(guān)模塊。

2結(jié)果

2.1篩選DEGs結(jié)果滿足篩選閾值要求的DEGs共439個(gè)，上調(diào)基因232個(gè)，下調(diào)基因207個(gè)，差異表達(dá)上調(diào)基因倍比變化最大的基因是heme oxygenase 1(HMOX1，logFC=3.1)，差異表達(dá)下調(diào)基因倍比變化最大的基因是alpha-actin(ACTC1，logFC=-2.2)。

2.2生物學(xué)意義的分析結(jié)果

2.2.1DEGs功能富集分析結(jié)果GO富集分析結(jié)果顯示共有15個(gè)生物學(xué)過程語義滿足富集閾值要求，Term：response to wounding，defense response，immune response，inflammatory response，taxis，chemotaxis，cell adhesion，biological adhesion，locomotory behavior，cytoskeleton organization，muscle system process，actin cytoskeleton organization，actin filament-based process，negative regulation of cell proliferation,muscle contraction，均P<0.001，F(xiàn)DR<0.001。其中，免疫應(yīng)答、免疫防御、炎癥應(yīng)答、細(xì)胞因子等富集顯著性最高，位于富集結(jié)果最前面。

通路富集結(jié)果顯示9個(gè)通路符合富集閾值要求(表1)。富集通路包括免疫系統(tǒng)相關(guān)通路(細(xì)胞因子信號(hào)通路、白細(xì)胞跨膜遷移通路、造血細(xì)胞譜系和補(bǔ)體凝血級聯(lián)反應(yīng))、細(xì)胞過程(溶酶體通路、肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架調(diào)節(jié))、環(huán)境信息處理(細(xì)胞因子-細(xì)胞因子受體互作)、內(nèi)分泌系統(tǒng)通路(PPAR信號(hào)通路)和代謝(色氨酸代謝)。結(jié)果顯示富集到的免疫相關(guān)通路數(shù)目最多，而富集顯著性最高的通路是溶酶體通路。

表1差異表達(dá)基因富集KEGG通路結(jié)果

PathwayP值PathwayClassLysosome<0.001CellularProcesses;TransportandcatabolismChemokinesignalingpathway<0.001OrganismalSystems;ImmunesystemPPARsignalingpath-way<0.001OrganismalSystems;EndocrinesystemCytokine-cytokinere-ceptorinteraction0.002EnvironmentalInformationPro-cessing;SignalingmoleculesandinteractionLeukocytetransendo-thelialmigration0.004OrganismalSystems;ImmunesystemHematopoieticcellline-age0.006OrganismalSystems;ImmunesystemRegulationofactincy-toskeleton0.021CellularProcesses;CellmotilityComplementandcoag-ulationcascades0.023OrganismalSystems;ImmunesystemTryptophanmetabo-lism0.039Metabolism;Aminoacidmetab-olism

網(wǎng)絡(luò)中圓形結(jié)點(diǎn)表示差異表達(dá)基因，邊表示差異基因間互作，紅色結(jié)點(diǎn)表示上調(diào)的DEG，藍(lán)色結(jié)點(diǎn)表示下調(diào)的DEG 圖1　差異表達(dá)基因構(gòu)建蛋白互作網(wǎng)絡(luò)

2.2.2DEGs映射蛋白互作網(wǎng)絡(luò)和尋找疾病模塊分析結(jié)果本研究利用STRING數(shù)據(jù)庫提供的人類蛋白互作信息構(gòu)建DEGs在蛋白層面互作關(guān)系，并在cytoscape中實(shí)現(xiàn)可視化(圖1)。為了進(jìn)一步深入揭示不穩(wěn)定斑塊發(fā)生發(fā)展機(jī)制，對該蛋白互作網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行聚類分析并查找疾病相關(guān)風(fēng)險(xiǎn)模塊。在不穩(wěn)定斑塊形成過程中，這些模塊中差異基因可能發(fā)揮協(xié)同調(diào)控作用共同促進(jìn)不穩(wěn)定斑塊發(fā)生。按模塊中基因總數(shù)不少于5的閾值標(biāo)準(zhǔn)，本研究共獲取了四個(gè)與不穩(wěn)定斑塊相關(guān)的風(fēng)險(xiǎn)模塊(圖2)，所有模塊中互作基因差異表達(dá)方向均一致，同時(shí)，TYROBP、CXCR4、VCL和APOE分別是四個(gè)模塊中的樞紐基因。

紅色結(jié)點(diǎn)代表差異上調(diào)基因，藍(lán)色結(jié)點(diǎn)代表差異下調(diào)基因 圖2　蛋白互作網(wǎng)絡(luò)中獲取的4個(gè)模塊

3討論

本研究共獲取了439個(gè)DEG，其中上調(diào)基因232個(gè)，下調(diào)基因207個(gè)，它們共同構(gòu)成了老年患者不穩(wěn)定斑塊差異基因表達(dá)譜，與不穩(wěn)定斑塊的形成密切相關(guān)，從分子生物學(xué)角度再次證實(shí)穩(wěn)定斑塊發(fā)展為不穩(wěn)定斑塊是一個(gè)復(fù)雜的病理生理過程。GO和通路富集分析結(jié)果顯示，炎癥和免疫應(yīng)答等相關(guān)生物學(xué)過程和通路被顯著富集。

蛋白互作網(wǎng)絡(luò)和模塊分析結(jié)果顯示 CXCR4、VCL和TYROBP在模塊和蛋白互作網(wǎng)絡(luò)中均處于中心位置，可能在促進(jìn)斑塊發(fā)生不穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的病理過程中發(fā)揮著重要作用。CXCR4位于染色體2q21，屬于G蛋白耦聯(lián)趨化因子受體，可以與基質(zhì)細(xì)胞衍生因子(SDF)-1發(fā)生特異性結(jié)合，參與趨化、細(xì)胞阻滯、血管生成和細(xì)胞生存等過程，促進(jìn)HIV病毒轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞、自身免疫性疾病發(fā)生和腫瘤細(xì)胞增殖、遷移及侵襲〔12〕。Melchionna等〔13〕通過不同強(qiáng)度剪切應(yīng)力處理人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)現(xiàn)低血流剪切力可以引起血管內(nèi)皮損傷，損傷的血管內(nèi)皮細(xì)胞較正常血管內(nèi)皮細(xì)胞高表達(dá)CXCR4蛋白，從而誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞凋亡，研究者推測CXCR4可能參與早期動(dòng)脈粥樣硬化斑塊形成，而下調(diào)CXCR4對血管起保護(hù)作用。國內(nèi)研究人員通過使用冠心康干預(yù)小鼠主動(dòng)脈粥樣硬化進(jìn)程發(fā)現(xiàn)，伴隨主動(dòng)脈粥樣硬化程度減輕，冠心康組小鼠主動(dòng)脈組織中SDF-1和CXCR4表達(dá)水平明顯低于未干預(yù)組，研究者推測SDF-1/CXCR4軸可能是藥物干預(yù)動(dòng)脈粥樣硬化進(jìn)程的作用靶點(diǎn)〔14〕。de Gaetano等〔15〕研究表明，ApoE(-/-)小鼠上使用共軛亞油酸抑制CXCR4表達(dá)可以誘導(dǎo)早期動(dòng)脈粥樣斑塊消退，降低斑塊局部白細(xì)胞粘附能力和數(shù)量。與上述研究不同，Yao等〔16〕研究顯示，在不穩(wěn)定動(dòng)脈粥樣斑塊模型鼠上，外源性靜脈輸注SDF-1通過激活SDF-1/CXCR4軸，募集保護(hù)性骨髓源性血管祖細(xì)胞，可誘導(dǎo)晚期不穩(wěn)定斑塊轉(zhuǎn)歸為穩(wěn)定斑塊。上述研究反映了CXCR4在動(dòng)脈硬化發(fā)生發(fā)展過程中角色的復(fù)雜性和功能多樣性，可能與不同研究中使用的動(dòng)物模型(如小鼠遺傳背景和造模方法差異)、斑塊不同分期和血管祖細(xì)胞亞型差異有關(guān)。此外，通路富集分析結(jié)果顯示該基因主要參與細(xì)胞因子信號(hào)通路、細(xì)胞因子-細(xì)胞因子受體互作和白細(xì)胞跨膜遷移。CXCR4在本研究中差異上調(diào)，結(jié)合國內(nèi)外相關(guān)研究認(rèn)為該基因異常表達(dá)可能與不穩(wěn)定斑塊形成有關(guān)，需要進(jìn)一步驗(yàn)證。VCL又稱為黏著斑蛋白，位于染色體10q22.2，是一種細(xì)胞骨架蛋白，參與細(xì)胞-細(xì)胞或細(xì)胞-基質(zhì)之間連接。Constantinescu等〔17〕研究發(fā)現(xiàn)，高血脂血清刺激鼠主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞會(huì)引起VCL表達(dá)和分布發(fā)生異常改變，研究者推斷VCL的異常變化可能促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展。另一項(xiàng)研究通過蛋白組學(xué)技術(shù)分析冠狀動(dòng)脈粥樣硬化斑塊和早期病變血管中膜組織中差異蛋白，發(fā)現(xiàn)VCL蛋白在斑塊組織中表達(dá)下調(diào)，而后續(xù)免疫組化實(shí)驗(yàn)也證實(shí)了VCL表達(dá)水平的降低。研究者推斷，在動(dòng)脈粥樣硬化進(jìn)程中，VCL的表達(dá)異常促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化進(jìn)展〔18〕。Rocchiccioli等〔19〕運(yùn)用高效液相色譜法和質(zhì)譜技術(shù)分析14對頸動(dòng)脈斑塊組織和斑塊旁組織發(fā)現(xiàn)，與斑塊旁組織相比，斑塊組織低表達(dá)VCL蛋白，隨后免疫組化和蛋白印跡證實(shí)VCL在斑塊組織中表達(dá)下調(diào)，并推測VCL下調(diào)可能參與動(dòng)脈硬化斑塊發(fā)生發(fā)展。VCL富集到的通路主要是白細(xì)胞跨膜遷移和肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架調(diào)節(jié)。VCL在本研究中差異下調(diào)，其可能參與不穩(wěn)定斑塊形成，有待進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。TYROBP，別名DAP12，位于染色體19q13.1，編碼一種跨膜信號(hào)分子多肽，其編碼的蛋白主要參與骨塑形、大腦髓鞘形成、信號(hào)傳導(dǎo)和炎癥反應(yīng)〔20〕。值得一提的是，TYROBP基因在本研究中差異上調(diào)，但是其在動(dòng)脈硬化斑塊的表達(dá)情況尚未見報(bào)道，可能是不穩(wěn)定斑塊發(fā)生過程中新的診斷或預(yù)后相關(guān)基因，其差異驗(yàn)證和功能分析將是我們下一步研究的重點(diǎn)。

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〔2015-03-18修回〕

(編輯徐杰)