AtbZIP19和AtbZIP23蛋白的原核表達(dá)

曹樹(shù)青(1966-),男,安徽池州人,博士,合肥工業(yè)大學(xué)教授,博士生導(dǎo)師.

AtbZIP19和AtbZIP23蛋白的原核表達(dá)

孫成磊,董萬(wàn)春,韓嬌,管靈霞,陽(yáng)立波,曹樹(shù)青

(合肥工業(yè)大學(xué) 生物與食品工程學(xué)院,安徽 合肥230009)

摘要:bZIP類轉(zhuǎn)錄因子參與調(diào)控多種生物學(xué)過(guò)程,包括植物生長(zhǎng)、花的發(fā)育、種子的成熟、衰老、光信號(hào)傳導(dǎo)、損傷修復(fù)、病菌防御以及對(duì)各種環(huán)境脅迫的響應(yīng)等。文章構(gòu)建AtbZIP19和AtbZIP23基因的原核表達(dá)載體,并在大腸桿菌BL21(DE3)中進(jìn)行了蛋白表達(dá);提取擬南芥植株總RNA,通過(guò)RT-PCR克隆AtbZIP19與AtbZIP23基因cDNA 全長(zhǎng);將pET-32a+載體和聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)產(chǎn)物進(jìn)行雙酶切,通過(guò)DNA連接反應(yīng)將2個(gè)基因定向克隆到pET-32a+質(zhì)粒中;經(jīng)菌液PCR和測(cè)序鑒定獲得陽(yáng)性克隆后,將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至大腸桿菌原核表達(dá)菌株BL21(DE3),經(jīng)異丙基硫代半乳糖苷(IPTG)誘導(dǎo)后表達(dá)得到目的蛋白。

關(guān)鍵詞:擬南芥;AtbZIP19蛋白;AtbZIP23蛋白;原核表達(dá)

收稿日期：2014-02-17；修回日期：2014-04-16

基金項(xiàng)目：高等學(xué)校博士學(xué)科點(diǎn)專項(xiàng)科研基金資助項(xiàng)目(20120111110009);中國(guó)博士后科學(xué)基金資助項(xiàng)目(2012M521213)和安徽省自然科學(xué)青年基金資助項(xiàng)目(1308085QC56)

作者簡(jiǎn)介：孫成磊(1988-),男,山東鄆城人,合肥工業(yè)大學(xué)碩士生;

doi:10.3969/j.issn.1003-5060.2015.01.024

中圖分類號(hào):Q753文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

ProkaryoticexpressionofAtbZIP19andAtbZIP23proteins

SUNCheng-lei,DONGWan-chun,HANJiao,GUANLing-xia,YANGLi-bo,CAOShu-qing

(SchoolofBiotechnologyandFoodEngineering,HefeiUniversityofTechnology,Hefei230009,China)

Abstract:Basic leucine zipper(bZIP) transcription factors are involved in various biological functions such as plant growth regulation, flower development, seed maturation, senescence, light signal transduction, wounding responses, pathogen defence and responses to various environment stresses. To construct the eukaryotic expression plasmids of AtbZIP19 and AtbZIP23, total RNA was extracted from Arabidopsis seedlings, and cDNA fragments of AtbZIP19 and AtbZIP23 were PCR-amplified through reverse-transcription polymerase chain reaction(RT-PCR) and inserted into the pET-32a+ vector to build up constructions of pET-32a-bZIP19 and pET-32a-bZIP23. These plasmids were identified by DNA sequencing. The recombinant plasmids were transfected into BL21(DE3) and expressed through sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gelelectrophoresis, and the AtbZIP19 and AtbZIP23 proteins were detected to be prokaryotic.

Keywords:Arabidopsis thaliana；AtbZIP19protein;AtbZIP23protein;prokaryoticexpression

轉(zhuǎn)錄因子(transcriptionfactor)是一類能與真核基因啟動(dòng)子區(qū)域中順式作用元件發(fā)生特異性相互作用的DNA結(jié)合蛋白。而堿性亮氨酸拉鏈(basicleucinezipper,bZIP)蛋白是真核生物轉(zhuǎn)錄因子中分布廣泛而且最保守的類型之一[1],從高等植物到哺乳動(dòng)物中都發(fā)現(xiàn)了bZIP蛋白的存在[2]。根據(jù)堿性結(jié)構(gòu)域以及其他保守的結(jié)構(gòu)域[3],將擬南芥的75個(gè)bZIP類轉(zhuǎn)錄因子基因家族成員分為A、B、C、D、E、F、G、H、I和S類10個(gè)亞家族。植物bZIP轉(zhuǎn)錄因子參與多種生物學(xué)過(guò)程,包括器官和組織分化、細(xì)胞生長(zhǎng)、碳氮能量代謝、折疊蛋白響應(yīng)、種子儲(chǔ)藏蛋白基因調(diào)節(jié)、糖代謝、生物和非生物脅迫等[4]。在大自然中生存的植物均面臨各種各樣的逆境脅迫,主要分為生物脅迫(如病蟲(chóng)害)和非生物脅迫(如低溫、干旱及高鹽等)2類。

近年來(lái),越來(lái)越多的研究發(fā)現(xiàn),bZIP轉(zhuǎn)錄因子在抵抗這些逆境脅迫時(shí)起著關(guān)鍵作用。有研究表明，AtbZIP19和AtbZIP23基因?qū)M南芥在低鋅脅迫環(huán)境下的正常生長(zhǎng)至關(guān)重要[5]。而文獻(xiàn)[6]發(fā)現(xiàn)bZIP23轉(zhuǎn)錄因子還可以通過(guò)ABA依賴途徑調(diào)節(jié)植物的生長(zhǎng)發(fā)育和對(duì)非生物脅迫的耐性有著明顯的作用,尤其是對(duì)抵抗干旱脅迫。本文克隆了AtbZIP19和AtbZIP23基因的cDNA,構(gòu)建了2個(gè)基因的原核表達(dá)載體,對(duì)2種蛋白進(jìn)行了誘導(dǎo)表達(dá)，為后續(xù)對(duì)這2個(gè)轉(zhuǎn)錄因子之間的相互作用及其對(duì)下游基因的調(diào)控研究奠定了基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1　材料

1.1.1　實(shí)驗(yàn)材料

擬南芥(Arabidopsis thaliana)哥倫比亞野生型(Col-0), 購(gòu)于美國(guó)擬南芥種質(zhì)資源中心,由本實(shí)驗(yàn)室繁衍保存。

1.1.2　主要試劑

RevertAidFirstStrandcDNASynthesisKit反轉(zhuǎn)錄試劑盒、RNAisoPlus總RNA抽提試劑盒、限制性內(nèi)切酶KpnⅠ 、HindⅢ和EcoRⅠ 、PrimeSTARMaxDNAPolymerase均購(gòu)于Takara公司;T4DNA連接酶、EasyTaq、BL21(DE3)plysSChemicallyCompetentCell均購(gòu)于北京TransGen公司;普通DNA產(chǎn)物純化試劑盒、普通瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒、質(zhì)粒小提試劑盒均購(gòu)于天根公司。

1.1.3　宿主菌和載體

感受態(tài)細(xì)胞Trans1-T1ChemicallyCompetentCell, 原核表達(dá)大腸桿菌菌株BL21(DE3)plysSChemicallyCompetentCell,原核表達(dá)載體pET-32a+。

1.2　方法

1.2.1　擬南芥植株培養(yǎng)

將Col-0用0.1%的氯化汞溶液消毒后點(diǎn)于MS固體培養(yǎng)基上,于4 ℃春化3d,最后置于光強(qiáng)度為 100μmol/(m2·s)、光周期為16/8 h、培養(yǎng)溫度為23 ℃的條件下培養(yǎng)21 d[7]。

1.2.2　 AtbZIP19、 AtbZIP23基因克隆

RNAisoPlus總RNA抽提試劑盒抽提組織中總RNA,詳細(xì)方法見(jiàn)Takara試劑說(shuō)明書(shū)。以總RNA為模板,用RevertAidFirstStrandcDNASynthesisKit反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA。根據(jù)擬南芥信息資源網(wǎng)站(TAIR)中提供的基因cDNA序列,利用PrimerPremier5.0 軟件設(shè)計(jì)引物,并正向和反向引物的5′端加上所需的酶切位點(diǎn)與保護(hù)堿基，即

AtbZIP19Fp:5′-NNNGAATTCATGGAAGACGGTGAGCTTGA-3′EcoRⅠ

AtbZIP19Rp:5′-NNNAAGCTTAACTGCTCTTGATGCACGATG-3′HindⅢ

AtbZIP23Fp:5′-NNNGGTACCATGGACGACGGTGAGCTTGA-3′KpnⅠ

AtbZIP23Rp:5′-NNNAAGCTTAACTGCTTTCGCTGCTCG-3′HindⅢ

以cDNA為模板用PrimeSTARMaxDNAPolymerase高保真擴(kuò)增酶進(jìn)行聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)擴(kuò)增,程序如下:98 ℃預(yù)變性5min,98 ℃變性15s,58 ℃退火30s,72 ℃延伸45s,共30個(gè)循環(huán),72 ℃延伸10min,4 ℃保存。PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測(cè),并回收純化目的條帶。

1.2.3　原核表達(dá)載體的構(gòu)建

載體與目的基因用相應(yīng)的限制性內(nèi)切酶進(jìn)行雙酶切,電泳檢測(cè)并回收酶切產(chǎn)物。將回收后的載體與目的基因連接,連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至E.coliDH5α中,用含100μg/mL氨芐青霉素(Amp)的LB固體培養(yǎng)基篩選陽(yáng)性克隆。

挑取單菌落于含100μg/mLAmp的LB液體培養(yǎng)基37 ℃培養(yǎng)8h,通過(guò)菌液PCR及測(cè)序驗(yàn)證正確后載體構(gòu)建成功。

1.2.4　重組原核表達(dá)載體轉(zhuǎn)入表達(dá)菌株

將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入表達(dá)菌株BL21(DE3)plysSChemicallyCompetentCell,用含有100μg/mL氨芐青霉素(Amp)和20μg/mL氯霉素(Chl)的LB固體雙抗培養(yǎng)基篩選陽(yáng)性克隆。挑取單菌落,置于100μg/mLAmp-LB、20μg/mLChl雙抗液體培養(yǎng)基，37 ℃、O/N培養(yǎng)。菌液PCR驗(yàn)證。

1.2.5　蛋白誘導(dǎo)表達(dá)及 SDS- PAGE電泳檢測(cè)

將轉(zhuǎn)入表達(dá)載體的BL21菌株接種于含100μg/mLAmp的LB液體培養(yǎng)基在37 ℃、O/N培養(yǎng),然后加入異丙基硫代半乳糖苷(IPTG),30 ℃繼續(xù)培養(yǎng)2～3h,誘導(dǎo)表達(dá)目的蛋白。取少量100μL菌液,5 000r/min離心,去上清,用上樣緩沖液重懸菌體,沸水浴10min。制膠上樣,50V濃縮30min,然后100V分離1h?？捡R斯亮藍(lán)(R250)染料染色10min后脫色液脫色,置于脫色搖床上過(guò)夜脫色,根據(jù)脫色情況更換脫色液[8]。

2結(jié)果與分析

2.1　 PCR擴(kuò)增目的基因

提取野生型擬南芥植株總RNA,用反轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄為cDNA,以cDNA為模板擴(kuò)增AtbZIP19和AtbZIP23基因。AtbZIP19基因如圖1a所示,CDS長(zhǎng)度為786bp,AtbZIP23基因如圖1b所示,CDS全長(zhǎng)為750bp。

圖1　電泳檢測(cè) PCR擴(kuò)增目的片段

2.2　目的基因與 pET-32 a +進(jìn)行雙酶切

用EcoRⅠ、HindⅢ組合和KpnⅠ、HindⅢ組合分別完全雙酶切pET-32a+載體,酶切后的pET-32a+載體如圖2所示。

圖2　質(zhì)粒與目的基因的雙酶切結(jié)果

由圖2可知,載體約為5 900bp。用EcoRⅠ、HindⅢ組合完全雙酶切AtbZIP19,用KpnⅠ、HindⅢ組合完全雙酶切AtbZIP23,酶切后電泳條帶如圖2所示。

2.3　目的基因連接轉(zhuǎn)化與菌液 PCR驗(yàn)證

將雙酶回收所得的含有黏性末端的目的基因片段和酶切回收后含有黏性末端的原核表達(dá)載體相連[9],用T4DNA連接酶于25 ℃連接10min,然后立即轉(zhuǎn)化Trans1-T1感受態(tài)細(xì)胞,經(jīng)活化后涂布于含有Amp(100μg/mL) 抗性的LB平板上,陽(yáng)性菌落可在10～12h后長(zhǎng)出。挑取單菌落,置于100μg/mLAmp-LB液體培養(yǎng)基，37 ℃、O/N培養(yǎng)。挑取單菌落于LB中擴(kuò)培,以菌液為模板進(jìn)行菌落PCR,電泳檢測(cè)分析。AtbZIP19和AtbZIP23的菌液PCR結(jié)果如圖3所示,均為陽(yáng)性克隆。

圖3　重組質(zhì)粒菌液 PCR電泳圖

2.4　目的蛋白的表達(dá)

將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21(DE3) 中,經(jīng)1mmol/LIPTG誘導(dǎo)蛋白表達(dá),結(jié)果如圖4所示。

圖4　目的蛋白誘導(dǎo)表達(dá)結(jié)果

SDS-PAGE結(jié)果顯示,經(jīng)IPTG誘導(dǎo)4h后,與空質(zhì)粒相比,含重組質(zhì)粒的菌液出現(xiàn)45.0kDa左右的蛋白條帶,與目的蛋白大小47.1kDa和45.8kDa理論值一致，表明目的蛋白在大腸桿菌中表達(dá)成功。

3討論

植物bZIP轉(zhuǎn)錄因子在植物的生命過(guò)程中具有非常重要的作用,bZIP不僅參與調(diào)控植物的生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程,還參與調(diào)控植物抵抗惡劣的自然環(huán)境, 諸如重金屬脅迫、病原菌的入侵、高鹽、干旱、寒冷等不利條件[10]。AtbZIP19和AtbZIP23基因參與了植物對(duì)逆境脅迫的應(yīng)答調(diào)節(jié),為了更進(jìn)一步地探索這2個(gè)轉(zhuǎn)錄因子參與了哪一個(gè)信號(hào)通路,則需要找到它們作用的下游靶基因。AtbZIP19和AtbZIP23在bZIP家族中有很近的親緣關(guān)系[11],所以可能會(huì)形成二聚體來(lái)增強(qiáng)對(duì)下游靶基因的調(diào)控作用。

本研究獲得目的基因后,構(gòu)建原核表達(dá)重組質(zhì)粒,并在大腸桿菌中成功誘導(dǎo)表達(dá),為后續(xù)的凝膠遷移或電泳遷移率實(shí)驗(yàn)及蛋白相互作用實(shí)驗(yàn)做了基礎(chǔ)工作。同時(shí)該研究也為探索AtbZIP19和AtbZIP23轉(zhuǎn)錄因子參與調(diào)控植物抵抗逆境脅迫時(shí)介導(dǎo)的信號(hào)途徑打下了基礎(chǔ)。

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(責(zé)任編輯閆杏麗)

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