酸漿水中3種菌株的產(chǎn)酸能力及抗氧化活性

劉 力 李 理

(華南理工大學(xué)輕工與食品學(xué)院，廣東廣州 510640)

豆腐黃漿水為豆腐制作過程中產(chǎn)生的黃色瀝水，含有大量水蘇糖、棉子糖等低聚糖，同時還含有蛋白質(zhì)、大豆異黃酮及維生素P、K等營養(yǎng)物質(zhì)，非常適合微生物的生長［1－3］。豆腐黃漿水在存貯的過程中自然發(fā)酵成為酸漿水，是一種良好的豆腐凝固劑，已在腐乳行業(yè)廣泛應(yīng)用［4］。自然發(fā)酵的酸漿中含有大量的乳酸菌、酵母及其他微生物，其中也可能含有有害微生物如蠟樣芽孢桿菌［4］，因此，采用純種發(fā)酵制備有利于提高酸漿的品質(zhì)及安全性。

本課題組前期研究了鼠李糖乳桿菌和嗜酸乳桿菌發(fā)酵豆腐黃漿水并取得了良好的效果［5］，考慮到自然發(fā)酵形成的酸漿中可能包含有性能更優(yōu)越的菌種，近期又研究了酸漿水中的微生物，并從中分離出2株解淀粉乳桿菌(Lactobacillus amylolyticus L5、Lactobacillus amylolyticus L6)［6，7］和 1 株阿米塞畢赤氏酵母(Pichia amethionina Y)。本研究探討了3個菌株單菌、或者組合發(fā)酵豆腐黃漿水的產(chǎn)酸能力，以及酸漿水的抗氧化能力。另外，考慮到豆腐黃漿水中富含異黃酮［1，2］，且乳酸菌發(fā)酵能增強食物體系的抗氧化能力［8］，本研究分別應(yīng)用FRAP法、DPPH法以及螯合Fe2+相結(jié)合的方法［9］從不同的方面研究和評價酸漿水的抗氧化活性，為綜合利用豆腐黃漿水提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

改良MRS液體培養(yǎng)基:牛肉膏10 g，蛋白胨10 g，酵母浸粉 5 g，葡萄糖 20 g，吐溫-80 1 mL，K2HPO4·3H2O 2 g，NaAc·3H2O 5 g，檸檬酸氫二銨2 g，MgSO4·7H2O 0 .58 g，MnSO4·H2O 0.25 g;加蒸餾水定容到1 L，pH 6.4 ±0.2，121 ℃滅菌15 min。

豆腐黃漿水:從廣東某腐乳廠采集;

菌種:Lactobacillus amylolyticus L5菌種保藏號為CGMCC NO.9371，Lactobacillus amylolyticus L6 保藏號為 CGMCC NO.9090，分離源為自然發(fā)酵的豆腐酸漿，經(jīng)16SrDNA分子鑒定確定菌種名;Pichia amethionina Y，分離源為同一自然發(fā)酵的豆腐酸漿，經(jīng)26SrDNA分子鑒定及生理生化試驗確定菌種名;

TPTZ、DPPH、菲洛嗪和生育酚:美國Sigma公司;

其他試劑:均為國產(chǎn)分析純;

pH計:PHS-3C型，上海精密科學(xué)儀器有限公司;

紫外分光光度計:UV230型，上海天美科學(xué)儀器有限公司;

電子天平:AL204-IC型，梅特勒—托利多儀器(上海)有限公司;

立式壓力蒸汽滅菌器:LDZX-30KBS型，上海申安醫(yī)療器械廠;

超凈工作臺:SZX型，吳江凈化設(shè)備總廠;

電熱恒溫培養(yǎng)箱:DHP-9052型，上海申賢恒溫設(shè)備廠;

高速冷凍離心機:CR22G型，日本日立公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 發(fā)酵劑的制備 在無菌環(huán)境下把活化好的解淀粉乳桿菌Lactobacillus amylolyticus L5、L6以及阿米塞畢赤氏酵母Pichia amethionina Y分別接入到121℃滅菌15 min的MRS液體培養(yǎng)基中和115℃滅菌15 min的麥芽汁液體培養(yǎng)基中，35℃培養(yǎng)24 h后即為母發(fā)酵劑。母發(fā)酵劑在豆腐黃漿水培養(yǎng)基(豆腐黃漿水經(jīng)8 000×g離心10 min去除不溶物即得)中轉(zhuǎn)接2～3次即可作為工作發(fā)酵劑。

1.2.2 阿米塞畢赤氏酵母、解淀粉乳桿菌及其復(fù)合模式發(fā)酵豆腐黃漿水樣品的制備 豆腐黃漿水經(jīng)8 000×g離心10 min去除不溶物后，分裝于1.8 cm×20 cm試管中，使液體高度達到18 cm，用橡膠塞緊塞，作為培養(yǎng)基。121℃滅菌15 min，在無菌環(huán)境中按6%(V/V)的添加量分別接入解淀粉乳桿菌L5、L6和阿米塞畢赤氏酵母Y的工作發(fā)酵劑，編號分別標為L5，L6，Y。酵母菌和解淀粉乳桿菌復(fù)合發(fā)酵豆腐黃漿水的樣品標號分別為L5+Y(3%L5+3%Y)、L6+Y(3%L6+3%Y)、L5+L6+Y(2%L5+2%L6+2%Y)。在 35℃下恒溫培養(yǎng) 0，12，24，36，48，60 h 后。放置于 －20 ℃冰箱中待用。

1.2.3 pH值和酸度值的測定 使樣品恢復(fù)室溫，直接用測定樣品的pH值;采用GB 5413.34—2010方法測定酸度值，用涅爾度(oT)表示。

1.2.4 酸漿水對Fe3+的還原能力(FRAP) 根據(jù)文獻［10］略有改動。使用0.04 mol/L的HCl溶液配制TPTZ溶液(10 mmol/L)。將2.5 mL 的 TPTZ 溶液，2.5 mL 的 FeCl3溶液(20 mmol/L)和25 mL的乙酸鹽緩沖液(300 mmol/L，pH 3.6)混合，制備得到FRAP溶液。取100 μL各類樣品加入3 mL的FRAP溶液，在37℃下靜置10 min，于8 000×g離心10 min，于593 nm處測定吸光度值。將生育酚(Trolox)作為標準物質(zhì)。通過標準曲線 y=0.001 1x+0 .068 7，r2=0.999 3(y.吸光值;x.Trolox濃度，mmol)將酸漿水還原Fe3+的能力表示為mmol Trolox/mL樣品。

1.2.5 酸漿水清除DPPH·自由基能力 根據(jù)文獻［11］略有改變。分別取各類樣品2 mL與2 mL DPPH(0.2 mmol/L，無水乙醇)溶液充分混合。在黑暗室溫條件下反應(yīng)30 min后，于8 000×g離心10 min，期間注意避光。在517 nm處測定吸光值。去離子水作為對照，生育酚(Trolox)作為標準物質(zhì)。通過標準曲線 y= －0.012 6x+1.096 2，r2=0.999 6(y.吸光值;x.Trolox濃度，μmol)將酸漿水清除DPPH·自由基能力表示為μmol Trolox/mL樣品。

1.2.6 酸漿水對Fe2+的螯合作用 根據(jù)文獻［12］略有改動。樣品經(jīng)過8 000×g離心10 min，量取3 mL各類樣品，與50 μL現(xiàn)配FeCl2(2 mmol/L)水溶液充分混勻，室溫下靜置1 min。加入100 μL的菲咯嗪溶液(5 mmol/L)混合均勻。去離子水作為對照，在室溫下反應(yīng)20 min，562 nm測定吸光值。樣品的Fe2+螯合能力表示為螯合率，按式(1)計算:

式中:

C——螯合 Fe2+能力，%;

Ac、Asi——分別為對照樣和各類樣品的吸光值;

Ai——不添加菲咯嗪時各類樣品的吸光度值。

1.2.7 數(shù)據(jù)處理與分析 采用SPSS 17.0軟件分析處理試驗數(shù)據(jù)。試驗數(shù)據(jù)表示為“平均值±標準偏差”的形式，顯著性差異設(shè)置水平為P=0.05。

2 結(jié)果與討論

2.1 酸漿水的酸度和pH

由圖1、2可知，在單菌種發(fā)酵模式下，解淀粉乳桿菌L5和L6均可發(fā)酵豆腐黃漿水產(chǎn)酸，其中L6的產(chǎn)酸更強，而阿米塞畢赤氏酵母Y基本不產(chǎn)酸。解淀粉乳桿菌L5、L6在發(fā)酵豆腐黃漿水初期的12 h內(nèi)(35℃)，菌種處于對數(shù)生長期，產(chǎn)酸能力強，pH值下降快，隨著發(fā)酵時間的延長，產(chǎn)酸速率有所下降，L5在發(fā)酵48 h時產(chǎn)酸量達到最大，其后趨于平穩(wěn);L6的產(chǎn)酸能力更強，酸度值一直處于上升的趨勢，在發(fā)酵60 h后酸漿的pH為3.74，酸度值達到65.11oT。由此可見，這2株解淀粉乳桿菌在沒有補充任何營養(yǎng)成分的情況下［5］，能夠在豆腐黃漿水中迅速生長產(chǎn)酸，具有很好的應(yīng)用前景。對于乳酸菌而言，pH值下降可能是菌株代謝活性和生長的需要［13］，但對于酸漿水來說，pH值的下降可以抑制腐敗菌和病原微生物的生長［5］，對酸漿的安全性具有重要意義。

圖1 酸漿水的酸度值Figure 1 The titratable acidity of fermented tofu whey

圖2 酸漿水的pH值Figure 2 The pH of fermented tofu whey

由于阿米塞畢赤氏酵母不產(chǎn)酸，因此L5+Y以及L6+Y這樣的雙菌種組合發(fā)酵豆腐黃漿水的產(chǎn)酸能力下降是可以理解的。但值得關(guān)注的是，L5+L6+Y這樣3個菌株的組合在發(fā)酵豆腐黃漿水48 h時，其產(chǎn)酸仍然持續(xù)增加，接近或超過L5和L6的產(chǎn)酸能力，在發(fā)酵60 h時其酸度值達到65.44oT，超過單菌種發(fā)酵的酸度值，表明菌種L5和L6之間可能存在一種共生作用，需要進一步研究。

2.2 酸漿水的抗氧化活性

2.2.1 還原Fe3+的能力(FRAP) 在低pH條件下，抗氧化物質(zhì)可以把復(fù)合物Fe3+—TPTZ還原為Fe2+—TPTZ，同時會顯示深藍色，在593 nm處有最大的吸收峰［10］，該FRAP方法快速、簡單，結(jié)果重現(xiàn)性好，與抗氧化物質(zhì)的摩爾濃度有較強的線性關(guān)系。由表1可知，在單菌株發(fā)酵模式下，豆腐黃漿水經(jīng)解淀粉乳桿菌以及阿米塞畢赤氏酵母發(fā)酵后，其還原Fe3+的能力均顯著增強;在組合發(fā)酵模式下，酸漿水還原Fe3+的能力優(yōu)于單菌種發(fā)酵模式，其中L5+L6+Y組合發(fā)酵制備的酸漿水擁有最強的還原Fe3+能力，35℃發(fā)酵24 h后達到5.53 mmol Trolox/mL，此后繼續(xù)發(fā)酵則還原Fe3+能力逐漸回落。由此可見，解淀粉乳桿菌及阿米塞畢赤氏酵母發(fā)酵豆腐黃漿水均可顯著增強其還原能力。

表1 酸漿水還原Fe3+的能力Table 1 Iron(III)-reducing power of fermented tofu whey (mmol Trolox·mL－1)

表1 酸漿水還原Fe3+的能力Table 1 Iron(III)-reducing power of fermented tofu whey (mmol Trolox·mL－1)

不同大寫字母表示同行數(shù)據(jù)之間差異顯著(P＜0.05);不同小寫字母表示同列數(shù)據(jù)之間差異顯著(P＜0.05)。

時間樣品0 h 24 h 48 h L5 4.56 ±0.05Ca 4.68 ±0.04Bd 4.99 ±0.06Ad L6 4.76 ±0.11Ba 4.93 ±0.05Ac 5.02 ±0.05Ad Y 4.71 ±0.08Ba 4.84 ±0.05Bc 5.14 ±0.10Ac L5+Y 4.58 ±0.01Ca 5.21 ±0.04Ab 5.10 ±0.04Bc L6+Y 4.70 ±0.08Ba 5.29 ±0.07Ab 5.22 ±0.05Ab L5+L6+Y 4.66 ±0.11Ba 5.53 ±0.06Aa 5.44 ±0.06Aa

從已有的報道［13－16］來看，很多菌種都可以通過發(fā)酵作用增強豆類制品的抗氧化能力，如黑豆經(jīng)過曲霉、芽孢桿菌和酵母發(fā)酵后其還原Fe3+的能力明顯提高［14］，鷹嘴豆經(jīng)冬蟲夏草發(fā)酵后其還原Fe3+的能力也明顯提高［15］。Vadivel等［16］認為還原Fe3+能力的增加與總的游離多酚物質(zhì)含量增加有關(guān)，游離多酚含量越高，生成的Fe2+—TPTZ復(fù)合物越多。Xiao等［13］的研究發(fā)現(xiàn)，當應(yīng)用植物乳桿菌發(fā)酵豆腐黃漿水時，酸漿水中苷元型異黃酮含量以及總酚明顯增加，且其還原Fe3+的能力也明顯增強。由此可見，解淀粉乳桿菌和阿米塞畢赤氏酵母可能都有釋放游離酚的能力。

2.2.2 酸漿水清除DPPH自由基能力 由表2可知，在單菌種發(fā)酵模式下，解淀粉乳桿菌發(fā)酵豆腐黃漿水對增強清除DPPH自由基能力沒有顯著效果，但豆腐黃漿水經(jīng)過阿米塞畢赤氏酵母Y發(fā)酵以后，清除DPPH自由基能力顯著提高，擁有最強的清除DPPH自由基能力，35℃發(fā)酵48 h后，達到38.49 μmol Trolox/mL;在多菌種組合發(fā)酵模式下，酸漿水清除DPPH自由基的能力均有所增強，且隨著發(fā)酵時間的延長，清除能力增強，其中，L5+Y組合發(fā)酵制備的酸漿水擁有較強的清除DPPH自由基的能力。綜合比較，解淀粉乳桿菌對提高豆腐黃漿水清除DPPH自由基的能力不顯著，阿米塞畢赤氏酵母發(fā)酵豆腐黃漿水能夠顯著提高其清除DPPH自由基的能力，多菌種組合發(fā)酵模式下清除能力有所下降。

表2 酸漿水清除DPPH自由基的能力Table 2 DPPH radical scavenging activities of fermented tofu whey (μmol Trolox·mL－1)

不同大寫字母表示同行數(shù)據(jù)之間差異顯著(P＜0.05);不同小寫字母表示同列數(shù)據(jù)之間差異顯著(P＜0.05)。

時間樣品0 h 24 h 48 h L5 32.38 ±0.10Ac 32.22 ±0.18Ae 31.84 ±0.06Bf L6 32.64 ±0.05Bc 32.80 ±0.10ABd 32.95 ±0.13Ae Y 34.19 ±0.08Ca 36.65 ±0.14Ba 38.49 ±0.14Aa L5+Y 34.03 ±0.15Ba 34.20 ±0.18Bb 36.54 ±0.20Ab L6+Y 33.31 ±0.14Cb 33.82 ±0.14Bc 34.94 ±0.17Ad L5+L6+Y 33.49 ±0.08Cb 34.11 ±0.14Bb 35.87 ±0.08Ac

有研究［17］指出，清除DPPH自由基的能力與化學(xué)物質(zhì)自身的組成和結(jié)構(gòu)有很大關(guān)系，分子大小合適、含有羥基基團、能夠提供電子的抗氧化物質(zhì)，可以快速地清除DPPH自由基。陳歷水等［18］的研究表明，畢赤氏酵母細胞具有較好的清除DPPH自由基能力;酵母細胞本身所含有的抗氧化物質(zhì)(如SOD酶和CAT酶等)、分泌的一些能抑制氧化的物質(zhì)以及其細胞壁上的多糖蛋白均具有較好的抗氧化能力［19］。

2.2.3 螯合Fe2+的能力 有研究［20］表明，過渡金屬參與生物體內(nèi)的多種氧化反應(yīng)，如Fe2+可以誘導(dǎo)超氧陰離子形成危害更大的羥基自由基，通過抗氧化物質(zhì)螯合金屬離子被認為是清除羥基自由基最有效的方式。由表3可知，在單菌種發(fā)酵模式下，L6和Y發(fā)酵制備的酸漿水對Fe2+的螯合能力隨著發(fā)酵時間的延長而增強，其中L6發(fā)酵制備的酸漿水表現(xiàn)出最強的螯合Fe2+能力，螯合率達到54.45%。值得關(guān)注的是，L5雖然也是解淀粉乳桿菌，但其發(fā)酵制備的酸漿水螯合Fe2+的能力卻隨著發(fā)酵時間的延長而降低，表現(xiàn)出與L6完全不同的結(jié)果。在多菌種組合發(fā)酵模式條件下，L5+L6+Y發(fā)酵制備的酸漿水的螯合力并不比L6+Y發(fā)酵制備的酸漿水螯合力差，表明L6和L5之間可能有某種共生或互生關(guān)系。螯合Fe2+能力的強弱與化合物的結(jié)構(gòu)有很大的關(guān)系，結(jié)構(gòu)中含有兩個或多個羥基、羰基、巰基、羧基等官能團時，螯合金屬離子的能力會顯著增強［17］，解淀粉乳桿菌L6和L5在螯合Fe2+方面表現(xiàn)出的截然不同的能力有待進一步的研究，可能與這兩個菌種對豆腐黃漿水中抗氧化物質(zhì)的生物轉(zhuǎn)換能力不同有關(guān)。

表3 酸漿水螯合Fe2+的能力Table 3 Iron(II)-chelating power of fermented tofu whey Chelation rate %

表3 酸漿水螯合Fe2+的能力Table 3 Iron(II)-chelating power of fermented tofu whey Chelation rate %

不同大寫字母表示同行數(shù)據(jù)之間差異顯著(P＜0.05);不同小寫字母表示同列數(shù)據(jù)之間差異顯著(P＜0.05)。

時間樣品0 h 24 h 48 h L5 35.33 ±1.53Aa 21.54 ±0.25Bf 15.11 ±0.21Ce L6 34.95 ±0.30Cab 51.21 ±0.18Ba 54.45 ±0.36Aa Y 34.72 ±0.86Bab 38.72 ±0.45Ac 39.00 ±0.25Ac L5+Y 35.46 ±0.32Aab 31.35 ±0.30Be 24.56 ±0.43Cd L6+Y 34.32 ±1.02Cb 36.44 ±0.60Bd 44.75 ±0.85Ab L5+L6+Y 34.31 ±0.18Bb 44.33 ±0.23Ab 44.17 ±0.24Ab

綜合抗氧化試驗結(jié)果，豆腐黃漿水本身就具有抗氧化能力，這主要是由于豆腐黃漿水中富含異黃酮、小分子蛋白、低聚糖等抗氧化成分，而發(fā)酵作用可促進糖苷型大豆異黃酮轉(zhuǎn)化為活性更強的游離苷元型大豆異黃酮，從而提高酸漿水的抗氧化活性［13］，不過，不同的菌種在抗氧化能力方面表現(xiàn)出較大的差異。

由于解淀粉乳桿菌L5和L6發(fā)酵豆腐黃漿水具有優(yōu)越的產(chǎn)酸能力，同時L5+L6+Y組合發(fā)酵制備的酸漿水具有良好的抗氧化活性，因此，不僅可以利用解淀粉乳桿菌和阿米塞畢赤氏酵母發(fā)酵制備豆腐凝固劑，也可以利用這種發(fā)酵作用制備風(fēng)味良好的功能性飲料。

3 結(jié)論

(1)解淀粉乳桿菌L5和L6均可在天然的豆腐黃漿水中生長產(chǎn)酸，其中菌株L6的發(fā)酵產(chǎn)酸能力更強，35℃發(fā)酵60 h后，酸度達到65.11oT，此外，3個菌株組合發(fā)酵時也有較強的產(chǎn)酸能力，在發(fā)酵60 h后，酸度也達到65.44oT，可根據(jù)生產(chǎn)實際選擇不同的菌種來制備豆腐凝固劑。

(2)豆腐黃漿水經(jīng)過解淀粉乳桿菌L6發(fā)酵后，還原Fe3+的能力和清除DPPH自由基的能力略有增加，但螯合Fe2+的能力顯著增強，在發(fā)酵48 h時達到54.45%;與L6不同，解淀粉乳桿菌L5發(fā)酵制備的酸漿水螯合Fe2+的能力隨著發(fā)酵時間延長而明顯下降;阿米塞畢赤氏酵母Y發(fā)酵制備的酸漿水具有良好的還原Fe3+的能力、清除DPPH自由基的能力以及螯合Fe2+的能力;當3個菌株組合發(fā)酵時，其產(chǎn)酸能力以及酸漿水還原Fe3+的能力、清除DPPH自由基的能力和螯合Fe2+的能力均比L6+Y雙菌株發(fā)酵制備的酸漿水強，菌株之間可能有一定的相互促進作用。

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