MMP-2與TIMP-2在豚鼠形覺剝奪性近視眼脈絡(luò)膜表達的變化及調(diào)控機制

MMP-2與TIMP-2在豚鼠形覺剝奪性近視眼脈絡(luò)膜表達的變化及調(diào)控機制

吳振凱1劉雙珍夏曉波毛俊峰許惠卓

(中南大學(xué)湘雅醫(yī)院眼科，湖南長沙410000)

摘要〔〕目的觀察豚鼠形覺剝奪性近視眼脈絡(luò)膜組織中基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)-2及其特異性組織抑制劑(TIMP-2)表達的變化及其調(diào)控機制。方法將42只3周齡的三色豚鼠隨機分為A、B、C組，A組為對照組，共12只，將其隨機分為A1組和A2組，A1組6只，飼養(yǎng)14 d后處死，A2組6只，飼養(yǎng)21 d后處死；B組為遮蓋組，共18只，隨機分為B1、B2、B3組，B1組6只，將半透明眼罩縫于右眼遮蓋14 d后處死，B2組6只，將半透明眼罩縫于右眼遮蓋21 d后處死，B3組6只，將半透明眼罩縫于右眼遮蓋14 d后去除遮蓋7 d后處死；C組為注藥組，隨機分為C1、C2組，C1組6只，予右眼球周注射20 μl濃度為10-6 mmol/L的全反式視黃酸(RA)溶液，C2組6只，予右眼球周注射全反式視黃酸的助溶劑二甲基亞砜(DMSO)溶液作為對照，C1組、C2組均飼養(yǎng)21 d后處死；各組豚鼠左眼不做干預(yù)，A1組、B1組、B2組、B3組在飼養(yǎng)14 d后檢測眼球屈光度及眼軸長度，A2組、B2組、B3組、C1組、C2組在飼養(yǎng)21 d后檢測眼球屈光度及眼軸長度。豚鼠在處死后摘除眼球，對脈絡(luò)膜組織進行MMP-2和TIMP-2特異性組織抑制劑免疫組化染色，采用免疫組化吸光度測量軟件對脈絡(luò)膜組織陽性著色區(qū)進行吸光度測定。結(jié)果B1組右眼在遮蓋14 d后眼軸延長，近視形成，脈絡(luò)膜組織中MMP-2表達增強，與自身左眼、對照組A1組右眼相比差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。B1組右眼脈絡(luò)膜組織中TIMP-2染色陽性區(qū)灰度值與對照組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；B2組右眼在遮蓋21 d后眼軸延長，近視形成，脈絡(luò)膜組織中MMP-2表達增強，與自身左眼、對照組A2組右眼、B1組右眼相比，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。B2組脈絡(luò)膜組織中TIMP-2染色陽性區(qū)灰度值與對照組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；B3組右眼在遮蓋14 d后眼軸延長，近視形成，與自身左眼、A1組右眼相比，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，與B2組右眼相比，差異不具有統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；去除遮蓋7 d后，近視屈光度較B3組右眼在遮蓋14 d時降低，眼軸較B3組右眼在遮蓋14 d時縮短(均P<0.05)。脈絡(luò)膜組織中MMP-2與自身左眼、對照組A2組右眼、B1組右眼相比，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。B3組右眼脈絡(luò)膜TIMP-2染色陽性區(qū)灰度值與對照組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；C1組右眼球周注射全反式視黃酸溶液21 d后，眼軸延長、近視形成，脈絡(luò)膜MMP-2染色陽性區(qū)灰度值與A2組、C2組右眼、自身左眼相比，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，C1組脈絡(luò)膜組織中TIMP-2染色陽性區(qū)灰度值差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)論剝奪豚鼠的形覺可增強脈絡(luò)膜中MMP-2表達并造成豚鼠近視，在豚鼠眼球旁一次性注射全反式視黃酸溶液可導(dǎo)致脈絡(luò)膜中MMP-2表達增強并造成豚鼠近視，脈絡(luò)膜組織中的視黃酸可能是調(diào)控基質(zhì)金屬蛋白酶-2 的表達最終導(dǎo)致近視的上游調(diào)控因子。

關(guān)鍵詞〔〕MMP-2；TIMP-2；RA；近視

中圖分類號〔〕R7〔文獻標識碼〕A〔

基金項目：湖南省自然科學(xué)基金資助項目(08JJ3047)

通訊作者：劉雙珍(1951-)，女，主任醫(yī)師，教授，博士生導(dǎo)師，主要從事斜視、弱視、屈光不正、腫瘤整形的研究。

1常德市第一人民醫(yī)院眼科

第一作者：吳振凱(1982-)，男，碩士，主治醫(yī)師，主要從事白內(nèi)障、眼底病、屈光不正及斜弱視的研究?，F(xiàn)工作于常德市第一人民醫(yī)院。

隨著對近視發(fā)病機制研究的深入，脈絡(luò)膜在調(diào)控眼球生長中的作用日益受到重視。有研究發(fā)現(xiàn)視覺信息的變化可引起脈絡(luò)膜厚度的代償性改變〔1〕，但其具體機制尚未闡明。脈絡(luò)膜組織富含膠原成分，而基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)-2能降解Ⅳ、Ⅴ、Ⅸ、Ⅺ型膠原，但尚未明確脈絡(luò)膜中MMP-2在近視發(fā)生發(fā)展過程中的變化及其調(diào)控機制，本研究擬觀察形覺剝奪性近視眼脈絡(luò)膜中MMP-2及其特異性組織抑制劑(TIMP-2)表達的變化，并球周注射全反式視黃酸(RA)溶液探討其調(diào)控機制。

1材料與方法

1.1分組與干預(yù)將42只3周齡的豚鼠(動物均購于中南大學(xué)動物部動物研究所)隨機分A 、B、C組，A組12只，作為對照組，將其隨機分為A1組和A2兩組，其中A1組6只，飼養(yǎng)14 d后拉頸處死，A2組6只，飼養(yǎng)21 d后拉頸處死；B組18只，為遮蓋組，將其隨機等分為B1、B2、B3三組，其中B1組6只，將自制的半透明眼罩縫于右眼的眶周對右眼進行遮蓋，飼養(yǎng)14 d后拉頸處死，B2組6只，將半透明眼罩縫于右眼遮蓋21 d后拉頸處死，B3組6只，將半透明眼罩縫于右眼遮蓋14 d后再去除遮蓋的眼罩，再飼養(yǎng)7 d后拉頸處死；C組：注藥組，分為C1、C2兩組，每組6只，在實驗開始第1天予C1組豚鼠的右眼球周注射20 μl濃度為10-6mmol/L的RA溶液，C2組球周注射20 μl RA的助溶劑二甲基亞砜(DMSO)溶液，均為單次注射，21 d后處死，豚鼠左眼為自身對照眼。

1.2屈光度與眼軸的檢測屈光度：0.15%托吡卡胺眼液點眼3次將瞳孔充分散大，帶狀檢影驗光檢查豚鼠屈光度數(shù)。眼軸長度：以1%丁卡因滴眼液滴眼3次進行表面麻醉，表面麻醉成功后，以A超測定豚鼠的眼軸長度。屈光度及眼軸長度均為檢查3次后取平均值。

1.3組織切片行脈絡(luò)膜脫黑色素HE染色按預(yù)定時間處死豚鼠后剖取眼球，沿赤道部環(huán)形剪開眼球后將所取眼球后極部組織用4%多聚甲醛固定24 h，梯度酒精脫水，制作成石蠟切片，切片常規(guī)脫蠟至水，0.25%高錳酸鉀處理1～2 min使組織呈均勻的棕黃色時進行水洗，以2%的草酸溶液漂白組織2 min后在顯微鏡下進行檢查以確定黑色素是否去除，將黑色素被完全去除的組織切片進行充分水洗，PBS沖洗；3%H2O2處理10 min，以去除內(nèi)源性過氧化物酶的活性，行HE染色，于光鏡下觀察脈絡(luò)膜微結(jié)構(gòu)。

1.4免疫組化染色兔抗人多克隆抗體MMP-2、兔抗人多克隆抗體TIMP-2、兔二步法檢測試劑盒、DAB顯色試劑盒均購自北京中杉金橋公司，石蠟切片進行脫蠟處理，水化后脫黑色素處理，以3%H2O2溶液阻斷內(nèi)源性的過氧化物酶，對抗原進行熱修復(fù)，將切片置于溫度為95℃～98℃、pH值為6.0的枸櫞酸鹽溶液中處理20 min，在室溫下進行自然冷卻；一抗(兔抗人多克隆抗體MMP-2、兔抗人多克隆抗體TIMP-2，PBS 1∶100稀釋)4℃過夜；二抗(PowerVision免疫組化檢測試劑)37 ℃孵育，在顯微鏡下控制DAB的顯色，以蘇木素進行復(fù)染，脫水后透明處理，以中性樹膠封切片處理。在光鏡下，隨機選取脈絡(luò)膜中央斷面區(qū)域，采用免疫組化吸光度測量軟件對脈絡(luò)膜組織陽性著色區(qū)進行吸光度測定。

1.5統(tǒng)計學(xué)分析采用SPSS18.0軟件進行t檢驗和單因素方差分析。

2結(jié)果

由表1，2可見，B1組右眼眼軸長度、近視屈光度數(shù)以及脈絡(luò)膜MMP-2染色陽性區(qū)灰度值與自身左眼、A1組右眼相比，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。脈絡(luò)膜TIMP-2染色陽性區(qū)灰度值與自身左眼、A1組右眼相比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；B2組右眼長度、近視屈光度數(shù)以及脈絡(luò)膜MMP-2染色陽性區(qū)灰度值與自身左眼、A2組右眼、B1組右眼相比，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。脈絡(luò)膜TIMP-2染色陽性區(qū)灰度值與自身左眼、A2組右眼、B1組右眼相比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；B3組右眼眼軸長度以及近視屈光度數(shù)與自身左眼、A1組右眼相比，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，與B2組右眼相比，差異不具有統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；去除遮蓋7 d后，近視度為(-0.15±0.46)D，眼軸長度為(8.16±0.17)mm，近視屈光度較B3組右眼在遮蓋14 d時降低，眼軸縮短(P<0.05)。脈絡(luò)膜MMP-2染色陽性區(qū)灰度值與自身左眼、A2組右眼、B1組右眼相比，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。脈絡(luò)膜組織TIMP-2染色陽性區(qū)灰度值與自身左眼、A2組右眼、B1組右眼相比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。C1組右眼球周注射RA溶液21 d后，眼軸延長、近視形成，近視度，眼軸長度，脈絡(luò)膜MMP-2染色陽性區(qū)灰度值，與A2組、C2組右眼、自身左眼相比，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。脈絡(luò)膜組織TIMP-2染色

陽性區(qū)灰度值與A2組、C2組右眼、自身左眼相比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。HE染色后隨機雙盲閱片發(fā)現(xiàn)經(jīng)過形覺剝奪或者球周注射RA溶液后實驗眼后極部脈絡(luò)膜較對照眼相同部位的脈絡(luò)膜萎縮變薄，見圖1。

表1　各組屈光度及眼軸長度的比較( n=6,mm)

與B1組比較：1)P<0.05；與B2組比較：2)P<0.05；與B3組比較：3)P<0.05；與C1組比較：4)P<0.05；下表同

表2　各組脈絡(luò)膜MMP-2及TIMP-2染色陽性區(qū)

3討論

MMP-2為一種明膠酶A，通常以酶原的形式存在于組織中，在脈絡(luò)膜的黑色素細胞〔2〕、視網(wǎng)膜色素上皮細胞〔3〕等細胞內(nèi)均有表達。在特定的情況下MMP-2可被激活而具有降解Ⅳ、Ⅴ、Ⅸ、Ⅺ型膠原的作用。TIMP-2是MMP-2的特異性抑制因子，可以以非共價鍵形式緊密結(jié)合MMP-2并與之形成復(fù)合物，可抑制MMP-2降解細胞外基質(zhì)的作用。MMP-2和TIMP-2之間的平衡決定了MMP-2的活性，當兩者之間的平衡關(guān)系被打破時，細胞外基質(zhì)成分的降解和重組之間的動態(tài)平衡也會隨之而被打破。

目前關(guān)于近視眼脈絡(luò)膜厚度調(diào)控機制尚未被闡明，據(jù)實驗報道〔4〕，剝奪形覺可以導(dǎo)致近視的發(fā)生和發(fā)展，在近視進展時，眼球后極部脈絡(luò)膜的厚度變薄，而當形覺剝奪被去除后，脈絡(luò)膜厚度隨之部分恢復(fù)，這說明外界的視覺信息的變化可通過某些目前未知的途徑導(dǎo)致脈絡(luò)膜厚度的變化，而脈絡(luò)膜厚度的變化最終導(dǎo)致了眼軸長度的變化。本研究發(fā)現(xiàn)正常豚鼠脈絡(luò)膜中有MMP-2和TIMP-2的少量表達，在剝奪豚鼠的形覺2 w后，豚鼠眼脈絡(luò)膜組織中MMP-2表達的明顯增強，且其表達隨著形覺剝奪的時間延長而增加。在形覺剝奪被去除一段時間后，脈絡(luò)膜組織中的MMP-2表達較去形覺剝奪之前明顯減弱，而在此期間MMP-2的表達卻始終未見明顯變化，即脈絡(luò)膜中MMP-2和TIMP-2之間的平衡在近視產(chǎn)生的過程中被打破，而在形覺剝奪被去除后，近視程度在一定程度上減輕，在此過程中MMP-2和TIMP-2之間的平衡又趨向于恢復(fù)。豚鼠眼球脈絡(luò)膜組織中MMP-2的表達在剝奪形覺后增強、去剝奪后減弱，這與形覺剝奪性近視眼中脈絡(luò)膜厚度的變化方向是一致的。由于玻璃膜的內(nèi)膠原層、彈力層、外膠原層含有豐富的膠原纖維組織，且脈絡(luò)膜上腔主要由起源于鞏膜、脈絡(luò)膜、基質(zhì)層中疏松的膠原纖維組成框架，因此豚鼠形覺剝奪性近視眼脈絡(luò)膜組織中基質(zhì)金屬蛋白酶-2表達的增強極可能增加脈絡(luò)膜組織細胞外基質(zhì)成分的降解，導(dǎo)致脈絡(luò)膜厚度的變化，我們進行的組織切片顯微鏡下觀察到的豚鼠形覺剝奪眼脈絡(luò)膜的萎縮變薄證實了這種推論，這也符合臨床上所觀察到的人類近視眼脈絡(luò)膜萎縮變薄的現(xiàn)象。

據(jù)研究報道，豚鼠形覺剝奪后，隨著近視的發(fā)生和眼軸的延長，脈絡(luò)膜及視網(wǎng)膜組織中視黃酸的含量也隨之增加，而在去形覺剝奪后，隨著近視程度的減輕和眼軸長度的縮短，脈絡(luò)膜及視網(wǎng)膜RA含量也隨之而下降〔5〕，這種脈絡(luò)膜及視網(wǎng)膜組織中視黃酸的含量隨近視程度變化而變化的趨勢與我們研究所發(fā)現(xiàn)的形覺剝奪與去形覺剝奪時脈絡(luò)膜中MMP-2變化的趨勢高度一致。有研究報道〔6〕，視黃酸可以通過調(diào)控生長因子如TGF-β等而間接調(diào)控MMP家族的表達，而且我們前期的研究〔7〕也證實了外源性RA可增強后極部鞏膜MMP-2的表達，據(jù)此，我們推測形覺剝奪性近視眼后極部組織中RA水平的變化可能會影響脈絡(luò)膜組織中MMP-2與TIMP-2之間的平衡。眼組織具有強有力的吸聚視黃酸的能力，Mertz等〔8〕以24 mg/kg 視黃酸喂養(yǎng)小雞時，雞的視網(wǎng)膜組織中視黃酸的濃度達到普通內(nèi)源性視黃酸濃度水平的2倍，而在脈絡(luò)膜組織中則達到驚人的70倍。另外，有研究發(fā)現(xiàn)僅僅只給予極少量的外源性視黃酸，即可造成動物眼視網(wǎng)膜組織中視黃酸含量的升高，同時可觀察到動物眼軸的延長〔9〕，據(jù)此我們可以斷定，在眼球球旁局部注射的視黃酸溶液可被眼局部組織如鞏膜、脈絡(luò)膜或視網(wǎng)膜吸收并聚集。本研究提示形覺剝奪導(dǎo)致的眼球后極部組織中視黃酸水平的上升可能同樣是以相同的途徑增強了脈絡(luò)膜組織中MMP-2的表達，進而導(dǎo)致MMP-2與TIMP-2之間的平衡被打破，即視黃酸可能是形覺剝奪性近視眼脈絡(luò)膜中一個重要的調(diào)控MMP-2與TIMP-2之間平衡的上游因子。外界視覺環(huán)境的變化可能是通過調(diào)控眼球后極部組織中視黃酸的含量而來調(diào)控脈絡(luò)膜組織中MMP-2的表達，進而影響脈絡(luò)膜的厚度，最終導(dǎo)致了動物眼屈光度和眼軸的變化，當然，鞏膜組織中的視黃酸含量增加導(dǎo)致的鞏膜變薄和生物力學(xué)的變化也可能同時參與了近視的發(fā)生和發(fā)展。

4參考文獻

1Hung LF，Wallman J，Smith EL.Vision-dependent changes in the choroidal thickness of macaque monkeys〔J〕.Invest Ophthalmol Vis Sci，2000；41(6)：1259-69.

2Chu SC，Hu DN，Yang SF，etal. Uveal melanocytes produce matrix metalloproteinases-2 and-9 in vitro〔J〕.Pigment Cell Res，2004；17：636-42.

3Alexander JP，Bradley JM，Gabourel JD，etal. Expression of matrixmetalloproteinases and inhibitor by human retinal pigment epithelium〔J〕.Invest Ophthalmol Vis Sci，1990；31(12)：2520-8.

4Fitzgerald ME，Wildsoet CF，Reiner A.Temporal relationship of choroidal blood flow and thickness changes during recovery from form deprivation myopia in chicks〔J〕.Exp Eye Res，2002；74(5)：561-70.

5McFadden SA，Howlett MHC，Mertz JR.Retinoic acid signals the direction of ocular elongation in the guinea pig eye〔J〕.Vis Res，2004；44(2)：643-53.

6林文生，張農(nóng)，張頌文，等.全反式維甲酸可增強大鼠系膜細胞基質(zhì)金屬蛋白酶2-表達〔J〕.中華病理學(xué)雜志，1999；28(6)：456-7.

7王劍鋒，劉雙珍.外源性視黃酸對雞后鞏膜基質(zhì)MMP-2表達作用的動態(tài)觀察〔J〕.國際眼科雜志，2004；4(5)：815-9.

8Mertz JR，Howlett MHC.Retinoic acid from both the retinaand choroids influences eye growth〔J〕.Invest Ophthalmol Vis Sci，1999；40(4)：849-55.

9Mertz JR，Wallman J.Choroidal retinoic acid synthesis：a possible mediator between refractive error and compensatory eye growth〔J〕.Exp Eye Res,2000;70(4)：519-27.

〔2014-10-11修回〕

(編輯李相軍)