MPTP對(duì)不同年齡快速老化小鼠血清環(huán)氧化酶-2的影響

MPTP對(duì)不同年齡快速老化小鼠血清環(huán)氧化酶-2的影響

馬曉偉張忠霞李曉麗王彥永王銘維

(河北醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科河北省腦老化與認(rèn)知神經(jīng)科學(xué)實(shí)驗(yàn)室，河北石家莊050031)

摘要〔〕目的探討不同年齡快速老化小鼠(SAMP8)急性注射1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氫吡啶(MPTP)后血清環(huán)氧化酶-2(COX-2)的動(dòng)態(tài)改變。方法選用健康雌性3、6、10月齡SAMP8小鼠各36只，隨機(jī)分為對(duì)照組和用藥組。用藥組小鼠背部皮下注射MPTP 14 mg/kg，1次/2 h，共4次，制成急性損傷模型；對(duì)照組小鼠給予同量生理鹽水。分別于第1次給藥后1、3、7 d進(jìn)行行為學(xué)觀察及生化指標(biāo)的檢測(cè)。采用曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)觀察其運(yùn)動(dòng)功能，高效液相色譜法檢測(cè)黑質(zhì)多巴胺(DA)含量，酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測(cè)血清環(huán)氧化酶(COX)-2的表達(dá)，比較不同年齡組SAMP8小鼠各時(shí)間點(diǎn)損傷的差異。結(jié)果各年齡組MPTP小鼠水平穿格數(shù)與垂直站立次數(shù)均減少，DA水平明顯下降，與對(duì)照組相比差異顯著(P<0.05)，與3、6月齡相比，10月齡小鼠上述指標(biāo)下降更明顯；各用藥組小鼠血清COX-2表達(dá)從第1天開(kāi)始即明顯增高(P<0.05)，第3天增高最明顯，第7天比第3天略有回落，10月齡小鼠比3、6月齡升高更顯著(P<0.05)。結(jié)論衰老是影響帕金森病(PD)模型黑質(zhì)紋狀體系統(tǒng)損傷的重要因素，并且與環(huán)境毒素起協(xié)同作用；氧化應(yīng)激參與了PD早期發(fā)病的病理反應(yīng)過(guò)程，并隨PD的進(jìn)展呈動(dòng)態(tài)變化，其反應(yīng)程度與年齡有關(guān)。

關(guān)鍵詞〔〕年齡；MPTP；快速老化小鼠；環(huán)氧化酶-2；帕金森病(PD)

中圖分類(lèi)號(hào)〔〕R741〔文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼〕A〔

基金項(xiàng)目：河北省醫(yī)學(xué)科學(xué)研究重點(diǎn)課題計(jì)劃(20110302)

通訊作者：王銘維(1956-)，女，教授，主任醫(yī)師，博士，博士生導(dǎo)師，主要從事腦老化與退行性疾病研究。

第一作者：馬曉偉(1980-)，女，碩士，主治醫(yī)師，主要從事神經(jīng)內(nèi)科疾病研究。

快速老化小鼠(SAMP8)是一種生長(zhǎng)周期較快的近交系小鼠，在研究衰老和衰老相關(guān)性疾病中有顯著優(yōu)勢(shì)〔1，2〕。帕金森病(PD)是一種常見(jiàn)的年齡相關(guān)的慢性神經(jīng)退行性疾病，臨床多表現(xiàn)為運(yùn)動(dòng)遲緩、肌僵直和靜止性震顫，黑質(zhì)紋狀體多巴胺(DA)能神經(jīng)元的選擇性損傷為其主要病理學(xué)改變，60歲以上老年人發(fā)病率在2%左右〔3〕。衰老與毒素是PD發(fā)病的主要因素，氧化應(yīng)激是目前發(fā)病機(jī)制的關(guān)注熱點(diǎn)。利用選擇性損傷DA能神經(jīng)元的神經(jīng)毒素1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氫吡啶(MPTP)研究PD，已成為目前公認(rèn)的理想模型〔4〕。前列腺素E2的合成限速酶環(huán)氧化酶(COX)-2能夠通過(guò)產(chǎn)生活性氧簇(ROS)介導(dǎo)DA的氧化及氧化應(yīng)激的發(fā)生〔5〕，在PD的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用，而PD氧化應(yīng)激反應(yīng)的增齡性改變目前尚未見(jiàn)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)利用SAMP8小鼠制作PD模型，通過(guò)檢測(cè)不同年齡小鼠血清COX-2水平，觀察衰老與毒素的雙重影響，初步探討其動(dòng)態(tài)改變與PD病程之間的關(guān)系。

1材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物SAMP8雌性小鼠108只，3、6、10月齡各36只，體質(zhì)量(28±2)g，清潔級(jí)，由香港中文大學(xué)解剖學(xué)系惠贈(zèng)。

1.2主要試劑與儀器MPTP(Sigma，USA)、超低溫離心機(jī)(德國(guó)eppendorf，5417R)、多功能酶標(biāo)儀(美國(guó)Thermo Labsystems，SN 354-01015)。

1.3實(shí)驗(yàn)分組與給藥各月齡小鼠均隨機(jī)分為：生理鹽水對(duì)照組和MPTP用藥組各18只，小鼠背部皮下注射MPTP(Sigma，USA)，每次14 mg/kg，連續(xù)注射4次，每次間隔2 h；對(duì)照組每次均注射等體積無(wú)菌生理鹽水。每組分別于第1次注射后1、3、7 d 3個(gè)時(shí)間點(diǎn)處死，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)6只。

1.4行為學(xué)檢測(cè)采用曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)各組小鼠給藥后1、3、7 d的自主活動(dòng)水平。實(shí)驗(yàn)裝置由曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)箱、圖像采集系統(tǒng)和操作分析系統(tǒng)組成。實(shí)驗(yàn)箱長(zhǎng)×寬×高為40 cm×40 cm×40 cm，并劃分為16個(gè)4 cm×4 cm的方格；實(shí)驗(yàn)箱正上方為攝像裝置。置于暗光動(dòng)物照明、環(huán)境安靜的場(chǎng)所。實(shí)驗(yàn)時(shí)將小鼠置于方箱的正中央，觀察其5 min內(nèi)活動(dòng)情況，記錄其垂直站立次數(shù)(前肢離開(kāi)地面1 cm以上的次數(shù))與水平穿格次數(shù)(三爪以上跨入鄰格)。每只小鼠實(shí)驗(yàn)結(jié)束，用90%酒精擦拭，以免留下氣味影響其他小鼠。

1.5標(biāo)本留取體積分?jǐn)?shù)10%水合氯醛麻醉小鼠，從眼球取血，離心取血清；之后迅速斷頭取腦，在冰上剝離出中腦組織，電子天平稱(chēng)重，置于液氮中冷凍。血清與組織均置于-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.6DA水平的檢測(cè)采用高效液相-電化學(xué)法(HPLC-ECD)檢測(cè)中腦DA含量，送檢于首都醫(yī)科大學(xué)神經(jīng)科學(xué)研究所。

1.7COX-2水平的檢測(cè)采用雙抗夾心酶聯(lián)免疫法(ELISA)測(cè)定各組小鼠血清中COX-2的含量。樣品及標(biāo)準(zhǔn)品均采用復(fù)孔，最終反應(yīng)底物用酶標(biāo)儀比色測(cè)定。

1.8統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS13.0軟件行單因素方差分析及SNK檢驗(yàn)。

2結(jié)果

2.1曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果與對(duì)照組相比，用藥組小鼠水平穿格次數(shù)與垂直站立次數(shù)均顯著減少(P<0.01)；與3、6月齡小鼠相比，10月齡小鼠在第1、3、7 d次數(shù)下降更明顯，尤其是垂直站立次數(shù)(P<0.05)。見(jiàn)表1，表2。

2.2DA水平的改變與對(duì)照組相比，注射MPTP后各月齡小鼠DA水平在1、3、7 d均明顯下降(P<0.01)，各時(shí)間點(diǎn)之間無(wú)顯著性差異(P>0.05)。而在第1、3、7 d 各個(gè)時(shí)間點(diǎn)，10月齡小鼠均比3、6月齡下降更明顯(P<0.05)。見(jiàn)表3。

表1　不同年齡組SAMP8小鼠各時(shí)間點(diǎn)水平

與對(duì)照組比較：1)P<0.05，2)P<0.01；與3、6月齡比較：3)P<0.05，下表同

表2　不同年齡組SAMP8小鼠各時(shí)間點(diǎn)垂直

2.3COX-2的表達(dá)與對(duì)照組相比，用藥組小鼠COX-2表達(dá)從第1天開(kāi)始即明顯增高，并在第3天出現(xiàn)高峰，之后第7天略有下降(P<0.05)；與3、6月齡小鼠相比，各時(shí)間點(diǎn)10月齡小鼠COX-2表達(dá)水平升高最明顯(P<0.05)。見(jiàn)表4。

表3　各組SAMP8小鼠各時(shí)間點(diǎn)DA含量

與對(duì)照組比較：1)P<0.01 ；與3、6月齡組比較：2)P<0.05

表4　不同年齡組SAMP8小鼠各時(shí)間點(diǎn)血清

與對(duì)照組比較：1)P<0.05；與3、6月齡比較：2)P<0.05

3討論

目前，60歲以上人群中PD的發(fā)病已達(dá)2%〔3〕，而其發(fā)病機(jī)制卻尚未明確，衰老、環(huán)境、氧化應(yīng)激、炎癥、遺傳等多種因素可能起到了協(xié)同作用〔6〕。SAMP8小鼠是日本京都大學(xué)Takeda等人培育得到的快速老化小鼠，壽命一般為12～13個(gè)月，在渡過(guò)一段正常生長(zhǎng)期(4～6月齡)后迅速出現(xiàn)行動(dòng)反應(yīng)遲緩、被毛光澤減退、脫毛等自然老化特征〔7〕，是目前公認(rèn)的研究衰老和衰老相關(guān)性疾病的理想的動(dòng)物模型〔2〕。MPTP在單胺氧化酶B的作用下轉(zhuǎn)變?yōu)橛卸拘缘臑?-甲基-4-苯基吡啶(MPP+)，通過(guò)黑質(zhì)紋狀體末梢優(yōu)先聚集，并成百倍地聚集于線粒體內(nèi)，通過(guò)特異性抑制氧化呼吸鏈復(fù)合體Ⅰ和電子傳遞，促進(jìn)活性氧簇和過(guò)量一氧化氮的生成而導(dǎo)致DA能神經(jīng)元的損傷，其神經(jīng)毒性作用已在多種動(dòng)物中得到證實(shí)，成為研究PD的理想模型。

本實(shí)驗(yàn)說(shuō)明其黑質(zhì)紋狀體系統(tǒng)的DA能神經(jīng)元受損，自發(fā)活動(dòng)水平下降，證實(shí)這種快速衰老小鼠對(duì)于MPTP同樣易感，可以成功復(fù)制PD模型，衰老是PD發(fā)病的影響因素之一，衰老與毒素二者起到了協(xié)同作用。

氧化應(yīng)激是導(dǎo)致DA能神經(jīng)元損傷的主要因素之一。COX-2是催化花生四烯酸合成前列腺素的限速酶，不僅是早期炎癥反應(yīng)的生物學(xué)指標(biāo)之一〔8〕，并且通過(guò)產(chǎn)生ROS引發(fā)氧化應(yīng)激反應(yīng)，介導(dǎo)了MPP+所致的神經(jīng)毒性作用，參與PD的病理機(jī)制〔9，10〕。研究認(rèn)為，COX-2可以將體內(nèi)的DA氧化為有活性的DA-醌類(lèi)，而這些DA-醌類(lèi)可以使α-突觸核蛋白聚集，之后導(dǎo)致PD的病理性標(biāo)志物路易小體的形成〔9，11，12〕，而COX-2抑制劑也是通過(guò)阻止COX-2介導(dǎo)的DA的氧化而起到神經(jīng)保護(hù)作用〔5〕。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)檢測(cè)SAMP8小鼠血清中COX-2的動(dòng)態(tài)變化，發(fā)現(xiàn)MPTP可使其反應(yīng)性增高，而老齡小鼠的增高比年輕小鼠更加明顯。同時(shí)，與既往那些檢測(cè)組織標(biāo)本或細(xì)胞內(nèi)COX-2變化的研究相比，臨床應(yīng)用取材方便，簡(jiǎn)單易行，并便于復(fù)查，患者容易接受，為臨床尋找血液檢測(cè)氧化應(yīng)激指標(biāo)起到了重要的提示作用。綜上所述，衰老與環(huán)境毒素都是影響PD發(fā)病的重要因素，并且二者起到了協(xié)同作用。氧化應(yīng)激反應(yīng)是PD的發(fā)病機(jī)制之一，其相關(guān)的氧化應(yīng)激指標(biāo)隨著PD的發(fā)生發(fā)展具有一些特征性的動(dòng)態(tài)變化，尤其是血清而不是組織檢測(cè)COX-2簡(jiǎn)易可行，對(duì)臨床早期輔助診斷和病情檢測(cè)具有一定的指導(dǎo)意義，但能否應(yīng)用于臨床還需進(jìn)一步研究證實(shí)。

4參考文獻(xiàn)

1Colas D，Gharib A，Bezin L，etal.Regional age-related changes in neuronal nitric oxide synthase (nNOS)，messenger RNA levels and activity in SAMP8 brain〔J〕.BMC Neurosci，2005；28(4)：615.

2Zhang L，Li Q，Wolff LT，etal.Changes of brain activity in the aged SAMP mouse〔J〕.Biogerontology，2007；8(2)：81-8.

3Sowell RA，Owen JB，Butterfield DA，etal.Proteomics in animal models of Alzheimer's and Parkinson's diseases〔J〕.Ageing Res Rev，2009；8(1)：1-17.

4Yokoyama H,Kuroiwa H，Yano R,etal.Targeting reactive oxygen species，reactive nitrogen species and inflammation in MPTP neurotoxicity and Parkinson's disease〔J〕.Neurol Sci，2008；29(5)：293-301.

5Hsieh YC，Mounsey RB，Teismann P.MPP+-induced toxicity in the presence of dopamine is mediated by COX-2 through oxidative stress〔J〕.Naunyn-Schmiedeberg's Arch Pharmacol，2011；384(2)：157-67.

6Cookson MR.The biochemistry of Parkinson's disease〔J〕.Ann Rev Biochem，2005；74：29-52.

7Cenci MA，Whishaw IQ，Schallert T.Animal models of neurological deficits：how relevant is the rat〔J〕.Nat Rev Neurosci，2002；3(7)：574-9.

8Wang T，Pei Z，Zhang W，etal.MPP+-induced COX2 activation and subsequent dopaminergic neurodegeneration〔J〕.FASEB J，2005；19(9)：1134-6.

9Teismann P，Tieu K，Choi DK，etal.Cyclooxygenase-2 is instrumental in Parkinson's disease neurodegeneration〔J〕.Proc Natl Acad Sci USA，2003；100(9)：5473-8.

10Teismann P，Vila M，Choi DK，etal.COX-2 and neurodegeneration in Parkinson's disease〔J〕.Ann N Y Acad Sci，2003；991：272-7.

11Periquet M，F(xiàn)ulga T，Myllykangas L,etal.Aggregated alpha-synuclein mediates dopaminergic neurotoxicity in vivo〔J〕.J Neurosci，2007；27(12)：3338-46.

12Wilson CA，Murphy DD，Giasson BI,etal.Degradative organelles containing mislocalized alpha-and beta-synuclein proliferate in presenilin-1 null neurons〔J〕.J Cell Biol，2004；165(3)：335-46.

〔2014-01-17修回〕

(編輯趙慧玲/曹夢(mèng)園)