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    白細(xì)胞介素2和6對(duì)肝癌細(xì)胞表達(dá)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子D的調(diào)節(jié)

    2015-12-29 03:05:48孫超,唐瑞峰,白建國(guó)
    中國(guó)老年學(xué)雜志 2015年19期
    關(guān)鍵詞:白細(xì)胞介素6逆轉(zhuǎn)錄肝癌

    白細(xì)胞介素2和6對(duì)肝癌細(xì)胞表達(dá)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子D的調(diào)節(jié)

    孫超唐瑞峰白建國(guó)田貴金苑建磊齊帥

    (河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院肝膽外科,河北石家莊050011)

    摘要〔〕目的探討白細(xì)胞介素(IL)-2和IL-6對(duì)肝癌細(xì)胞表達(dá)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)-D的調(diào)節(jié)。方法采用由IL-2或IL-6分別對(duì)肝癌細(xì)胞株SMMC-7721和BEL-7402進(jìn)行刺激,采取逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)(RT-PCR)觀察其VEGF-D基因表達(dá)。結(jié)果IL-2使細(xì)胞株SMMC-7721和BEL-7402產(chǎn)生VEGF-D mRNA減少;IL-6對(duì)肝癌細(xì)胞株BEL-7402 VEGF-D mRNA表達(dá)存在促進(jìn)效果,但是無(wú)法從作用時(shí)間上來(lái)顯著判斷。IL-6對(duì)肝癌細(xì)胞株SMML-7721 VEGF-D mRNA表達(dá)存在促進(jìn)效果,當(dāng)濃度條件滿足情況下,促進(jìn)作用和作用時(shí)間存在正相關(guān)。結(jié)論抑制肝癌細(xì)胞VEGF-D mRNA的表達(dá)方面,IL-2作用比較明顯,對(duì)肝癌淋巴轉(zhuǎn)移能夠形成一定作用;肝癌細(xì)胞BEL-7402和SMML-7721 VEGF-D mRNA的表達(dá)方面,IL-6帶來(lái)的促進(jìn)效果明顯,但是對(duì)肝癌作用需更多研究。

    關(guān)鍵詞〔〕肝癌;白細(xì)胞介素2;白細(xì)胞介素6;血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子D;逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)

    中圖分類號(hào)〔〕R735.7〔文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼〕A〔

    項(xiàng)目基金

    通訊作者:唐瑞峰(1965-),男,主任醫(yī)師,教授,博士,碩士生導(dǎo)師,主要從事肝膽疾病研究。

    第一作者:孫超(1983-),男,主治醫(yī)師,碩士,主要從事肝膽疾病研究。

    原發(fā)性肝癌臨床癥狀出現(xiàn)晚,通過(guò)手術(shù)的方式來(lái)切除的可能性很低,且預(yù)后情況不良。癌細(xì)胞的活躍性與血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)家族之間存在緊密的關(guān)系。作為VEGF家族的一員,VEGF-D體內(nèi)表達(dá)分兩種:一是正常表達(dá),二是腫瘤細(xì)胞的異常表達(dá),與腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移形成密切關(guān)系。細(xì)胞因子對(duì)VEGF家族成員表達(dá)形成影響,而常見(jiàn)的炎性介質(zhì)白細(xì)胞介素(IL)-2、IL-6作用較明顯。本研究探討IL-2和IL-6對(duì)肝癌細(xì)胞株VEGF-D基因表達(dá)的調(diào)節(jié),分析肝癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移效應(yīng)。

    1材料與方法

    1.1細(xì)胞培養(yǎng)、刺激、分組及總RNA的提取細(xì)胞培養(yǎng):無(wú)菌、37℃,濕度為含5%CO2的飽和狀態(tài);培養(yǎng)基RPMI1640,第一階段要求內(nèi)部AMV逆轉(zhuǎn)錄酶+逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)物,溫度42℃,時(shí)長(zhǎng)60 min;第二階段是將cDNA 2 μl+PCR反應(yīng)物+VEGF-D正反義引物,劑量均為2.5 μl,總反應(yīng)體系為20 μl,SMMC-7721和BEL-7402。刺激:①人肝癌細(xì)胞株復(fù)蘇-傳代-穩(wěn)定對(duì)數(shù)生長(zhǎng),將10%胎牛血清更換成0.1%胎牛血清,型號(hào)不變,持續(xù)培養(yǎng)12 h,主要目的是避免血清與細(xì)胞增殖之間的不良作用。分組:刺激12 h后,培養(yǎng)液繼續(xù)調(diào)整作為分組依據(jù),實(shí)驗(yàn)組分兩種培養(yǎng)液,一是0.1、1、10、100、200 μg/L的IL-2 0.1%胎牛血清,二是0.1、1、10、100、200 μg/L的IL-6 0.1%胎牛血清。培養(yǎng)3、6、12、24 h。對(duì)照組:刺激后,實(shí)驗(yàn)組中的兩種培養(yǎng)液添加磷酸鈉鹽緩沖液(PBS),要求劑量一致。總RNA的提?。憾〞r(shí)獲得細(xì)胞,刺激方法是Trizol一步法,總RNA提取包括刺激前后兩個(gè)時(shí)間段。

    1.2逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)反應(yīng)材料:第一階段,RNA 2 μl+AMV逆轉(zhuǎn)錄酶+逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)物,溫度控制在42℃,時(shí)長(zhǎng)控制在60 min;第二階段是將cDNA 2 μl+PCR反應(yīng)物+VEGF-D正反義引物,劑量2.5 μl,總反應(yīng)體系為20 μl,先溫度控制在95℃,實(shí)現(xiàn)預(yù)變性5min,再控制溫度為94℃,變性45 s,55℃退火45 s,72℃持續(xù)1 min 30 s,循環(huán)40次,再控制溫度72℃反應(yīng)時(shí)長(zhǎng)為5 min;而針對(duì)cDNA 2 μl+PCR反應(yīng)物+β-actin正反義引物,劑量2.5 μl,總反應(yīng)體系為20 μl:先溫度控制在95℃,實(shí)現(xiàn)預(yù)變性5 min,再控制溫度為94℃,變性30 s,55℃退火30 s,72℃持續(xù)30 s,循環(huán)35次,再控制溫度72℃反應(yīng)時(shí)長(zhǎng)為5 min;PCR技術(shù)應(yīng)用于擴(kuò)增循環(huán)數(shù)的確定。產(chǎn)物先后需要電泳、染色,再進(jìn)行掃描(凝膠型)分析,其中電泳使用1.5%普通瓊脂糖凝膠、染色采取溴乙啶,實(shí)現(xiàn)DNA電泳條帶掃描和光量子強(qiáng)度處理,將VEGF-D與β-actin比值作為表達(dá)水平的參照,對(duì)VEGF-D產(chǎn)物相對(duì)定量。VEGF-D上游引物:5' AGC TGG GGA AGA GTA CCA ACA 3',下游引物:5' CAC AGA GAG CTG GTT CCT GGA 3',對(duì)應(yīng)生成一個(gè)422個(gè)堿基的基因片段。β-actin上游引物:5' TGA GAC CTT CAA CAC CCC AG 3',下游引物:5' GCC ATC TCT TGC TCG AAG TC 3',對(duì)應(yīng)生成一個(gè)316個(gè)堿基的基因片段。

    1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)。

    2結(jié)果

    IL-2抑制肝癌細(xì)胞株BEL-7402 VEGF-D mRNA的表達(dá),濃度及作用時(shí)間不存在相關(guān)性。見(jiàn)圖1。IL-2抑制肝癌細(xì)胞株SMML-7721 VEGF-D mRNA的表達(dá),并在0.1~100 μg/L范圍內(nèi)隨濃度的增加,抑制作用逐步增強(qiáng),但與作用時(shí)間不存在相關(guān)性。見(jiàn)圖2。IL-6與肝癌細(xì)胞株BEL-7402 VEGF-D mRNA表達(dá)存在促進(jìn)效果,但與作用時(shí)間不存在顯著相關(guān)。見(jiàn)圖3。IL-6與肝癌細(xì)胞株SMML-7721 VEGF-D mRNA表達(dá)存在促進(jìn)效果,當(dāng)濃度條件滿足情況下,促進(jìn)作用和作用時(shí)間存在正相關(guān)。見(jiàn)圖4。

    1.對(duì)照組;2.0.1 μg/L;3.1 μg/L;4.10 μg/L;5.100 μg/L;6.200 μg/L;下圖同 圖1 IL-2對(duì)肝癌細(xì)胞SMMC-7402表達(dá) VEGF-D mRNA的影響

    圖2 IL-2對(duì)肝癌細(xì)胞BEL-7721表達(dá) VEGF-D mRNA的影響

    圖3 IL-6對(duì)肝癌細(xì)胞SMMC-7402表達(dá) VEGF-D mRNA的影響

    圖4 IL-6對(duì)肝癌細(xì)胞BEL-7721表達(dá) VEGF-D mRNA的影響

    3討論

    原發(fā)性肝癌轉(zhuǎn)移能力很強(qiáng),主要是肝內(nèi)轉(zhuǎn)移為主。人VEGF-D在淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞增生方面產(chǎn)生的促進(jìn)效果表現(xiàn)出了特異性,如淋巴管新生和淋巴轉(zhuǎn)移方面均存在相關(guān)性。研究〔1,2〕表明,VEGF-D與肝癌及胰腺癌表達(dá)之間存在明顯的相關(guān)性,對(duì)于這些腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移等表現(xiàn)出來(lái)的生物學(xué)行為存在相關(guān)性。IL-2可抑制胰腺癌淋巴轉(zhuǎn)移,主要限制胰腺癌細(xì)胞VEGF-D mRNA表達(dá),而IL-6對(duì)于某些胰腺癌細(xì)胞VEGF-D mRNA表達(dá)也有促進(jìn)效果。

    “細(xì)胞因子對(duì)于惡性腫瘤的進(jìn)一步發(fā)展”的研究證明部分細(xì)胞因子是能夠產(chǎn)生重要效果的〔3,4〕。此類細(xì)胞因子表現(xiàn)出來(lái)的介質(zhì)作用對(duì)癌細(xì)胞和基質(zhì)細(xì)胞形成一個(gè)相互作用的機(jī)制,這種作用機(jī)制下,出現(xiàn)癌細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移到身體其他部位,如淋巴等產(chǎn)生的影響作用很重要。缺氧,K-ras、p53基因的突變、VHL基因產(chǎn)物、生長(zhǎng)因子如成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(FGF)-2和轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(TGF)-B、轉(zhuǎn)錄因子如缺氧誘導(dǎo)因子(HIF)-1α和sp1等這些細(xì)胞因子和生長(zhǎng)因子都可以產(chǎn)生誘導(dǎo)效果。而新生血管的形成方面,細(xì)胞因子IL-1、IL-6等通過(guò)對(duì)上述家族的表達(dá)誘導(dǎo),是可以產(chǎn)生這種效果的〔5~7〕。Salven 等〔8〕證實(shí):IL-1α對(duì)炎癥細(xì)胞的誘導(dǎo),能夠在VEGF-A實(shí)現(xiàn)血管新生;Cohen等〔9〕證實(shí):IL-6對(duì)腫瘤細(xì)胞株可在刺激狀況下,形成VEGF-A;Huang等〔10〕證實(shí):IL-6在胃癌VEGF-A的表達(dá),會(huì)導(dǎo)致產(chǎn)生癌組織新生血管;Wei等〔11〕證實(shí):IL-6激活VEGF-A能夠促進(jìn)頸部腫瘤的新生血管生長(zhǎng)。唐瑞峰等〔12〕證實(shí):IL-1α和IL-6因誘導(dǎo)促進(jìn) VEGF-A和C產(chǎn)生,作為一種調(diào)節(jié)因子作用于胰腺癌細(xì)胞。

    IL-2在免疫治療或腫瘤生物治療方面已經(jīng)得到重視和具有廣泛的使用率〔13〕。報(bào)道〔14,15〕顯示,IL-2受體在腫瘤細(xì)胞表面上具有明顯的相互關(guān)系,這種相互結(jié)合(IL-2與受體)的情況下,限制腫瘤細(xì)胞繼續(xù)發(fā)展。本研究表明IL-2對(duì)肝癌細(xì)胞的增殖可以產(chǎn)生明顯的限制效果,甚至可以實(shí)現(xiàn)對(duì)肝癌細(xì)胞在形成VEGF-D方面來(lái)實(shí)現(xiàn)抑制作用。

    IL-6的功能開(kāi)發(fā)已經(jīng)得到了非常廣泛的程度〔16〕,表現(xiàn)出來(lái)的生物活性作為關(guān)鍵因子,在機(jī)體細(xì)胞因子中占據(jù)了重要地位,表現(xiàn)最活躍的是在造血系統(tǒng)、免疫應(yīng)答及炎癥反應(yīng)方面。該因子的特性是不僅直接對(duì)腫瘤細(xì)胞進(jìn)行作用,還可以對(duì)周邊細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)的生存環(huán)境進(jìn)行改變,進(jìn)而間接作用于腫瘤細(xì)胞,同時(shí),腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的刺激或抑制作用方面,IL-6都表現(xiàn)出明顯的雙面性效果,分析其原因是IL-6跟靶細(xì)胞特性相關(guān)聯(lián)。Strassmann等〔17〕研究顯示,IL-6在促進(jìn)腫瘤病情惡化方面,是通過(guò)腫瘤惡病質(zhì)狀態(tài)調(diào)節(jié)來(lái)產(chǎn)生的。IL-6也與腫瘤抗體的免疫情況有關(guān),也表現(xiàn)出了腫瘤細(xì)胞的表達(dá)相關(guān)性很顯著。IL-6水平與腫瘤臨床分期有關(guān),隨著分期的時(shí)間推移,腫瘤的負(fù)荷程度就越大,IL-6水平與之呈正相關(guān),從腫瘤病情來(lái)說(shuō),存在遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的晚期病患血清IL-6水平表現(xiàn)出很高的水平,而無(wú)轉(zhuǎn)移病患則很低;治療效果與血清IL-6水平呈負(fù)相關(guān)。本研究中IL-6的促進(jìn)效果表明,該因子能夠讓肝癌細(xì)胞形成VEGF-D,并引發(fā)肝癌淋巴轉(zhuǎn)移。抑制肝癌細(xì)胞VEGF-D mRNA的表達(dá)方面,IL-2作用比較明顯,對(duì)肝癌淋巴轉(zhuǎn)移能夠形成一定作用。肝癌細(xì)胞BEL-7402和SMML-7721 VEGF-D mRNA的表達(dá)方面,IL-6帶來(lái)的促進(jìn)效果明顯,但是對(duì)肝癌作用需更多研究。

    4參考文獻(xiàn)

    1唐瑞峰,李智峰,張志明,等.VEGF-D及其受體在胰腺癌中的表達(dá)及意義〔J〕.腫瘤,2008;28(1):61-4.

    2唐瑞峰,張志明,馬景枝,等.血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子D及其受體flt-4在肝癌中的表達(dá)及意義〔J〕.臨床薈萃,2007; 22(18):1311-4.

    3Kellokumpu-Lehtinen P,Talpaz M,Harris D,etal.Leukemia inhibitory factor stimulates breast,kidney and prostate cancer cell proliferation by paracrine and autocrine pathways〔J〕.Int J Cancer,1996;66:515-9.

    4Edwards DR,Murphy G.Cancer proteases-invasion and more〔J〕.Nature,1998;394:527-8.

    5邢毅飛,肖亞軍,張齊鈞,等.白細(xì)胞介素-6對(duì)前列腺癌細(xì)胞體外生長(zhǎng)的影響及其調(diào)節(jié)〔J〕.中華實(shí)驗(yàn)外科雜志,1999;16(6):502-3.

    6Von-Marschall Z,Cramer T,Hocker M,etal.Dual mechanism of vascular endothelial growth factor upregulation by hypoxia in human hepatocellular carcinoma〔J〕.Gut,2001;48(1):87-96.

    7Ravi R,Mookergee B,Bhujwalla Z,etal.Regulation of tumor angiogensis by p53-induced degradation of hypoxia-inducible factor 1alpha〔J〕.Genes Dev,2000;14(1):34-44.

    8Salven P,Hattori K,Heissing B,etal.Interleukin-1alpha promotes angiogenesis in vivo VEGF-VEGFR-2 pathway by inducing inflammatory cell VEGF synthesis and secretion〔J〕.FASEB J,2002;16:1471-3.

    9Cohen T,Nahari D,Cerem LW,etal.Interleukin 6 induces the expression of vascular endothelial growth factor〔J〕.J Biol Chem,1996;271(2):736-41.

    10Huang SP,Wu MS,Shun CT,etal.Interleukin-6 increases vascular endothelial growth factor and angiogenesis in gastric carcinoma〔J〕.J Biome Sci,2004;11(4):517-27.

    11Wei LH,Kuo ML,Chen CA,etal.Interleukin-6 promotes cervical tumor growth by VEGF dependent angiogenesis via a STAT3 pathway〔J〕.Oncogene,2003;22:1517-27.

    12唐瑞峰,王曙霞,張風(fēng)瑞,等.白細(xì)胞介素-1α、6對(duì)肝癌細(xì)胞分泌血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子A、C的調(diào)節(jié)作用〔J〕.中華實(shí)驗(yàn)外科雜志,2005;22(4):401-3.

    13湯釗猷.現(xiàn)代腫瘤學(xué)〔M〕.上海:上海醫(yī)科大學(xué)出版社,1993:381-4.

    14Sikora J,Dworaeki G,Trybus M,etal.Correlation between DNA content,expression of tumor cells and immunophenol-type of lymphocytes from malignant pleural effusions〔J〕.Tumour Biol,1998;19(3):196-204.

    15Senba T,Kurki M,Arakawa F,etal.Tumor growth suppression by a mouse/human ahimteric anti-CEA antibody and lymphokine-activated killer cells in vitro and in SCID mouse xenograft model〔J〕.Anticancer Res,1998;18(1A):17-24.

    16楊鎮(zhèn).腫瘤免疫學(xué)〔M〕.湖北:湖北科學(xué)技術(shù)出版社,1998:62-4.

    17Strassmann G,Fong M,Kenney JS,etal.Evidence for the involvement of interleukin-6 in experimental cancer cance-xia〔J〕.J Clin Invest,1992;89(5):1681-4.

    〔2014-07-19修回〕

    (編輯苑云杰)

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