寇氏隱甲藻發(fā)酵產(chǎn)DHA藻油的動(dòng)力學(xué)模型研究

王 澍 曹 維 付 杰 田 華 陳 濤 何東平

寇氏隱甲藻發(fā)酵產(chǎn)DHA藻油的動(dòng)力學(xué)模型研究

王 澍1曹 維1付 杰1田 華1陳 濤2何東平1

（武漢輕工大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院1，武漢 430023）
（中國科學(xué)院武漢病毒研究所2，武漢 430071）

本文利用Logistic方程和Luedeking-Piret方程對(duì)寇氏隱甲藻發(fā)酵產(chǎn)DHA藻油動(dòng)力學(xué)進(jìn)行研究。通過測(cè)定寇氏隱甲藻在50 L發(fā)酵罐中生物量、油脂產(chǎn)量、DHA產(chǎn)量、葡萄糖濃度的變化，建立了菌體生長、產(chǎn)物形成和基質(zhì)消耗的動(dòng)力學(xué)模型，同時(shí)對(duì)試驗(yàn)值與模擬值進(jìn)行了比較，平均相對(duì)誤差大部分小于10%。通過對(duì)發(fā)酵過程的曲線擬合以及模型參數(shù)的計(jì)算，模型相關(guān)指數(shù)分別為：0.993、0.996和0.978，模型模擬計(jì)算結(jié)果與試驗(yàn)值能較好地吻合，說明所建立的發(fā)酵動(dòng)力學(xué)模型能夠較好地反映寇氏隱甲藻的發(fā)酵過程，為其工業(yè)化生產(chǎn)提供科學(xué)依據(jù)。

寇氏隱甲藻 動(dòng)力學(xué)模型 Logistic方程 Luedeking-Piret方程

二十二碳六烯酸（DHA）是一種ω-3系多不飽和脂肪酸（PUFA）。近年來，DHA因?qū)θ梭w健康的突出作用而備受關(guān)注。DHA市場需求量的增大，使得利用海洋微藻和真菌發(fā)酵生產(chǎn)DHA藻油成為當(dāng)前新途徑［1-4］。在眾多海洋異養(yǎng)甲藻中，寇氏隱甲藻現(xiàn)已被確定為DHA的高產(chǎn)藻種之一，可在沒有光照的條件下發(fā)酵培養(yǎng)，從而實(shí)現(xiàn)細(xì)胞的增長和油脂的積累，其細(xì)胞生產(chǎn)的大量油脂中DHA的含量遠(yuǎn)高于其他多不飽和脂肪酸，可以說寇氏隱甲藻在生產(chǎn)DHA藻油方面具有極大優(yōu)勢(shì)［5-8］。

在菌種的發(fā)酵生產(chǎn)過程中，菌體生長、產(chǎn)物積累和底物消耗是最為關(guān)鍵的幾個(gè)因素。發(fā)酵前期的菌體生長和發(fā)酵中后期的產(chǎn)物的積累都取決于發(fā)酵液中底物濃度。而產(chǎn)物的積累同時(shí)也取決于菌體生長狀況。通過對(duì)發(fā)酵過程的動(dòng)力學(xué)模型進(jìn)行研究，可以了解發(fā)酵過程底物、菌體生長和產(chǎn)物積累的相關(guān)關(guān)聯(lián)關(guān)系，可以預(yù)測(cè)發(fā)酵進(jìn)行的程度，估算底物消耗速率，了解產(chǎn)物生成情況［9-10］。

由于Logistic方程和Luedeking-Piret方程能很好地反映菌體生長以及產(chǎn)物形成等情況，且在分批發(fā)酵中應(yīng)用非常廣泛，所以決定采用這2種方程建立模型。在寇氏隱甲藻發(fā)酵的不同時(shí)間段取發(fā)酵液樣品進(jìn)行菌體生物量、油脂產(chǎn)量和葡萄糖濃度的測(cè)定，對(duì)發(fā)酵過程進(jìn)行分析后，用Logistic方程和Luedeking-Piret方程，建立起寇氏隱甲藻發(fā)酵過程中菌體生長、產(chǎn)物形成和基質(zhì)消耗的動(dòng)力學(xué)模型。為寇氏隱甲藻產(chǎn)DHA藻油工業(yè)化生產(chǎn)提供參考。

1 材料與方法

1.1 藻種

ATCC30772寇氏隱甲藻株：廣東微生物菌種保藏中心；2.4k-2A2-5寇氏隱甲藻突變株：經(jīng)過2次60Co-γ射線誘變獲得，本實(shí)驗(yàn)室保存［11］。

1.2 試劑

葡萄糖、氯化鈉、碳酸氫鈉、硫酸鈉：天津博迪化工股份有限公司；酵母膏：北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；谷氨酸鈉：上海如吉生物科技發(fā)展有限公司；硫酸鎂：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；氯化鈷：天津市恒興化學(xué)試劑制造有限公司；正己烷：天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；磷酸二氫鉀、氯化鈣：天津市凱通化學(xué)試劑有限公司；無水乙醇：天津天力化學(xué)試劑有限公司；纖維素酶（10～140萬U／g）、堿性蛋白酶（20萬U／g）：江蘇銳陽生物科技有限公司；所用的試劑均為分析純。

1.3 儀器與設(shè)備

GRJ-50B型發(fā)酵罐：鎮(zhèn)江格瑞生物工程有限公司；Agilent 7890A氣相色譜儀：安捷倫科技（中國）有限公司；SPX-150C恒溫恒濕箱：上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；SW-CJ-1F單人雙面凈化工作臺(tái)：蘇州凈化設(shè)備有限公司；LDZX-75KB立式蒸汽滅菌器：武漢利天科技儀器有限公司；RE-52C旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器：上海亞榮生化儀器廠。

1.4 方法

1.4.1 培養(yǎng)條件

種子培養(yǎng)：從長好藻種的斜面上取一定量純的藻落，接種到一級(jí)種子培養(yǎng)液中，置于搖床上，pH 6.5，26 ℃、180 r／min 條件下培養(yǎng)48 h。

50 L發(fā)酵罐培養(yǎng)：將二級(jí)種子液按10%的接種量接種到50 L發(fā)酵罐中，28℃培養(yǎng)48 h然后降溫到22℃，通氣量30 L／h，190 r／min條件下培養(yǎng)至放罐。

1.4.2 生物量測(cè)定

寇式隱甲藻的生物量以收集的藻體細(xì)胞干重計(jì)。取一定體積的培養(yǎng)液裝入預(yù)先稱重的離心管中，5 000 r／min離心20 min，沉淀用蒸餾水清洗3次，置于干燥箱中，45℃條件下烘干，稱重（至恒重）。

生物量＝干菌體質(zhì)量／發(fā)酵液體積

1.4.3 葡萄糖濃度測(cè)定

吸取5 mL堿性酒石酸銅甲液與5 mL堿性酒石酸銅乙液，置于150 mL錐形瓶中，加10 mL水，加入玻璃珠2粒，從滴定管滴加比預(yù)測(cè)體積少1 mL的試樣溶液至錐形瓶中，使在2 min內(nèi)加熱至沸，保持沸騰繼續(xù)以1滴／2 s的速度滴定，直至溶液藍(lán)色剛好褪去為終點(diǎn)，記錄樣液消耗體積。同法平行操作3份，得出平均消耗體積（如果樣品殘?zhí)菨舛绕?，可先加入一定量的?biāo)準(zhǔn)葡萄糖溶液，再滴加試樣溶液滴定至終點(diǎn)）。

1.4.4 油脂提取

將濕藻體按濕重∶純凈水為1∶1～1∶3的比例，制成懸浮液，加堿性蛋白酶和纖維素酶，（60±1）℃水浴溫培，同時(shí)攪拌8 h，鏡檢藻體破壁后，加入95%乙醇脫水30～60 min，靜置分層，使乙醇-水相與藻泥分層。將乙醇-水相和藻泥分別加入4號(hào)溶劑油，分裝2個(gè)分液漏斗中，靜置分層。取出上層4號(hào)溶劑油藻油相提萃液。反復(fù)浸提，至藻泥變白無油為止。把4號(hào)溶劑油提萃液經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，獲得粗藻油，粗藻油經(jīng)脫膠除雜等過程后獲得金黃色精藻油。

油脂產(chǎn)量＝油脂質(zhì)量／發(fā)酵液體積

1.4.5 DHA產(chǎn)量測(cè)定

藻油脂肪酸甲酯化：取0.1 g油樣，加1 mL苯-石油醚（體積比為1∶1）混合溶劑，再加1 mL 0.4 mol／L的氫氧化鉀-甲醇溶液，搖勻，在室溫下靜置8～10 min，然后加蒸餾水使醚層升至頂部，待液層澄清后即可作色譜分析。

氣相色譜條件：色譜柱：Agilent SP-2560（100 m×25μm，0.2 μm）；升溫程序：100 ℃ 保持4 min，以3 ℃ ／min升溫至230 ℃，保持20 min，載氣（N2）流速25 mL／min，壓力2.4 kPa，進(jìn)樣量1 μL；分流比15∶1。

DHA產(chǎn)量＝油脂產(chǎn)量×DHA含量

1.4.6 數(shù)據(jù)處理

用所得數(shù)值在Logistic方程和Luedeking-Piret方程的基礎(chǔ)上，建立寇氏隱甲藻發(fā)酵過程中菌體生長、基質(zhì)消耗、產(chǎn)物形成的動(dòng)力學(xué)模型。應(yīng)用Orige 8.5軟件處理試驗(yàn)數(shù)據(jù)和模型，擬合出所有模型參數(shù)，建立發(fā)酵動(dòng)力學(xué)數(shù)學(xué)模型。

2 結(jié)果與分析

2.1 寇氏隱甲藻發(fā)酵

寇氏隱甲藻發(fā)酵過程曲線如圖1所示?？苁想[甲藻的生物量、油脂含量、DHA產(chǎn)量、葡萄糖濃度隨發(fā)酵時(shí)間的延長而變化。在最佳發(fā)酵條件的基礎(chǔ)上，進(jìn)行發(fā)酵代謝過程研究，發(fā)酵時(shí)間設(shè)定為120 h。發(fā)酵0～24 h為生長延遲期，菌體濃度增長緩慢，油脂和DHA開始積累。發(fā)酵24～96 h為對(duì)數(shù)期，菌絲體生長迅速，還原糖大幅度下降，油脂和DHA快速積累。發(fā)酵96 h后，菌體的生物量和DHA產(chǎn)量基本趨于穩(wěn)定，菌體生物量在120 h時(shí)達(dá)到最大值為61.30 g／L，此時(shí)，菌體中油脂產(chǎn)量高達(dá)27.31 g／L。由圖1可知，其油脂合成和菌體生長呈部分相關(guān)。

圖1 寇氏隱甲藻的發(fā)酵過程曲線

2.2 寇氏隱甲藻生長模型

菌體生長動(dòng)力學(xué)最常用方程有Mond方程和Logistic方程［12］。由于Mond方程是理想化模型有一定的局限性，而Logistic方程是一個(gè)典型的S型曲線，能很好地反映發(fā)酵過程中普遍存在的菌體濃度增加對(duì)自身生長的抑制作用，所以采用Logistic方程構(gòu)建菌體生長動(dòng)力學(xué)模型較為合適，Logistic方程為：

以方程（2）對(duì)圖1中的菌體生物量試驗(yàn)值進(jìn)行非線性擬合，可以求得參數(shù)μmax＝0.112，Cx，o＝0.54，Cx1max＝61.30，代入方程（2）可得：

根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果，以菌體生物量Cx對(duì)生長時(shí)間t作圖。從圖2可知，該模型的擬合值和試驗(yàn)值基本一致，相關(guān)系數(shù)R2＝0.993，說明此模型能較好地反映寇氏隱甲藻的生長過程。

圖2 菌體生長的發(fā)酵試驗(yàn)值與模型擬合值的比較

2.3 產(chǎn)物形成模型

由圖1可以看出油脂的合成與菌體生長沒有直接相關(guān)性，即油脂的合成與菌體生長屬于部分耦聯(lián)關(guān)系，因此選用Luedeking-Piret方程來描述寇氏隱甲藻發(fā)酵過程中油脂合成規(guī)律，它可以同時(shí)反映與菌體生長耦聯(lián)的產(chǎn)物形成的速率，也可反映獨(dú)立于菌體的通過細(xì)胞催化形成產(chǎn)物的速度，該模型可以適用于一般的發(fā)酵過程，即：

式中：α，β為模型參數(shù)，P為油脂質(zhì)量分?jǐn)?shù)／%，當(dāng)t＝0時(shí)，P0＝0。

將方程（1）代入方程（4）得：

把方程（2）代入方程（5）積分得：

以方程（6）進(jìn)行擬合，求得方程參數(shù)α＝0.269 7，β ＝0.002 5，代入方程（6）中，寇氏隱甲藻發(fā)酵過程中油脂合成模型如下：

從圖3可知，該模型的擬合值和試驗(yàn)值基本吻合，模型的相關(guān)系數(shù)R2＝0.996，說明此模型較好的反映了寇氏隱甲藻發(fā)酵過程中的油脂積累過程。

圖3 菌體發(fā)酵過程中油脂產(chǎn)量試驗(yàn)值與模型擬合值的比較

2.4 底物消耗模型

菌體發(fā)酵過程中，底物的消耗一方面用于細(xì)胞的增殖，另一方面則用于產(chǎn)物的合成及其代謝，因此，底物消耗速度可由Luedeking-Piret-Like方程表示：

式中：Yx／s為對(duì)底物菌體生長的得率系數(shù)，g（菌體干重）／g（葡萄糖）；Yp／s為對(duì)底物產(chǎn)物的得率系數(shù)，g（產(chǎn)物）／g（葡萄糖）。ms為葡萄糖用于維持細(xì)胞生命常數(shù)，g（葡萄糖）／g（菌體干重）／h。

將方程（1）、方程（4）代入方程（8）中，積分整理可得：

按方程（9）對(duì)發(fā)酵過程中的葡萄糖濃度試驗(yàn)值進(jìn)行非線性擬合，得到基質(zhì)消耗量關(guān)于時(shí)間的方程：

根據(jù)方程（10）將模型擬合值和實(shí)際值進(jìn)行比較（見圖4），除個(gè)別點(diǎn)外，擬合值和實(shí)際值基本吻合，模型的相關(guān)系數(shù)R2＝0.978，說明此模型能較好反映寇氏隱甲藻的底物消耗過程。

圖4 菌體發(fā)酵過程中底物消耗試驗(yàn)值與模型擬合值的比較

2.5 模型驗(yàn)證

為了檢驗(yàn)?zāi)Ｐ驼`差，在同等發(fā)酵條件下進(jìn)行3個(gè)批次試驗(yàn)，所得數(shù)據(jù)取平均值，與動(dòng)力學(xué)模型的模擬值進(jìn)行比較，得出細(xì)胞生長、油脂形成及葡萄糖消耗的理論值與試驗(yàn)值的平均相對(duì)偏差分別為4.04%、3.66%和4.57%?？苁想[甲藻發(fā)酵動(dòng)力學(xué)模型的誤差檢驗(yàn)的詳細(xì)結(jié)果見表1。

表1 試驗(yàn)值與預(yù)測(cè)模擬值的比較

由表1可知，模型預(yù)測(cè)值與試驗(yàn)值符合得較好，平均相對(duì)誤差大部分小于10%。該結(jié)果表明，所建立的動(dòng)力學(xué)模型能較好的描述寇氏隱甲藻發(fā)酵過程中菌體生長、產(chǎn)物形成及底物消耗的變化規(guī)律。

3 結(jié)論

微生物反應(yīng)過程是非常復(fù)雜的體系，關(guān)系到發(fā)酵培養(yǎng)基中的營養(yǎng)成分、培養(yǎng)溫度、通氣量等條件，對(duì)其進(jìn)行精確描述幾乎是不可能的。因此，在發(fā)酵過程中建立機(jī)制模型要進(jìn)行合理的簡化，采用均衡生長的非結(jié)構(gòu)模型。即在細(xì)胞的生長過程中，細(xì)胞內(nèi)各種成分均以相同的比例增加，菌體為單組分，不考慮環(huán)境對(duì)菌體組成的影響，采用較為簡化的方式，對(duì)關(guān)鍵變量進(jìn)行考慮，忽略次要因素，并據(jù)此建立較為簡便，便于分析驗(yàn)證，易實(shí)現(xiàn)計(jì)算自動(dòng)化的數(shù)學(xué)模型［13-14］。

研究結(jié)果表明，在發(fā)酵前期，油脂的增長趨勢(shì)明顯滯后于菌體細(xì)胞生長，此時(shí)葡萄糖消耗不大，但底物消耗的模擬值與試驗(yàn)值有較小的偏差，可能是發(fā)酵初期，罐內(nèi)攪拌不均勻?qū)е碌?。菌體細(xì)胞生長進(jìn)入穩(wěn)定期后，生物量快速增長，葡萄糖的大量消耗使得油脂產(chǎn)量顯著提高，當(dāng)生物量趨于穩(wěn)定時(shí)，油脂繼續(xù)合成，由此認(rèn)為寇氏隱甲藻發(fā)酵生產(chǎn)DHA藻油分為菌體生長和產(chǎn)物合成2個(gè)階段，產(chǎn)物合成屬于部分生長耦聯(lián)型。

通過對(duì)發(fā)酵過程的曲線擬合以及模型參數(shù)的計(jì)算，模型相關(guān)指數(shù)分別為：0.993、0.996和0.978，說明所構(gòu)建的模型與實(shí)際生長情況吻合度較好，模型的計(jì)算結(jié)果在一定程度上揭示了寇氏隱甲藻發(fā)酵代謝的動(dòng)力學(xué)特征，可用來預(yù)測(cè)發(fā)酵體系中產(chǎn)物的合成和底物的濃度，制定補(bǔ)料工藝，優(yōu)化發(fā)酵工藝參數(shù)，實(shí)現(xiàn)發(fā)酵過程的集約化，為工業(yè)化生產(chǎn)提供參考。

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Study on Fermentation Kinetics for DHA Algae Oil Production by Crypthecodinium Cohnii

Wang Shu1Cao Wei1Fu Jie1Tian Hua1Chen Tao2He Dongping1
（School of Food Science and Engineering，Wuhan Polytechnic University1，Wuhan 430023）
（Wuhan Insitute of Virology，Chinese Academy of Sciences2，Wuhan 430071）

The fermentation process of DHA algae oil production by Crypthecodinium Cohnii was studied，based on Logistic equation and Luedeking-Piret equation.The biomass，the yield of oil and DHA and change of glucose concentration were determined using Crypthecodinium Cohnii in 50 L fermentation tank，based on which the kinetic models for thallus growth，oil production and substrate consumption were established，and the predictive values of models were compared with the experimental data，as a result，the average relative errors were less than 10%.Through the calculation of fermentation process curve fitting and model parameters，the related index of the model were 0.993，0.996 and 0.978，respectively，which showed they matched well.The result showed that the models could provide a reasonable description for the fermentation process of Crypthecodinium Cohnii，thus providing a theoretical basis for the industrial production of DHA.

Crypthecodinium cohnii，kinetic models，logistic equation，luedeking-piret equation

Q93-335

A

1003-0174（2016）09-0081-05

糧食公益性行業(yè)科研專項(xiàng)（201313012-03），十二五國家科技支撐計(jì)劃（2011BAD02B00）

2015-01-04

王澍，男，1989年出生，碩士，微生物油脂

何東平，男，1957年出生，教授，糧食、油脂及植物蛋白