Orexin-A對癲癇大鼠學(xué)習(xí)記憶能力及海馬齒狀回神經(jīng)細(xì)胞增殖的影響

Orexin-A對癲癇大鼠學(xué)習(xí)記憶能力及海馬齒狀回神經(jīng)細(xì)胞增殖的影響

孫杰李籌忠王曲高方友

(貴州省人民醫(yī)院神經(jīng)外科，貴州貴陽550002)

摘要〔〕目的探討Orexin-A(OXA)對癲癇大鼠學(xué)習(xí)記憶能力及海馬齒狀回神經(jīng)細(xì)胞增殖的影響。方法選取健康成年SD大鼠50只，隨機分為對照組、PTZ+NS組、PTZ+OXA組、PTZ+U0126組、PTZ+U0126+OXA組，每組10只。選用PTZ(30 mg/kg)腹腔注射造模。對照組和PTZ+NS組注射8 μl生理鹽水，PTZ+OXA組注射等量1.5 nmol/μl的OXA，PTZ+U0126組注射等量的U0126，PTZ+U0126+OXA組分別注射等量U0126和OXA；注射后恢復(fù)飼養(yǎng)7 d后進(jìn)行水迷宮試驗。觀察各組大鼠學(xué)習(xí)記憶能力，并采用免疫熒光染色法檢測海馬齒狀回神經(jīng)細(xì)胞增殖情況。結(jié)果與對照組相比，其余四組大鼠的逃避潛伏期明顯變長(P<0.01)。PTZ+U0126組逃避潛伏期明顯長于PTZ+NS組(P<0.01)；PTZ+NS組、PTZ+U0126組、PTZ+U0126+OXA組逃避潛伏期明顯長于PTZ+OXA組(P<0.05)。與對照組相比，其余四組大鼠穿越平臺的次數(shù)、穿越平臺所處象限的時間均明顯減少(P<0.01)；PTZ+OXA組、PTZ+U0126+OXA組大鼠穿越平臺象限的次數(shù)、穿越平臺所處象限的時間均明顯多于PTZ+NS組(P<0.01)。PTZ+U0126+OXA組大鼠穿越平臺象限的次數(shù)、穿越平臺所處象限的時間明顯少于PTZ+OXA組(P<0.01)。PTZ+U0126組海馬齒狀回區(qū)Brdu+/ DCX+細(xì)胞數(shù)明顯低于PTZ+NS組(P<0.01)；PTZ+NS組、PTZ+U0126組、PTZ+U0126+OXA組海馬齒狀回區(qū)Brdu+/DCX+細(xì)胞數(shù)明顯低于PTZ+OXA組(P<0.05)。結(jié)論OXA能夠通過促進(jìn)齒狀回顆粒細(xì)胞的再生改善癲癇大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力，其可能與ERK1/2激活有關(guān)。

關(guān)鍵詞〔〕癲癇；Orexin-A；學(xué)習(xí)記憶；神經(jīng)細(xì)胞

中圖分類號〔〕R749〔文獻(xiàn)標(biāo)識碼〕A〔

通訊作者：高方友(1972-)，男，博士，教授，碩士生導(dǎo)師，主要從事癲癇的發(fā)病機制研究。

第一作者：孫杰(1988-)，男，碩士，主要從事癲癇的發(fā)病機制研究。

長期癲癇發(fā)作會降低學(xué)習(xí)記憶能力，對患者的日常生活造成嚴(yán)重影響。目前認(rèn)為，癲癇主要通過破壞神經(jīng)元、打破神經(jīng)肽與神經(jīng)遞質(zhì)間的平衡等多種機制損傷學(xué)習(xí)記憶能力〔1〕。Orexins為一種興奮性神經(jīng)肽，對神經(jīng)內(nèi)分泌、體內(nèi)能量代謝、進(jìn)食等多方面發(fā)揮關(guān)鍵的調(diào)控作用。近年來研究顯示，Orexin-A(OXA)能夠激活細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶(ERK1/2)參與細(xì)胞生長和增殖〔2〕。研究發(fā)現(xiàn)OXA能夠提高癲癇大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力，但該作用是否通過激活ERK1/2來實現(xiàn)至今仍不明確〔3〕。本次研究探討OXA對癲癇大鼠學(xué)習(xí)記憶能力、均馬齒狀回神經(jīng)細(xì)胞增殖的影響。

1材料與方法

1.1動物與分組選取健康成年SD大鼠50只，清潔級，體重150～180 g，吉林大學(xué)實驗動物中心提供，合格證：SCXX-(吉)2003-0004。隨機分為對照組、成四唑(PTZ)聯(lián)合生理鹽水(PTZ+NS)組、PTZ+OXA組、ER1/2抑制劑組(PTZ+U0126)組、PTZ+U0126+OXA組，每組10只。24℃溫度下分籠喂養(yǎng)。

1.2部分儀器與試劑OXA(上海玉博生物科技有限公司)；U0126(上海拜力生物科技有限公司)；PTZ、嗅脫氧核苷尿嘧啶(BrdU)抗體(圣克魯斯生物技術(shù)公司)；小鼠抗大鼠BrdU單克隆抗體、山羊抗大鼠雙腎上腺皮質(zhì)激素(DCX)多克隆抗體(上海研晶生化試劑有限公司)；兔抗山羊IgG、異硫氰酸熒光素(FITC)標(biāo)記山羊抗小鼠IgG(武漢博士德生物工程有限公司)。泰盟Morris水迷宮視頻跟蹤分析系統(tǒng)WMT-100(成都泰盟軟件有限公司)。腦立體定位儀、微量注射器(北京銘泰佳信科技有限公司)。

1.3大鼠癲癇模型建立除對照組外的四組大鼠每日清晨8時給予PTZ(30 mg/kg)腹腔注射，觀察0.5～1 h，聯(lián)系30 d，到符合造模成功標(biāo)準(zhǔn)時為止。對照組大鼠同時間注射等量生理鹽水。大鼠癲癇癥狀的判斷依據(jù)Racine分級標(biāo)準(zhǔn)：Ⅰ級：出現(xiàn)立須等面部抽搐；Ⅱ級：頸部肌肉痙攣，主要表現(xiàn)為點頭；Ⅲ級：單側(cè)前肢抽搐；Ⅳ級：雙側(cè)前肢抽搐，同時伴身體直立；Ⅴ級：雙側(cè)后肢強直，用時伴全身陣攣。連續(xù)出現(xiàn)Ⅳ級及以上≥3次為造模成功。

1.4藥物側(cè)腦室注射用10%的水合氯醛(300 mg/kg)麻醉造模成功后的大鼠，固定在腦立體定位儀上，將不銹鋼微導(dǎo)管插入后固定。對照組和PTZ+NS組注射8 μl生理鹽水，PTZ+OXA組注射等量1.5 nmol/μl的OXA，PTZ+U0126組注射等量U0126，PTZ+U0126+OXA組分別注射等量OXA、U0126。注射后恢復(fù)飼養(yǎng)7 d后進(jìn)行水迷宮試驗。

1.5Morris水迷宮試驗(1)定位航行試驗：首日將大鼠放入水池中自由游泳3 min，熟悉池中環(huán)境；第2天起，分別于每日上午、下午分別測試1次，每次測試均讓大鼠從四個象限中各入水1次，記錄尋找平臺的線路圖，爬上平臺所用時間為逃避潛伏期和游泳速度。若在2 min內(nèi)仍未尋找到平臺，則將其放在平臺上休息30 min，記錄潛伏期為2 min，訓(xùn)練時間間隔1 min。(2)空間搜索試驗：完成定位航行試驗后第2天將水池中的平臺拿去，從同一個象限將大鼠放入水池中，記錄2 min內(nèi)經(jīng)過平臺所在位置的次數(shù)和在平臺所在象限的游泳時間。

1.6海馬齒狀回Brdu和DCX表達(dá)檢測采用免疫熒光染色法，用Brdu和DCX進(jìn)行熒光雙標(biāo)記，對新生細(xì)胞的增殖、遷移進(jìn)行檢測。各組大鼠在Morris水迷宮試驗結(jié)束后12、24 h分別腹腔注射BrdU，劑量為100 mg/kg。7 d后麻醉大鼠，先用200 ml生理鹽水快速灌注，再用4%多聚甲醛溶液250 ml先快后慢灌注30 min，取腦組織并制作成20 μm的海馬連續(xù)冠狀切片。修復(fù)抗原30 min后，用2 mol/L的鹽酸在常溫條件下孵育30 min后用2 mol/L的硼酸溶液相同條件下孵育30 min，行DNA變性；磷酸鹽緩沖液(PBS)徹底洗凈后，加入小牛血清封閉液孵育60 min，將封閉液棄去后加入DCX多克隆抗體(1∶100)在4℃環(huán)境中放置過夜；PBS徹底洗凈后加入相應(yīng)的熒光二抗，孵育60 min；PBS徹底洗凈后封片。觀察Brdu和DCX的熒光表達(dá)。

1.7統(tǒng)計學(xué)方法應(yīng)用SPSS18.0軟件行t檢驗。

2結(jié)果

2.1行為學(xué)觀察注射PTZ第3～5天后，TZ+NS組、PTZ+OXA組、PTZ+U0126組、PTZ+U0126+OXA組大鼠均表現(xiàn)面部抽搐。第5～7天出現(xiàn)頸部肌肉抽搐；8～17 d，多數(shù)大鼠癲癇發(fā)作達(dá)Ⅲ級，出現(xiàn)單側(cè)前肢抽搐；17～25 d，癲癇發(fā)作達(dá)Ⅳ～Ⅴ級，出現(xiàn)雙側(cè)前肢抽搐，并伴身體直立。30 d時，90.00%大鼠造模成功。其中3只大鼠死亡，4只大鼠未達(dá)造模成功標(biāo)準(zhǔn)而剔除。最終TZ+NS組8只、PTZ+OXA組9只、PTZ+U0126組8只、PTZ+U0126+OXA組8只。

2.2水迷宮試驗結(jié)果

2.2.1定位航行試驗隨訓(xùn)練時間延長，各組大鼠的平均逃避潛伏期均縮短。與對照組相比，其余四組大鼠的逃避潛伏期明顯變長(P<0.01)，PTZ+U0126組逃避潛伏期明顯長于PTZ+NS組(P<0.01)；PTZ+NS組、PTZ+U0126組、PTZ+U0126+OXA組逃避潛伏期明顯長于Frz+OXA組(P<0.05 ，P<0.01)。見表1。

表1　各組定位航行試驗潛伏期比較 ± s)

2.2.2空間搜索試驗對照組中大鼠游泳軌跡清晰，部分接近直線，目的性強；PTZ+Ns組大鼠游泳軌跡混亂，無目的性；PTZ+OXA組大鼠游泳軌跡清晰；PTZ+U0126組大鼠游泳軌跡雜亂；PTZ+U0126+OXA組大鼠游泳軌跡較為清晰。與對照組相比，其余四組大鼠穿越平臺的次數(shù)、穿越平臺所處象限的時間均明顯減少(P<0.01)；PTZ+OXA組、PTZ+U0126+OXA組大鼠穿越平臺象限的次數(shù)、穿越平臺所處象限的時間均明顯多于PTZ+NS組(P<0.01)；但PTZ+U0126組大鼠穿越平臺象限的次數(shù)及所在象限的時間均明顯減少。PTZ+U0126+OXA組大鼠穿越平臺象限的次數(shù)及所在象限的時間明顯少于PTZ+OXA組(P<0.01)。見表2。

表2　各組空間搜索試驗穿越平臺次數(shù)和象限的

2.3各組大鼠海馬齒狀回DCX和Brdu表達(dá)情況比較各組大鼠均有DCX表達(dá)，多集中在齒狀回顆粒下區(qū)，少數(shù)在門區(qū)。Brdu表達(dá)多集中在齒狀回顆粒下區(qū)。多數(shù)Brdu+細(xì)胞有DCX+表達(dá)，Brdu+/ DCX+表達(dá)多集中于齒狀回顆粒下區(qū)，見圖1～圖3。海馬齒狀回區(qū)Brdu+/DCX+細(xì)胞數(shù)在PTZ+NS組和對照組之間無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)。PTZ+U0126組海馬齒狀回區(qū)Brdu+/ DCX+細(xì)胞數(shù)明顯低于PTZ+NS組(P<0.01)；與PTZ+OXA組相比，PTZ+NS組、PTZ+U0126組、PTZ+U0126+OXA組海馬齒狀回區(qū)Brdu+/DCX+細(xì)胞數(shù)明顯減少(P<0.05，P<0.01)。

A為對照組；B為PTz+NS組；C為PTZ+OXA組；D為PTZ+U0126組；E為PTZ+U0126+OXA組(下圖同) 圖1　大鼠海馬齒狀回DCX+細(xì)胞表達(dá)(×400)

圖2　大鼠海馬齒狀回Brdu+細(xì)胞表達(dá)(×400)

圖3　大鼠海馬齒狀回Brdu+/ DCX+細(xì)胞表達(dá)(×400)

3討論

臨床對癲癇的治療不應(yīng)只停留在對病情的有效控制，通過改善認(rèn)知功能，提升患者的生活質(zhì)量已成為癲癇治療的最終目的〔4〕。癲癇病情發(fā)展損傷海馬神經(jīng)、突觸等相關(guān)結(jié)構(gòu)，腦中神經(jīng)遞質(zhì)失衡、電生理紊亂等多種原因共同引起了癲癇患者學(xué)習(xí)記憶能力障礙。癲癇反復(fù)發(fā)作會降低CSF、OXA水平，也是引起記憶能力障礙的可能原因之一〔5〕。本研究說明OXA能明顯縮短PTZ導(dǎo)致的癲癇大鼠逃避潛伏期。研究認(rèn)為，重度癲癇會對海馬細(xì)胞遷移、增殖能力造成嚴(yán)重影響，引起非正常的神經(jīng)元環(huán)路，損傷學(xué)習(xí)記憶能力〔6〕。本次研究中，PTZ+OXA組齒狀回顆粒下層多見增殖的Brdu+細(xì)胞，樹突向分子層伸展與CA3區(qū)域的神經(jīng)元相連，共同構(gòu)建起局部突觸聯(lián)系，促進(jìn)長時程增強效應(yīng)(LTP)的生成，說明OXA可有效提高記憶再現(xiàn)能力。

中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，ERK1/2廣泛表達(dá)可協(xié)調(diào)神經(jīng)元對外界刺激信號及時作出反應(yīng)，改善學(xué)習(xí)記憶能力〔7〕。本次研究說明ERK1/2的激活不但會緩解癲癇大鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力減退，還會降低OXA水平，使癲癇大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力得到改善，提示OXA參與學(xué)習(xí)記憶的過程與激活ERK1/2密切相關(guān)。

相關(guān)研究認(rèn)為，癲癇病情發(fā)作可引發(fā)ERK1/2的過度激活，加重癲癇對腦組織的損傷；但ERK1/2在病情發(fā)作后存在一過性激活，可作為一種保護性代償反應(yīng)〔8〕。本次研究中，ERK1/2抑制劑能夠使癲癇對海馬CA3區(qū)域神經(jīng)細(xì)胞的損傷加重，對OXA促進(jìn)新生顆粒細(xì)胞遷移至顆粒層起明顯抑制作用?？梢奜XA激活ERK1/2可能通過抑制海馬區(qū)細(xì)胞凋亡、調(diào)節(jié)神經(jīng)突觸可塑性形成、促進(jìn)齒狀回顆粒細(xì)胞的增殖，改善學(xué)習(xí)記憶能力。

綜上所述，OXA可有效提升癲癇大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力，可能與激活ERK1/2、促進(jìn)海馬齒狀回神經(jīng)細(xì)胞增殖相關(guān)。但如何防止過度激活ERK1/2，誘導(dǎo)海馬齒狀回神經(jīng)細(xì)胞再生，將新生的神經(jīng)元加入進(jìn)神經(jīng)環(huán)路中仍需要進(jìn)一步研究。

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〔2015-03-19修回〕

(編輯袁左鳴)