SD大鼠肺成纖維細(xì)胞的原代培養(yǎng)及分離純化

SD大鼠肺成纖維細(xì)胞的原代培養(yǎng)及分離純化

何愛(ài)明1李曉暉1李岱2

(福建師范大學(xué)福清校區(qū)生化系，福建福清350300)

摘要〔〕目的建立大鼠肺成纖維細(xì)胞的體外高效穩(wěn)定的培養(yǎng)方法。方法取成年SD大鼠，采用差速貼壁法純化與胰酶反復(fù)消化法傳代，得到純度更高產(chǎn)量更多的肺成纖維細(xì)胞。所得細(xì)胞采用免疫細(xì)胞化學(xué)方法加以鑒定，且進(jìn)行生長(zhǎng)曲線(xiàn)測(cè)定。結(jié)果肺成纖維細(xì)胞純化率可達(dá)99.3%，細(xì)胞增殖快,生長(zhǎng)良好，產(chǎn)量大。結(jié)論成功建立了肺成纖維細(xì)胞純化與傳代的方法,適用于細(xì)胞水平上的間質(zhì)性肺病發(fā)病機(jī)制的研究。

關(guān)鍵詞〔〕肺成纖維細(xì)胞;原代培養(yǎng);純化

中圖分類(lèi)號(hào)〔〕R33〔文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼〕A〔

基金項(xiàng)目：國(guó)家青年科學(xué)

通訊作者：李岱(1982-)，男，博士后，助理研究員，主要從事分子藥理學(xué)研究。

1中南大學(xué)藥學(xué)院藥理系2中南大學(xué)湘雅醫(yī)院藥劑科

第一作者：何愛(ài)明(1967-)，女，碩士，副教授，主要從事呼吸藥理學(xué)研究。

Primary culture and isolation and purification of SD rat lung fibroblasts

HE Ai-Ming,LI Xiao-Hui,LI Dai.

Department of Biochemistry, Fuqing Campus, Fujian Normal University, Fuqing 350300, Fujian, China

Abstract【】ObjectiveTo establish an efficient and stable culture method of rat lung fibroblasts in vitro.MethodsThe more purified and more production lung fibroblasts were obtained from adult Sprague Dawley rats isolated by improved velocity sedimentation adherence method and repeated digestion method.The cells were identified by immunochemical stain to determine the growth curve.ResultsThe purification rate of lung fibroblasts was 99.3% and they showed strong proliferative ability, grew well and more production.ConclusionsThe purification and subculture technique for lung fibroblast is developed successfully, which is useful to explore the pathologic mechanisms of interstitial lung disease in cellular level.

【Key words】Lung fibroblast;Primary culture;Purification

肺成纖維細(xì)胞不僅是重要的間質(zhì)細(xì)胞，也是活躍的分泌細(xì)胞，并表現(xiàn)出免疫炎癥細(xì)胞的特征。它可合成膠原蛋白、彈性蛋白等組織基質(zhì)成分，合成基質(zhì)金屬蛋白酶和組織型金屬蛋白酶抑制物，通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞外基質(zhì)代謝，參與組織重建。體外成功培養(yǎng)肺成纖維細(xì)胞是研究肺部疾病如支氣管哮喘、慢性阻塞性肺疾病、肺纖維化等的重要手段和工具。如何建立一種較簡(jiǎn)單易行、經(jīng)濟(jì)實(shí)惠、高單細(xì)胞收率、高純度、高存活率的培養(yǎng)方法,仍是肺成纖維細(xì)胞培養(yǎng)模型制作中的關(guān)鍵問(wèn)題。本實(shí)驗(yàn)借鑒前人的經(jīng)驗(yàn)基礎(chǔ)上,采用改良的方法培養(yǎng)出純度較高、活力較強(qiáng)的SD大鼠肺成纖維細(xì)胞。

1材料與方法

1.1材料、動(dòng)物及試劑與儀器雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠，SPF級(jí)，體重250 g，中南大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)部提供。DMEM高糖培養(yǎng)基(美國(guó)Hyclone公司)、胎牛血清(天津?yàn)?yáng)生物技術(shù)有限公司)、胰蛋白酶(美國(guó)Invitogen公司)、小鼠抗大鼠Vimentin 單克隆抗體(美國(guó)Abcam公司)、山羊抗鼠HRP 標(biāo)記二抗(美國(guó)Santa Cruz公司)、DAB顯示劑(美國(guó)Vector公司)。CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱(FORMA3111，美國(guó)Thermo公司)、高性能超凈工作臺(tái)(上海瑞仰凈化裝備有限公司)、倒置相差顯微鏡(1×70型，日本Nikon公司)、移液器(德國(guó)Eppendorf公司)。

1.2方法

1.2.1肺成纖維細(xì)胞原代培養(yǎng)取250 g SPF級(jí)雄性SD大鼠1只，10%水合氯醛5 mL/kg腹腔注射麻醉，分離頸總動(dòng)脈，剪斷放血。大鼠移入超凈臺(tái)，開(kāi)胸取肺，去除肺組織表面胸膜，剪切距離肺周邊1 mm 內(nèi)的肺組織，并將其放入玻璃培養(yǎng)皿。用滅菌的PBS液反復(fù)沖洗，去除血液及漂浮的結(jié)締組織，直至PBS 液變?yōu)槌吻?。用手術(shù)剪將周邊肺組織反復(fù)剪切成1 mm×1 mm×1 mm大小的組織塊，用含10%胎牛血清的DMEM浸潤(rùn)，然后用眼科彎鑷小心勾取肺組織塊，均勻貼入25 cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶一面，組織塊之間距離約為1 cm，將細(xì)胞培養(yǎng)瓶放入37℃ 5%CO2濕度為95%的細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)2 h后，待組織小塊貼附于培養(yǎng)瓶后，取出培養(yǎng)瓶，沿培養(yǎng)瓶無(wú)細(xì)胞一面小心加入含10%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)液5 ml。培養(yǎng)瓶放回細(xì)胞培養(yǎng)箱，小心將培養(yǎng)瓶慢慢平放，使組織小塊完全浸入培養(yǎng)液中，繼續(xù)靜置培養(yǎng)96 h，細(xì)胞從組織塊周?chē)耆纬龊?，用鑷子將組織塊輕輕取下，此后細(xì)胞每隔48 h換液1次，細(xì)胞生長(zhǎng)至接近完全融合成細(xì)胞單層時(shí)，進(jìn)行傳代。

1.2.2 肺成纖維細(xì)胞傳代培養(yǎng)用0.25%胰蛋白酶消化2 h，觀(guān)察到瓶底大部分細(xì)胞開(kāi)始回縮后，傾倒胰蛋白酶，加入培養(yǎng)基中止消化，用玻璃管小心吹下細(xì)胞，未吹下的細(xì)胞再次用胰酶進(jìn)行消化，如此反復(fù)，使用胰酶的總時(shí)間不超過(guò)5 min。以1∶2的比例傳代，傳代時(shí)利用差時(shí)貼壁法，即在傳代時(shí)將所得的混合細(xì)胞懸液，接種在培養(yǎng)瓶中，靜置于培養(yǎng)箱2 h后，輕輕振搖，傾出尚未貼壁的混雜細(xì)胞，進(jìn)行下一代的培養(yǎng)。每隔2 d換液1次，待細(xì)胞鋪滿(mǎn)瓶底后再用同樣的方法進(jìn)行傳代。實(shí)驗(yàn)選用第3~6代細(xì)胞。

1.3 肺成纖維細(xì)胞的鑒定

1.3.1 形態(tài)學(xué)鑒定將培養(yǎng)過(guò)程中不同階段的肺成纖維細(xì)胞置于倒置顯微鏡下觀(guān)察細(xì)胞形態(tài)。

1.3.2 波形蛋白免疫細(xì)胞化學(xué)染色將第3代細(xì)胞種在6孔板中進(jìn)行培養(yǎng)，待細(xì)胞融合70%后，按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行免疫細(xì)胞化學(xué)染色。

1.3.3 純度鑒定以胞質(zhì)出現(xiàn)棕黃色絲狀為陽(yáng)性信號(hào),計(jì)算每孔5個(gè)不重疊視野(×100),分別計(jì)數(shù)每個(gè)視野下陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)所占總細(xì)胞數(shù)的百分比，計(jì)算其平均數(shù)。

1.3.4 細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線(xiàn)測(cè)定將第3代成纖維細(xì)胞消化稀釋,以2×104/ml個(gè)細(xì)胞接種于12 孔培養(yǎng)板,每孔接種1 ml,于37℃ 5%CO2濕度為95%的細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng),每隔24 h收集3孔細(xì)胞并計(jì)數(shù),分別取其平均值,每3天換液1次,連續(xù)計(jì)數(shù)7 d后繪制生長(zhǎng)曲線(xiàn)。

2結(jié)果

2.1 形態(tài)觀(guān)察組織塊接種入培養(yǎng)瓶后，12 h內(nèi)即可見(jiàn)組織塊周?chē)屑?xì)胞和組織碎片逸出，并圍繞組織塊形成逸出帶，12 h后逐漸有少量細(xì)胞逸出。72 h見(jiàn)有細(xì)胞逸出并逐漸伸展呈梭形。第6天左右梭形細(xì)胞在局部融合成片，與其他形態(tài)細(xì)胞形成界限分明的隔離帶，呈接觸抑制現(xiàn)象。此后梭形細(xì)胞逐漸在培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)占據(jù)優(yōu)勢(shì)，覆蓋培養(yǎng)瓶大部分面積，7 d左右細(xì)胞接近完全融合。傳第3代此時(shí)細(xì)胞呈長(zhǎng)梭形、條索狀、多角形、漩渦狀等，見(jiàn)圖1。

2.2 免疫細(xì)胞化學(xué)鑒定及純度鑒定波形蛋白染色可見(jiàn)視野內(nèi)細(xì)胞幾乎均呈陽(yáng)性表達(dá)(見(jiàn)圖2)。傳到第4代的肺成纖維細(xì)胞陽(yáng)性率達(dá)99.3%。

2.3 生長(zhǎng)曲線(xiàn)第3代肺成纖維細(xì)胞以2×104/ml接種于12孔培養(yǎng)板,細(xì)胞于第6天長(zhǎng)滿(mǎn)，于第1，2，3，4，5，6，7天細(xì)胞數(shù)分別為2×104、2.3×104、3×104、4×104、5×105、6×104、6×104個(gè)。

培養(yǎng)12 h(×400)

培養(yǎng)72 h(× 400)

培養(yǎng)第6天(×100)

第3代細(xì)胞(×100)

圖1肺成纖維細(xì)胞形態(tài)觀(guān)察

圖2　第3代肺成纖維的波形蛋白鑒定(×100)

3討論

肺組織中有支氣管、血管、神經(jīng)伴行，細(xì)胞數(shù)量和種類(lèi)多，包括上皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞、血細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞等多種細(xì)胞，經(jīng)組織塊貼壁法培養(yǎng)，會(huì)混雜有多種細(xì)胞，但成纖維細(xì)胞貼壁速度快，僅僅需40 min左右，首先吸附在瓶壁上〔1〕,本實(shí)驗(yàn)利用差速貼壁法，即在傳代時(shí)隔2 h更換培養(yǎng)液，經(jīng)2~3次貼壁選擇后，貼附幾乎是成纖維細(xì)胞，再利用成纖維細(xì)胞脫壁也快且對(duì)酶性分離敏感的特點(diǎn)，采用0.25%胰蛋白酶分離進(jìn)行傳代，傳至第4代時(shí)純度可達(dá)99.3%。

成纖維細(xì)胞中間絲的結(jié)構(gòu)蛋白為波形蛋白，不同于上皮細(xì)胞的角蛋白,也不同于肌細(xì)胞的橋連蛋白,成為不同種類(lèi)細(xì)胞分類(lèi)鑒定的相對(duì)特異性標(biāo)志〔2〕，本研究免疫細(xì)胞化學(xué)鑒定結(jié)果提示所培養(yǎng)的細(xì)胞波形蛋白染色陽(yáng)性表達(dá)，從而證明了該細(xì)胞為成纖維細(xì)胞。就生長(zhǎng)曲線(xiàn)看，在培養(yǎng)1~2 d時(shí)就進(jìn)入指數(shù)分裂期，且指數(shù)分裂期的持續(xù)時(shí)間較長(zhǎng)達(dá)4 d。本實(shí)驗(yàn)使用的方法進(jìn)行了一些改良，用差速貼壁法與反復(fù)消化法，所獲得的肺成纖維細(xì)胞具有較強(qiáng)的分裂增殖能力,適應(yīng)性強(qiáng),傳代周期短，易培養(yǎng)，性狀穩(wěn)定，純度高，產(chǎn)量大等特點(diǎn)，可用于細(xì)胞水平上研究間質(zhì)性肺病的發(fā)病機(jī)制。

參考文獻(xiàn)4

1祝華平,常立文,李文斌，等.胎鼠肺細(xì)胞的分離純化及原代培養(yǎng)〔J〕.華中科技大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版),2003;32(6):597-600.

2楊志明.組織工程學(xué)〔M〕.北京:化學(xué)工業(yè)出版社,2002:155-8.

〔2013-12-03修回〕

(編輯趙慧玲/曹夢(mèng)園)