鞘內(nèi)注射右美托咪定對(duì)骨癌痛大鼠脊髓小膠質(zhì)細(xì)胞活化及Toll樣受體的影響

鞘內(nèi)注射右美托咪定對(duì)骨癌痛大鼠脊髓小膠質(zhì)細(xì)胞活化及Toll樣受體的影響

孟根其其格羅建軍張毅1

(北京市東城區(qū)第一人民醫(yī)院麻醉科，北京100075)

摘要〔〕目的探討鞘內(nèi)注射右美托咪定(DEX)對(duì)骨癌痛大鼠脊髓小膠質(zhì)細(xì)胞活化的影響。方法通過(guò)向健康雄性SD大鼠(200～250 g)脛骨骨髓腔內(nèi)注射Walker256乳腺癌細(xì)胞液制備骨癌痛(BCP)模型后進(jìn)行鞘內(nèi)置管，將45只成功誘導(dǎo)BCP大鼠模型隨機(jī)分組(n=15)：高劑量DEX(DEX-H)組、低劑量DEX(DEX-L)組及生理鹽水(NS)組，DEX-H與DEX-L組分別于鞘內(nèi)注入6 μg·kg-1·d-1或3 μg·kg-1·d-1(注射體積均為10 μl)，同時(shí)選取15只同周齡大鼠作對(duì)照(C)，其余兩組鞘內(nèi)注入等體積生理鹽水。于鞘內(nèi)注射前后對(duì)4組進(jìn)行行為學(xué)檢測(cè)來(lái)分析DEX對(duì)BCP大鼠機(jī)械縮足閾值(MWT)和縮足熱潛伏期(WTL)的影響，采用熒光免疫組化法檢測(cè)各組鞘內(nèi)注射7 d后的脊髓小膠質(zhì)細(xì)胞特異表達(dá)補(bǔ)體C3受體(OX-42)的熒光積分光密度(IOD)，酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)脊髓腫瘤壞死因子(TNF)-α和白介素(IL)-1β水平，免疫印跡檢測(cè)脊髓Toll樣受體(TLR)4及TLR2蛋白水平。結(jié)果與C組相比，NS組鞘內(nèi)注射0~7d的NMT和WTL降低，脊髓小膠質(zhì)細(xì)胞OX-42的IOD、脊髓TNF-α和IL-1β水平及Toll樣受體表達(dá)均升高(P<0.05)；給予DEX鞘內(nèi)注射可改善BCP大鼠的以上異常指標(biāo)(P<0.05)，但與C組均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)；且DEX-H組的以上指標(biāo)均優(yōu)于DEX-L組(P<0.05)。結(jié)論鞘內(nèi)注射DEX對(duì)BCP大鼠有較好的鎮(zhèn)痛作用并抑制了脊髓小膠質(zhì)細(xì)胞活化，可能與其緩解炎癥反應(yīng)及降低Toll樣受體表達(dá)有關(guān)。

關(guān)鍵詞〔〕右美托咪定；骨癌痛；鎮(zhèn)痛；脊髓小膠質(zhì)細(xì)胞活化

中圖分類號(hào)〔〕R73〔文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼〕A〔

1新疆醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院手術(shù)麻醉科

第一作者：孟根其其格(1979-)，女，主治醫(yī)師，主要從事老年麻醉、骨科麻醉研究。

骨轉(zhuǎn)移癌會(huì)引起中重度骨痛，嚴(yán)重影響生活質(zhì)量，同時(shí)也會(huì)導(dǎo)致患者體能狀態(tài)下降及焦慮或抑郁發(fā)生〔1〕。目前，疼痛治療的重點(diǎn)已轉(zhuǎn)移至神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞，且已證實(shí)神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞參與病理性疼痛的發(fā)生發(fā)展〔2〕。疼痛時(shí)，處于靜息狀態(tài)的小膠質(zhì)細(xì)胞被活化，因此抑制神經(jīng)小膠質(zhì)細(xì)胞活化成為疼痛治療的有效措施〔3〕。右美托咪啶(DEX)為一種α2腎上腺素能受體激動(dòng)劑，具有高選擇性、高效的優(yōu)點(diǎn)，可起到鎮(zhèn)靜催眠、鎮(zhèn)痛及抑制交感神經(jīng)活動(dòng)的作用，且不良反應(yīng)低，在臨床應(yīng)用較廣〔4，5〕。筆者推測(cè)DEX對(duì)骨癌痛亦有較好的鎮(zhèn)痛作用。鑒于鞘內(nèi)注射是臨床治療疼痛的常用手段，故本研究給予骨癌痛大鼠模型鞘內(nèi)注射DEX，觀察對(duì)小膠質(zhì)細(xì)胞活化的影響。

1材料與方法

1.1試劑與主要儀器DEX由于江蘇新晨制藥有限公司提供；Walker256乳腺癌細(xì)胞購(gòu)自上海生物醫(yī)學(xué)工程研究院；二喹啉甲酸(BCA)蛋白分析試劑盒購(gòu)自碧云天生物科技公司；Triton X-100、苯甲基黃酰氟及Tris-HCl及購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；白介素(IL)-1β和腫瘤壞死因子(TNF)α檢測(cè)試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所；羊抗特異表達(dá)補(bǔ)體C3受體(OX-42)抗體購(gòu)自美國(guó)Abcam公司，兔抗Toll樣受體(TLR)4及TLR2抗體均購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司；紅色標(biāo)記的二抗購(gòu)自上海亨代勞生物有限公司。儀器：Multiskan Ascent酶標(biāo)儀購(gòu)自Thermo公司；5424R小型臺(tái)式冷凍離心機(jī)、移液槍均購(gòu)自德國(guó)Eppendorf公司；全自動(dòng)熱輻射刺激儀購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院生物醫(yī)學(xué)工程研究所；Mini Protean 3 Cell小型垂直電泳槽購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad公司。

1.2動(dòng)物與分組通過(guò)向健康雄性SD大鼠(200～250 g)脛骨骨髓腔內(nèi)注射Walker256乳腺癌細(xì)胞液制備骨癌痛(BCP)模型后進(jìn)行鞘內(nèi)置管，將45只成功誘導(dǎo)BCP大鼠模型隨機(jī)分組(n=15)：高劑量DEX(DEX-H)組、低劑量DEX(DEX-L)組及生理鹽水(NS)組，DEX-H與DEX-L組分別于鞘內(nèi)注入6、3 μg·kg-1·d-1(注射體積均為10 μl)，同時(shí)選取15只同周齡大鼠作對(duì)照(C)，其余兩組鞘內(nèi)注入等體積生理鹽水。

1.3BCP模型制備及鞘內(nèi)置管根據(jù)文獻(xiàn)〔6〕制備BCP模型：給予BCP大鼠腹腔注射戊巴比妥鈉(40 mg/kg)，待大鼠充分麻醉后，取仰臥位后對(duì)左后肢進(jìn)行消毒備皮，采用手術(shù)刀切開(kāi)皮膚，分離肌肉筋膜充分暴露脛骨，于脛骨結(jié)節(jié)下外0.5~1 cm的脛骨平臺(tái)位置，采用微量注射器抽取Walker256乳腺癌細(xì)胞液，向骨髓腔注射10 μl細(xì)胞液，用骨蠟封住針孔并縫合。待BCP制備后5 d根據(jù)Sluka等〔7〕的方法進(jìn)行鞘內(nèi)置管：切開(kāi)枕部皮膚后，22G無(wú)菌注射器枕頭刺破寰枕膜，待腦脊液流出后置入PE-10導(dǎo)管，固定好導(dǎo)管后縫合皮膚。術(shù)后肌注青霉素預(yù)防感染。

1.4行為學(xué)評(píng)價(jià)分別于鞘內(nèi)注射前、鞘內(nèi)注射不同時(shí)間點(diǎn)(1、3、5、7 d)后進(jìn)行行為學(xué)檢測(cè)，分析DEX鞘內(nèi)注射對(duì)機(jī)械縮足閾值(MWT)和縮足熱潛伏期(WTL)的影響，來(lái)評(píng)價(jià)其鎮(zhèn)痛效果。MWT：采用不同折力(1.0、1.4、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0、15.0 g)Von Frey纖維刺激足底中部，每次刺激6~8 s，每次刺激間隔1 min，當(dāng)大鼠出現(xiàn)快速縮足或舔足，則定義為陽(yáng)性反應(yīng)，重復(fù)5次，3次以上陽(yáng)性反應(yīng)的最小刺激力度計(jì)為MWT。WTL：采用全自動(dòng)熱輻射刺激儀照射足底，每次照射不超過(guò)25s，每次重復(fù)3次，間隔5 min，3次出現(xiàn)抬腿反應(yīng)的時(shí)間平均值計(jì)為WTL。MWT和WTL的數(shù)值越小，就表明痛覺(jué)越敏感。

1.5熒光免疫組化采用脊髓小膠質(zhì)細(xì)胞特異性標(biāo)記物OX-42的熒光積分光密度(IOD)值來(lái)評(píng)價(jià)其活化情況。過(guò)量麻醉致死后，迅速取出大鼠的L4~6脊髓段，經(jīng)多聚甲醛固定、蔗糖脫水后，制備厚20 μm的冠狀冰凍切片，每隔5張保留1張片子，每隔脊髓樣本選取5張用于免疫組化，經(jīng)H2O2室溫孵育及山羊血清封閉后，滴加OX-42的一抗(1∶100)，4℃孵育過(guò)夜后，滴加紅色標(biāo)記的二抗，將片子置于熒光顯微鏡下觀察，采用Image Pro Plus 6.0圖像分析軟件測(cè)定熒光積分光密度(IOD)。

1.6酶聯(lián)免疫吸附法將新鮮脊髓標(biāo)本取出后，于冰上進(jìn)行裂解，以5 000 r/min離心5 min后保留上清，采用對(duì)應(yīng)試劑盒檢測(cè)脊髓提取液中的TNF-α、IL-1β含量，以上操作均嚴(yán)格遵守試劑盒說(shuō)明書(shū)。

1.7免疫印跡BCA法檢測(cè)脊髓提取液中的蛋白濃度，每個(gè)樣本取等量蛋白，與上樣緩沖液混勻、煮沸，上樣后行10% SDS-PAGE凝膠電泳，半干轉(zhuǎn)法將電泳條帶轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜，脫脂奶粉封閉后，根據(jù)膜面積加入TLR-2(1∶100)、TLR-4(1∶200)一抗，4℃孵育過(guò)夜，次日加入二抗(1∶5 000)室溫孵育1 h，以GAPDH為內(nèi)參(1∶3 000)，ECL化學(xué)發(fā)光法顯影，采用Image Pro Plus 6.0軟件分析各條帶光密度，結(jié)果表示為目的條帶與內(nèi)參的光密度比值。

1.8統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS16.0軟件，組間比較采用t檢驗(yàn)及單因素分析。

2結(jié)果

2.1鞘內(nèi)注射DEX對(duì)MWT的影響與C組比較，NS組鞘內(nèi)注射0~7 d的NMT水平降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；給予DEX鞘內(nèi)注射可升高BCP大鼠模型的MWT(P<0.05)，但與C組的差異仍有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；DEX-H組鞘內(nèi)注射1~7 d的NMT水平均高于DEX-L組(P<0.05)。見(jiàn)圖1A。

2.2鞘內(nèi)注射DEX對(duì)WTL的影響與C組比較，NS組鞘內(nèi)注射0~7 d的WTL水平降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；給予DEX鞘內(nèi)注射可升高BCP大鼠模型的WTL(P<0.05)，但與C組的差異仍有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；DEX-H組鞘內(nèi)注射1~7 d的WTL水平均高于DEX-L組(P<0.05)。見(jiàn)圖1B。

2.3鞘內(nèi)注射DEX對(duì)脊髓小膠質(zhì)細(xì)胞活化的影響NS組鞘內(nèi)注射7d的小膠質(zhì)細(xì)胞OX-42的IOD為662.8±53.7，高于C組的246.7±21.5，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；給予DEX鞘內(nèi)注射可降低BCP大鼠模型的小膠質(zhì)細(xì)胞OX-42的IOD水平，但與C組的差異仍有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；DEX-H組鞘內(nèi)注射7d的IOD水平為345.9±25.8，低于DEX-L組的492.3±44.2，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)圖2。

2.4 鞘內(nèi)注射DEX對(duì)脊髓細(xì)胞炎癥因子水平的影響與C組比較，NS組鞘內(nèi)注射7 d后的脊髓TNF-α和IL-1β水平均升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；給予DEX鞘內(nèi)注射可降低BCP大鼠模型的脊髓TNF-α和IL-1β水平(P<0.05)，但與C組的差異仍有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；DEX-H組鞘內(nèi)注射7 d后的脊髓TNF-α和IL-1β水平均低于DEX-L組(P<0.05)。見(jiàn)表1。

A：MWT；B：WTL；與C組比較：1)P<0.05；與NS組比較：2)P<0.05；與DEX-L組比較：3)P<0.05 圖1　鞘內(nèi)注射DEX對(duì)MWT和WTL的影響

圖2　鞘內(nèi)注射DEX對(duì)脊髓小膠質(zhì)細(xì)胞OX-42的IOD影響(×400)

2.5鞘內(nèi)注射DEX對(duì)脊髓Toll樣受體表達(dá)的影響與C組比較，NS組鞘內(nèi)注射7d后的脊髓TLR-2和TLR-4蛋白水平升高(P<0.05)；給予DEX鞘內(nèi)注射可降低BCP大鼠模型的脊髓TLR-2和TLR-4水平(P<0.05)，但與C組的差異仍有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；DEX-H組鞘內(nèi)注射7 d后的脊髓TLR-2和TLR-4水平均低于DEX-L組(P<0.05)。見(jiàn)圖3，表2。

表1　鞘內(nèi)注射DEX對(duì)脊髓細(xì)胞炎癥因子水平的

與C組比較：1)P<0.05；與NS組比較：2)P<0.05；與DEX-L組比較：3)P<0.05；下表同

圖3　鞘內(nèi)注射DEX對(duì)脊髓Toll樣受體表達(dá)的影響

組別TLR2TLR4C組0.18±0.050.22±0.03NS組0.57±0.031)0.74±0.051)DEX-L組0.39±0.061)2)0.45±0.041)2)DEX-H組0.25±0.021)2)3)0.36±0.041)2)3)

3討論

骨癌痛是一種中重度病理性疼痛，嚴(yán)重影響患者生活質(zhì)量。為研究鞘內(nèi)注射DEX對(duì)骨癌痛有無(wú)改善作用，本研究采用公認(rèn)的動(dòng)物模型，即通過(guò)采用Walker256乳腺癌細(xì)胞向脛骨上段骨髓腔內(nèi)注射來(lái)制備BCP模型。大鼠在骨髓腔內(nèi)接種乳腺癌細(xì)胞后會(huì)引起骨破壞，主要表現(xiàn)為骨皮質(zhì)和骨小梁損傷，尤其在接種12 d后會(huì)脛骨骨髓腔會(huì)出現(xiàn)大規(guī)模腫瘤細(xì)胞浸潤(rùn)〔8〕。本研究根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)告于BCP模型制備10 d后進(jìn)行鞘內(nèi)注射治療，同時(shí)為研究DEX對(duì)癌痛的治療效果，本研究采用兩個(gè)劑量研究鞘內(nèi)注射DEX對(duì)骨癌痛大鼠脊髓小膠質(zhì)細(xì)胞活化的影響。

本研究發(fā)現(xiàn)：BCP模型建立后，大鼠的疼痛閾值降低，主要表現(xiàn)為MWT和WTL水平均升高，提示BCP模型建議成功，且在為期7 d的治療中，NS組的MWT和WTL水平均維持在一個(gè)穩(wěn)定水平，提示該種模型的疼痛狀態(tài)較為穩(wěn)定，不會(huì)通過(guò)機(jī)體的代償而緩解或恢復(fù)，可更好地研究DEX的鎮(zhèn)痛效果。給予DEX鞘內(nèi)注射后發(fā)現(xiàn)，治療1 d后MWT和WTL水平即升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，以上表明DEX對(duì)BCP疼痛有改善效果，且改善效果可持續(xù)7 d。

目前，小膠質(zhì)細(xì)胞已成為疼痛干預(yù)的重點(diǎn)，約占神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的5%~10%，在正常情況下為靜息狀態(tài)，但外界刺激可引起小膠質(zhì)細(xì)胞激活，如參與術(shù)后持續(xù)性疼痛形成及神經(jīng)病理性疼痛有關(guān)〔9，10〕。小膠質(zhì)細(xì)胞，由脊髓單核細(xì)胞分化而來(lái)，當(dāng)其活化時(shí)，其主要表面抗原物質(zhì)OX-42會(huì)大量表達(dá)〔11〕，故本研究采用熒光免疫組化法檢測(cè)OX-42的IOD評(píng)價(jià)小膠質(zhì)細(xì)胞的激活情況。本研究發(fā)現(xiàn)：NS組的IOD值高于C組，提示BCP大鼠的小膠質(zhì)細(xì)胞處于活化狀態(tài)，與癌細(xì)胞浸潤(rùn)引起的疼痛有關(guān)，而DEX鞘內(nèi)注射后IOD降低，提示DEX可抑制小膠質(zhì)細(xì)胞活化，為其鎮(zhèn)痛的主要原因。疼痛可引起炎癥反應(yīng)，尤其當(dāng)小膠質(zhì)細(xì)胞處于活化狀態(tài)時(shí)〔12〕，本研究中BCP大鼠的脊髓常見(jiàn)炎癥因子TNF-α和IL-1β水平升高，而給予DEX鞘內(nèi)注射后，以上炎癥因子水平降低，表明DEX可緩解炎癥反應(yīng)。Toll樣受體介導(dǎo)了炎癥反應(yīng)〔13〕，而本研究發(fā)現(xiàn)BCP大鼠的TLR-2和TLR-4水平均升高，更加證實(shí)了癌痛大鼠出現(xiàn)了炎癥反應(yīng)，而給予DEX后兩者水平下調(diào)，與其改善炎癥反應(yīng)的結(jié)論一致。

參考文獻(xiàn)4

1Cheng M，Liu L，Yang HS，etal.Circulating tumor cells are associated with bone metastasis of lung cancer〔J〕.Asian Pac J Cancer Prev，2014；15(15)：6369-74.

2Vallejo R，Tilley DM，Vogel L，etal.The role of glia and the immune system in the development and maintenance of neuropathic pain〔J〕.Pain Pract，2010；10(3)：167-84.

3Jun IG，Kim SH，Yoon YI，etal.Intrathecal lamotrigine attenuates antinociceptive morphine tolerance and suppresses spinal glial cell activation in morphine-tolerant rats〔J〕.J Korean Med Sci，2013；28(2)：300-7.

4劉征宇，溫蔚，雷恩駿，等.小劑量右美托咪啶應(yīng)用于高齡患者全身麻醉的效果〔J〕.中國(guó)老年學(xué)雜志，2011；31(24)：4935-6.

5李春萍，杜奕鵬，宋雪松，等.右美托咪定對(duì)老年患者術(shù)后舒芬太尼自控靜脈鎮(zhèn)痛效果的影響〔J〕.中國(guó)老年學(xué)雜志，2011；31(16)：3043-4.

6李曉青，孫玉明，黃章翔，等.Walker 256乳腺癌細(xì)胞構(gòu)建大鼠脛骨骨癌痛模型〔J〕.中國(guó)腫瘤生物治療雜志，2008；15(1)：41-5.

7Sluka KA，Audette KM.Activation of protein kinase C in the spinal cord produces mechanical hyperalgesia by activating glutamate receptors，but does not mediate chronic muscle-induced hyperalgesia〔J〕.Mol Pain，2006；2：13.

8陳勇，杜曉紅，應(yīng)俊，等.鞘內(nèi)注射Staurosporine對(duì)骨癌痛大鼠脊髓小膠質(zhì)細(xì)胞活化的影響〔J〕.臨床麻醉學(xué)雜志，2013；29(12)：1214-7.

9Zhuo M，Wu G，Wu LJ.Neuronal and microglial mechanisms of neuropathic pain〔J〕.Mol Brain，2011；30(4)：31.

10應(yīng)彥璐，許學(xué)兵，佘守章，等.背根神經(jīng)節(jié)小膠質(zhì)細(xì)胞活化在大鼠術(shù)后持續(xù)性痛形成中的作用〔J〕.中華麻醉學(xué)雜志，2013；33(2)：156-8.

11盧波，肖純，孫建良，等.神經(jīng)病理性疼痛中脊髓小膠質(zhì)細(xì)胞活化的分子機(jī)制〔J〕.國(guó)際麻醉學(xué)與復(fù)蘇雜志，2013；34(6)：548-51.

12王新，李明軍，張坤，等.腦出血與小膠質(zhì)細(xì)胞介導(dǎo)的炎癥相關(guān)性〔J〕.中國(guó)老年學(xué)雜志，2013；33(13)：3268-70.

13方靜，杜麗，付輝，等.炎癥反應(yīng)中的microRNAs及其在TLR信號(hào)通路中的調(diào)控作用〔J〕.第二軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào)，2013；34(7)：782-6.

〔2014-07-20修回〕

(編輯滕欣航)