灰樹(shù)花多糖聯(lián)合順鉑誘導(dǎo)HeLa細(xì)胞凋亡

灰樹(shù)花多糖聯(lián)合順鉑誘導(dǎo)HeLa細(xì)胞凋亡

呂冬霞羅文哲劉娜1范曉艷魏鳳香2

(佳木斯大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，黑龍江佳木斯154007)

摘要〔〕目的探討灰樹(shù)花多糖(PGF)聯(lián)合順鉑(DDP)誘導(dǎo)HeLa細(xì)胞凋亡及其可能的分子機(jī)制。方法四甲基偶氮唑藍(lán)比危法(MTT)檢測(cè)細(xì)胞增殖抑制率，RT-PCR法檢測(cè)survivin和caspase-3 mRNA的表達(dá)。結(jié)果MTT法顯示，聯(lián)合用藥抑制率均高于單藥組(P<0.05)。PGF 0.05 mg/L與DDP 1 mg/L聯(lián)合作用24 h時(shí)，Q>1.15； RT-PCR顯示，聯(lián)合用藥組與兩單藥組比較 survivin mRNA 表達(dá)下調(diào)，caspase-3 mRNA 表達(dá)上調(diào)。結(jié)論聯(lián)合用藥對(duì)HeLa細(xì)胞的抑制率較單獨(dú)用藥組有明顯提高。聯(lián)合用藥24 h時(shí)點(diǎn)，二者有協(xié)同作用。聯(lián)合用藥誘導(dǎo)HeLa細(xì)胞凋亡可能與凋亡基因survivin表達(dá)下調(diào)和caspase-3基因表達(dá)上調(diào)有關(guān)。

關(guān)鍵詞〔〕灰樹(shù)花多糖；順鉑；細(xì)胞凋亡；半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶

中圖分類(lèi)號(hào)〔〕R730.52〔文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼〕A〔

基金項(xiàng)目：黑龍江省衛(wèi)生廳研究項(xiàng)目(No.2009-343)

通訊作者：魏鳳香(1974-)，女，副教授，碩士生導(dǎo)師，主要從事腫瘤發(fā)生機(jī)制與生物學(xué)治療研究。

1白城實(shí)驗(yàn)中學(xué)2深圳龍崗區(qū)婦幼保健院

第一作者：呂冬霞(1965-)，女，教授，碩士生導(dǎo)師，主要從事腫瘤發(fā)生機(jī)制與生物學(xué)治療研究。

灰樹(shù)花多糖(PGF)具有改善免疫系統(tǒng)功能、抑制腫瘤、調(diào)節(jié)血糖等功能〔1〕。順鉑(DDP)廣泛應(yīng)用于多種實(shí)體瘤的治療中且療效確切。本研究探討PGF聯(lián)合DDP對(duì)HeLa細(xì)胞敏感作用及其可能的機(jī)制，為臨床治療宮頸癌提供新思路。

1材料與方法

1.1材料人宮頸癌HeLa細(xì)胞購(gòu)于武漢大學(xué)典型培養(yǎng)物冷藏中心。其他主要儀器及試劑有：凈化工作臺(tái)(蘇州凈化設(shè)備廠)、二氧化碳培養(yǎng)箱(SHEL LAB2300，美國(guó))、倒置相差顯微鏡(OLYMPUS，日本)、酶標(biāo)儀(LABSYSTEMS)、PCR儀( PE-5700，美國(guó))、電泳儀(北京六一儀器廠)、電泳槽(北京東方儀器)、流氏細(xì)胞儀(美國(guó)BD公司)；小牛血清與RPMI-1640培養(yǎng)液(杭州四季青)，二甲基亞砜 (DMSO，Amersco)、MTT(上海普飛生物技術(shù)有限公司)、灰樹(shù)花多糖粉末(浙江方格藥業(yè)有限公司)、順鉑粉劑(山東齊魯制藥廠)、總RNA提取與RT-PCR試劑盒(大連寶生物)，細(xì)胞凋亡試劑盒(南京凱基公司)。

1.2細(xì)胞培養(yǎng)使用含10%滅活小牛血清的RPMI-1640完全培養(yǎng)液培養(yǎng)細(xì)胞。常規(guī)方法傳代。

1.3四甲基偶氮唑藍(lán)比色法(MTT)檢測(cè)細(xì)胞增殖抑制率及評(píng)價(jià)聯(lián)合用藥效果取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期HeLa細(xì)胞移入96孔培養(yǎng)板中，細(xì)胞密度1×104個(gè)/ml，每孔加入200 μl細(xì)胞懸液，37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。24 h后，棄去原培養(yǎng)液，分別加入不同濃度的PGF或DDP的RPMI1640培養(yǎng)液200 μl。PGF組中，加入不同濃度的多糖溶液，其終濃度分別為0.01、0.05、0.1 mg/L；DDP組中，加入不同濃度的順鉑溶液，其終濃度分別為0.25、0.5、1 mg/L；聯(lián)合用藥組中，取PGF溶液為0.05 mg/L，分別與DDP0.25、0.5、1 mg/L聯(lián)合；空白對(duì)照組中僅加10%小牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液。每個(gè)濃度設(shè)立8個(gè)復(fù)孔，把培養(yǎng)板移入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，經(jīng)過(guò)12、24、48 h 后分別加入MTT(5 mg/L)20 μl，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)上清液，每孔加入150 μl DMSO，振蕩10 min，使結(jié)晶物充分溶解。選擇490 nm波長(zhǎng)酶聯(lián)免疫儀檢測(cè)，以空白孔調(diào)零，測(cè)定各孔吸光度值(OD)。細(xì)胞增殖抑制率=(1-實(shí)驗(yàn)組OD值/對(duì)照組OD值)×100%；評(píng)價(jià)聯(lián)合用藥效果：q值=E(A+B)/EA+EB(1-EA)〔EA、EB、E(A+B)分別為PGF組、DDP組及聯(lián)合組的抑制率〕。根據(jù)q值評(píng)價(jià)聯(lián)合用藥效果，若q<0.85 為拮抗，0.85~1.15為相加，q>1.15為協(xié)同。根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果，找到一組有協(xié)同或相加作用的組合，以下試驗(yàn)均采用這一濃度藥物。

1.4半定量RT-PCR檢測(cè)survivin、caspase-3基因mRNA表達(dá)選取空白對(duì)照組、PGF 0.05 mg/L、DDP 1 mg/L、聯(lián)合用藥組為0.05 mg/L PGF和1 mg/L DDP、只加含10%小牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液。藥物作用24 h后，先提取細(xì)胞總RNA，再進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，最后將逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物cDNA進(jìn)行PCR反應(yīng)。引物設(shè)計(jì)參照文獻(xiàn)〔2〕，PCR反應(yīng)引物為survivin：正義5′-TCT CAA GGA CCA CCG CAT CT-3，反義5′-GGC TCT TTC TCT GTC CAG TTT CA-3′；caspase-3：正義5′-GCT ATT GTG AGG CGG TTG T-3′，反義5′-CGT TTG GAG TCC CTT TGT-3′；β-actin：正義5′-ACA CTG TGC CCA TCT ACG AGG-3′，反義5′-AGG GGC CGG ACT CGT CAT ACT-3′。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳，凝膠圖像分析系統(tǒng)觀察結(jié)果、拍照并分析。以β-actin的表達(dá)量為對(duì)照，計(jì)算并比較各組caspase-3及survivin的相對(duì)表達(dá)量。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS11.5軟件行t檢驗(yàn)。

2結(jié)果

2.1MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖抑制率及評(píng)價(jià)聯(lián)合用藥效果PGF對(duì)HeLa細(xì)胞的增殖抑制作用均有明顯的劑量-效應(yīng)和時(shí)間-效應(yīng)依賴關(guān)系。DDP對(duì)HeLa細(xì)胞的增殖抑制作用均有明顯的劑量-效應(yīng)和時(shí)間-效應(yīng)依賴關(guān)系。

根據(jù)上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選取0.05 mg/L PGF分別與0.25、0.5、1 mg/L的DDP聯(lián)合作用于HeLa細(xì)胞(其他組合有待后續(xù)研究中進(jìn)行)，對(duì)照組加等量的培養(yǎng)基。 MTT比色法分析結(jié)果顯示細(xì)胞增殖被抑制。PGF與DDP聯(lián)合作用24 h時(shí)，抑制率均高于單藥組(P<0.05)，其中0.05 mg/L PGF與1 mg/L DDP聯(lián)合作用于24 h時(shí)的q值為1.17，表現(xiàn)出協(xié)同作用，其余均為相加作用。

2.2RT-PCR檢測(cè)survivin、caspase-3基因mRNA表達(dá)與空白對(duì)照組比較，PGF組survivin表達(dá)降低，caspase-3 mRNA表達(dá)上調(diào)(P<0.05)。兩藥聯(lián)合組caspase-3 mRNA的表達(dá)高于兩單藥組(P<0.05)，survivin mRNA的表達(dá)低于兩單藥組(P<0.01)，見(jiàn)表1。

組別caspase-3/β-actinsurvivin/β-actin空白對(duì)照組0.816±0.0874)0.931±0.0324)順鉑組1.117±0.0252)3)0.716±0.0372)4)PGF1.016±0.0761)3)0.826±0.0471)4)聯(lián)合組1.214±0.0532)0.550±0.0492)

與空白對(duì)照組比較:1)P<0.05，2)P<0.01;與聯(lián)合組比較:3)P<0.05，4)P<0.01

3討論

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示PGF對(duì)DDP可能起到增敏作用。誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的因素很多，凋亡抑制蛋白(IAP)是一種廣泛表達(dá)的抑制凋亡的基因家族〔3，4〕，在功能上具有抑制細(xì)胞凋亡的作用。Survivin是凋亡抑制蛋白家族的新成員，在絕大多數(shù)腫瘤組織中表達(dá)。Caspase是細(xì)胞凋亡的核心執(zhí)行者〔5，6〕。Caspase-3屬于效應(yīng)Caspase〔7〕。本實(shí)驗(yàn)提示PGF和DDP激活細(xì)胞凋亡具有共同的途徑，這可能是它們?cè)谝欢ǖ膭┝繒r(shí)產(chǎn)生協(xié)同作用使PGF對(duì)DDP具有增敏作用。

4參考文獻(xiàn)

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3曹世龍.腫瘤學(xué)新理論與新技術(shù)〔M〕.上海：上?？萍冀逃霭嫔?，1997：463.

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6Rao RV，Hermel E.Coupling endoplasmic reticulum stress to the cell death program.mechanism of caspase activation.〔J〕J Biol Chem，2001；276(36)：33869-74.

7Nicholson DW，Ali A，Thornberry NA，etal.Identification and inhibition of the ICE/CED-3 protease nessary for mammalian apoptosis〔J〕.Nature，1995；376(1)：37-43.

〔2014-10-02修回〕

(編輯李相軍/滕欣航)