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    三裂鼠尾草素在CIK 細(xì)胞增殖及其胃癌細(xì)胞殺傷中的作用

    2015-12-31 09:11:50王軍生吳克儉劉軍權(quán)陳復(fù)興陳永強(qiáng)顏學(xué)兵
    關(guān)鍵詞:靶細(xì)胞鼠尾草胃癌

    王軍生,吳克儉,劉軍權(quán),陳復(fù)興,陳永強(qiáng),周 燏,顏學(xué)兵

    徐州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院消化內(nèi)科,江蘇 徐州221006

    胃癌是目前最常見的惡性腫瘤之一,嚴(yán)重威脅人類健康,腫瘤過繼細(xì)胞免疫治療成為治療胃癌的新途徑之一,其主要是利用腫瘤患者的自身免疫細(xì)胞達(dá)到治療的目的[1]。細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷細(xì)胞(cytokineinduced killer cells,CIK)是一種重要的免疫效應(yīng)細(xì)胞,具有抗腫瘤活性。但如何獲得足夠數(shù)量并具有高活性的CIK 細(xì)胞已成為治療有效與否的關(guān)鍵[2]。三裂鼠尾草素(Salvigenin)有促進(jìn)細(xì)胞凋亡、免疫調(diào)節(jié)功能,具有抗炎、抗氧化、抗腫瘤等多種藥理活性[3]。本實驗通過觀察三裂鼠尾草素對CIK 細(xì)胞增殖及對胃癌細(xì)胞SGC-7901 殺傷活性的影響,進(jìn)而探討其可能的機(jī)理。

    1 材料與方法

    1.1 材料 主要試劑:人胃癌SGC-7901 細(xì)胞株(上海細(xì)胞研究所);PerCP-Cy 5.5 標(biāo)記的CD3 抗體和FITC 標(biāo)記的CD56 抗體、PE 標(biāo)記的穿孔素(Perforin,PFP)、顆粒酶B(GranzymeB,GraB)和APC 標(biāo)記的CD107a 抗體(杭州聯(lián)科生物公司);IL-15 和IL-21(R&D 公司);CD3 mAb(上海免疫研究所);CD28 mAb(蘇州大學(xué)生物技術(shù)研究所);鼠抗人β-catetin、PERK1/2,兔抗人Bcl-2 和P-AKT 抗體(CST 公司)。

    1.2 方法

    1.2.1 CIK 細(xì)胞的培養(yǎng):取健康者外周抗凝血100 ml,分離得到單個核細(xì)胞,調(diào)整細(xì)胞數(shù)為5 ×108/L,加入PPMI 1640 培養(yǎng)液,接種于6 孔細(xì)胞培養(yǎng)板,每孔5 μl,置37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h 后收集細(xì)胞,調(diào)整細(xì)胞數(shù)為5 ×108/L,用PPMI 1640 完全培養(yǎng)液接種于6 孔板,于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng),每2 d 換培養(yǎng)基(含IL-15、IL-21、CD28)1 次,采用FCM檢測CIK 細(xì)胞表型CD3+CD56+表達(dá)。

    1.2.2 CCK8 法檢測三裂鼠尾草素對CIK 細(xì)胞生長的影響:收集培養(yǎng)10 d 的CIK 細(xì)胞,1 ×108/L 細(xì)胞數(shù)接種于96 孔板,200 μl/孔,加入三裂鼠尾草素[終濃度為0(空白對照組)、0.1、0.2、0.4、0.8、1.6、3、6、12.8、25.6、51.2、102.4、204.8、409.6、819.2、1 638.4 pmol/L],孵育24、48、72 h 后,加入CCK8,孵育后,于酶標(biāo)儀450 nm處檢測各孔吸光值(OD)。

    1.2. 3 FCM 檢測三裂鼠尾草素對CIK 細(xì)胞中CD107a、GraB 和PFP 表達(dá)的影響:收集培養(yǎng)10 d CIK細(xì)胞分別接種于6 孔板,加入三裂鼠尾草素[終濃度分別為0(空白對照組)、0.4、1.6、6.4、25.6、102.4 pmol/L],F(xiàn)CM 檢測CD107a、GraB 和PFP 的含量。

    1.2.4 LDH 釋放法檢測CIK 細(xì)胞殺傷活性:按已建立的LDH 釋放法[4]進(jìn)行檢測。收集培養(yǎng)10 d 的CIK細(xì)胞,加入三裂鼠尾草素(終濃度分別為0、0.4、1.6、6.4、25.6、102.4 pmol/L),同時設(shè)FCM 檢測CIK 細(xì)胞表型CD3+CD56+表達(dá)FCM 檢測CIK 細(xì)胞表型CD3+CD56+表達(dá),取胃癌SGC-7901 細(xì)胞株,使效應(yīng)細(xì)胞和靶細(xì)胞比例為10∶1,按LDH 試劑盒說明書要求操作,在生化分析儀340 nm 處測定吸光度值(A)。

    1.2.5 Western blotting:Western blotting 檢測三裂鼠尾草素作用前后CIK 細(xì)胞β-catetin、P-ERK1/2 和PAKT 的表達(dá)。

    1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 13.0 軟件進(jìn)行單因素方差分析,P <0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

    2 結(jié)果

    2.1 CIK 細(xì)胞的培養(yǎng) 培養(yǎng)前,外調(diào)血單位核細(xì)胞(peripheral blood monouclear cells,PBMC)中CD3+CD56+T 細(xì)胞比例<4%,培養(yǎng)10 d 后CD3+CD56+T細(xì)胞比例增至45.20%,與培養(yǎng)前比較,顯微鏡觀察可見培養(yǎng)第10 天的CIK 細(xì)胞,細(xì)胞體積增大,呈圓形或橢圓形,包膜光滑,細(xì)胞數(shù)量增多,部分形成集落,F(xiàn)CM檢測CIK 細(xì)胞表型CD3+CD56+表達(dá)如圖1 所示。

    2.2 CCK8 檢測結(jié)果 相同濃度的三裂鼠尾草素作用后,48 h 時CIK 細(xì)胞增殖達(dá)最高峰,與24 h、72 h 組比較,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P <0.05);與對照組比較,濃度為1.6 ~204.8 pmol/L 的三裂鼠尾草素誘導(dǎo)CIK細(xì)胞24 h、48 h、72 h 后,CIK 細(xì)胞增殖明顯(P <0.05);三裂鼠尾草素濃度為409.2 ~1 638.4 pmol/L時,CIK 細(xì)胞增殖率為負(fù)值,與對照組相比,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P <0.05,見圖2)。

    圖1 CIK 細(xì)胞的培養(yǎng):擴(kuò)增前和擴(kuò)增第10 天CIK 細(xì)胞FCM分析Fig 1 The cultivation of CIK cells:before the amplification and the FCM analysis of CIK cells on the tenth day

    圖2 三裂鼠尾草素對CIK 細(xì)胞增殖率的影響Fig 2 The effect of Salvigenin on the proliferation rate of CIK cells

    2.3 FCM 檢測結(jié)果 三裂鼠尾草素作用CIK 細(xì)胞48 h 后,CIK 細(xì)胞GraB、PFP 和CD107a 的表達(dá)不同程度升高,25.6 pmol/L 濃度組與對照組比較,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P <0.05);各實驗組中,25.6 pmol/L 組GraB、PFP 和CD107a 的表達(dá)最高,與其他濃度組相比,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P <0.05,見圖3)。

    2.4 殺傷活性檢測結(jié)果 三裂鼠尾草素的濃度在1.6 ~25.6 pmol/L 作用CIK 細(xì)胞48 h 后,對胃癌細(xì)胞株的殺傷活性顯著高于對照組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P <0.05);濃度在25.6 pmol/L 時殺傷活性達(dá)最高峰,為96.75%,與對照組比較,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P <0.05,見圖4)。

    2.5 Western blotting 檢測結(jié)果 三裂鼠尾草素作用CIK 細(xì)胞48 h 后,CIK 細(xì)胞β-catetin、P-ERK1/2、Bcl-2和P-AKT 的表達(dá)不同程度升高,在濃度為25.6 pmol/L時,β-catetin、P-ERK1/2、Bcl-2 和P-AKT 的表達(dá)均高于對照組(P <0.05,見圖5 ~6)。

    圖3 三裂鼠尾草素作用48 h 后,CIK 細(xì)胞GraB、PFP、CD107a 表達(dá)的FCM 結(jié)果Fig 3 Expressions of Gra B,PFP,CD107a of CIK cells in FCM after 48 hours with Salvigenin effect

    圖4 三裂鼠尾草素作用CIK 細(xì)胞48 h 后,CIK 細(xì)胞對胃癌細(xì)胞株殺傷活性的影響;圖5 三裂鼠尾草素作用CIK 細(xì)胞48 h 后的蛋白表達(dá);圖6 三裂鼠尾草素作用后CIK 細(xì)胞β-catenin、P-ERK1/2、Bcl-2 和P-AKT 灰度值比較Fig 4 Effect of CIK cells on the activity of gastric cnacer cell lines after 48 hours with Salvigenin effect;Fig 5 Expression of protein of CIK cells after 48 hours with Salvigenin effect;Fig 6 Comparsion of β-catenin,P-ERK1/2,Bcl-2 and P-AKT grey value after Salvigenin effect

    3 討論

    CIK 細(xì)胞是同時表達(dá)CD3 和CD56 兩種膜蛋白分子的免疫細(xì)胞,具有T 淋巴細(xì)胞的抗腫瘤活性和非主要組織相容性復(fù)合性(major histocompatibility complex,MHC)限制性殺瘤特點,是腫瘤過繼細(xì)胞免疫治療中的一種免疫效應(yīng)細(xì)胞[5]。CIK 細(xì)胞增殖速度快,具有殺瘤活性與殺瘤譜廣特點,目前CIK 細(xì)胞已應(yīng)用于多種腫瘤的治療[6]。三裂鼠尾草是天然多酚類化合物,屬于黃酮類類似物,Noori 等[3]研究發(fā)現(xiàn)三裂鼠尾草素對荷瘤小鼠作用后抑制腫瘤生長速率,腫瘤體積變小,調(diào)節(jié)免疫反應(yīng),提高抗腫瘤效力。Rafatian 等[7]研究發(fā)現(xiàn)在氧化應(yīng)激誘導(dǎo)人成神經(jīng)細(xì)胞瘤SH-SY5Y 細(xì)胞的細(xì)胞凋亡和自噬過程中,三裂鼠尾草素可通過細(xì)胞凋亡蛋白酶途徑的獨立抗氧化活性,促進(jìn)細(xì)胞凋亡和自噬活動的增強(qiáng)。本研究通過不同濃度三裂鼠尾草素在體外誘導(dǎo)人CIK 細(xì)胞,發(fā)現(xiàn)在三裂鼠尾草素濃度為1.6 ~204.8 pmol/L 時,可明顯促進(jìn)CIK 細(xì)胞增殖,濃度為25.6 pmol/L 時,CIK 細(xì)胞增殖率達(dá)最大值,當(dāng)三裂鼠尾草素濃度超過819.2 ~1 638.4 pmol/L,CIK 細(xì)胞增殖出現(xiàn)明顯抑制,這一效應(yīng)呈現(xiàn)較明顯劑量依賴關(guān)系,提示三裂鼠尾草素對CIK 細(xì)胞的增殖作用有濃度窗現(xiàn)象。

    PFP 和GraB 均可存在于活化的CTL 和NK 細(xì)胞胞質(zhì)顆粒中,其介導(dǎo)的細(xì)胞毒途徑是CTL 和NK 細(xì)胞抗腫瘤的主要方式之一[8]。PFP 釋放后當(dāng)Ca2+存在時,在靶細(xì)胞上聚合形成活性孔道,在靶細(xì)胞膜內(nèi)外形成明顯的滲透壓反差,導(dǎo)致靶細(xì)胞脹裂而死,GraB 也可以通過此PFP 形成孔道進(jìn)入靶細(xì)胞,誘導(dǎo)靶細(xì)胞凋亡[9-10]。T 細(xì)胞表面的CD107a 分子,與T 細(xì)胞活化以后脫顆粒過程相關(guān),其比值可以直接反應(yīng)該效應(yīng)細(xì)胞具有的特異性殺傷活性[11-12]。本實驗中發(fā)現(xiàn)三裂鼠尾草素能夠促進(jìn)CIK 細(xì)胞GraB、PFP 和CD107a 的表達(dá),從而增強(qiáng)了CIK 細(xì)胞對胃癌細(xì)胞的殺傷活性。

    β-catenin 的活化可激活Erk 分子,進(jìn)而上調(diào)Bcl-2的表達(dá),促進(jìn)免疫細(xì)胞的存活,從而控制自身免疫應(yīng)答反應(yīng)[13]。Bcl-2 蛋白家族直接調(diào)節(jié)線粒體膜的滲透性從而調(diào)節(jié)細(xì)胞色素C,發(fā)揮抗凋亡和促凋亡的作用[14]。本實驗發(fā)現(xiàn)三裂鼠尾草素可促進(jìn)CIK 細(xì)胞βcatetin、ERK1/2、Bcl-2 和P-AKT 的表達(dá),三裂鼠尾草素在濃度為1.6 ~25.6 pmol/L 時隨著濃度的提高而增強(qiáng)CIK 細(xì)胞Bcl-2 的表達(dá),且對CIK 細(xì)胞的增殖及殺傷活性均有明顯的促進(jìn)作用。因此可以推斷,三裂鼠尾草素對CIK 細(xì)胞的增殖及對腫瘤細(xì)胞的殺傷作用與激活β-catetin、ERK1/2 和Bcl-2 信號通路的表達(dá)密切相關(guān),在上述各信號通路中是否具有共同的調(diào)節(jié)靶點亟待進(jìn)一步研究。本實驗中CIK 細(xì)胞的AKT 表達(dá)也上調(diào),三裂鼠尾草素可能還通過PI3K/AKT 信號傳導(dǎo)通路進(jìn)一步影響T 細(xì)胞的增殖、分化,從而增強(qiáng)對腫瘤細(xì)胞的殺傷作用。

    綜上所述,三裂鼠尾草素能夠促進(jìn)CIK 細(xì)胞的增殖,從而有效提高CIK 細(xì)胞對胃癌細(xì)胞的殺傷活性,其機(jī)制可能與三裂鼠尾草素激活β-catetin、ERK1/2、Bcl-2、P-AKT 信號通路,上調(diào)CIK 細(xì)胞中GraB、PFP、CD107a 的表達(dá)有關(guān)。以上實驗結(jié)果為三裂鼠尾草素用于腫瘤的免疫治療提供了實驗依據(jù),也為草藥單體在免疫細(xì)胞的培養(yǎng)應(yīng)用中提供實例。

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