內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)基因在2型糖尿病合并脂肪肝小鼠肝臟中的表達(dá)變化

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)基因在2型糖尿病合并脂肪肝小鼠肝臟中的表達(dá)變化

程莉娟成細(xì)華喻嶸1曾辛1

(湖南中醫(yī)藥大學(xué)醫(yī)學(xué)院，湖南長(zhǎng)沙410208)

摘要〔〕目的探討內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(ERS)在高脂飲食2型糖尿病轉(zhuǎn)基因MKR小鼠脂肪肝發(fā)生中的作用。方法高脂飼料誘發(fā)MKR鼠形成脂肪肝，觀察肝臟形態(tài)變化，檢測(cè)肝臟甘油三酯和脂肪酸水平，RT-PCR檢測(cè)小鼠肝臟內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)基因mRNA表達(dá)變化。結(jié)果與正常小鼠比較，MKR組小鼠肝臟GRP78、XBP1、FAS、ACC-α、GSK3β mRNA表達(dá)水平升高(P<0.05)；與MKR小鼠比較，高脂飲食MKR小鼠肝臟甘油三酯(TG)和脂肪酸(FFA)水平顯著升高(P<0.01)，肝臟GRP78、XBP1、CHOP、SREBP1c 、FAS、ACC-α、GSK3β和EDEM1基因mRNA表達(dá)水平均增加(P<0.01)，而ApoB100 mRNA表達(dá)水平降低(P<0.01)。結(jié)論ERS參與調(diào)節(jié)肝臟脂質(zhì)及ApoB100的代謝過(guò)程，在轉(zhuǎn)基因2型糖尿病MKR鼠脂肪肝形成中發(fā)揮重要作用。

關(guān)鍵詞〔〕內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激； 糖尿病合并脂肪肝； MKR小鼠； 脂代謝

中圖分類號(hào)〔〕R285.5〔

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金(81102593，81273753)；中國(guó)博士后科學(xué)基金(20110491258)；湖南省科技計(jì)劃項(xiàng)目(2014FJ3023)；地方高校國(guó)家級(jí)大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目(201210541003)；湖南省中西醫(yī)結(jié)合基礎(chǔ)重點(diǎn)學(xué)科資助

通訊作者：成細(xì)華(1974-)，女，教授，博士，主要從事中醫(yī)藥防治糖尿病及其并發(fā)癥的機(jī)制研究。

The related gene expressions of endoplasmic reticulum stress in the liver of type 2 diabetes mice combined with liver steatosis

CHENG Li-Juan,CHENG Xi-Hua,YU Rong,etal.

Hunan University of Chinese Medicine,Changsha 410208,Hunan,China

Abstract【】ObjectiveTo observe the effect of endoplasmic reticulum stress on the formation of liver steatosis in MKR mice raised by high fat feeds. MethodsMKR mice were raised by high fat feeds to form liver steatosis. The pathological changes of liver were examined,and the levels of TG and FFA in the liver were examined too. RT-PCR was used to analyze the related gene expressions of endoplasmic reticulum stress in the liver. ResultsThe gene expressions of GRP78,XBP1,FAS,ACC-α and GSK3β on mRNA level in MKR mice were elevated slightly in contrast with normal mice(P<0.05). The levels of TG and FFA in the liver were increased remarkably,and the gene expressions of GRP78,XBP1,CHOP,SREBP1c,FAS,ACC-α,GSK3β and EDEM1 on mRNA level in MKR mice with liver steatosis were elevated significantly in contrast with MKR mice(P<0.01),while the gene expression of apoB100 was decreased(P<0.01). ConclusionsThere has a close relationship between the liver steatosis and the involvement of ERS in the lipid metabolism in the liver of MKR mice.

【Key words】Endoplasmic reticulum stress；Diabetes combined with liver steatosis；MKR mice；Lipid metabolism

第一作者：程莉娟(1979-)，女，碩士，主要從事中醫(yī)藥防治糖尿病的機(jī)制研究。

非酒精性脂肪肝(NAFLD)是2型糖尿病的常見(jiàn)肝臟并發(fā)癥〔1〕。根據(jù)糖尿病是形成NAFLD的重要原因之一，本課題組以高脂飲食喂養(yǎng)轉(zhuǎn)基因2型糖尿病 MKR鼠,建立 2型糖尿病并發(fā)NAFLD模型。該模型動(dòng)物的肝質(zhì)量增加,肝指數(shù)上升，肝細(xì)胞彌漫性脂肪性變，糖脂代謝紊亂，血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶和谷草轉(zhuǎn)氨酶濃度升高，與臨床2型糖尿病合并 NAFLD極為一致，為糖尿病合并NAFLD機(jī)制研究提供一個(gè)很好的平臺(tái)〔2〕。研究表明，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(ERS)在2型糖尿病合并NAFLD中具有重要作用〔3，4〕。ERS可能通過(guò)影響脂代謝相關(guān)基因，如固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白等的表達(dá)，增加肝臟脂肪酸的合成和積聚〔5〕。另外，ERS在肝載脂蛋白(Apo)B100的合成和分泌過(guò)程中也具有重要的調(diào)節(jié)作用，影響并制約肝細(xì)胞合成和分泌極低密度脂蛋白〔4〕。目前，ERS在2型糖尿病合并NAFLD發(fā)病中的作用尚未完全明了。本研究探討ERS在2型糖尿病合并NAFLD小鼠模型中的作用機(jī)制。

1材料與方法

1.1動(dòng)物8周齡FVB/N野生小鼠購(gòu)自維通利華，MKR小鼠(采用組織特異過(guò)度表達(dá)轉(zhuǎn)基因技術(shù)產(chǎn)生)，由美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生研究院(Dr.D.LeRoith)提供純合子MKR小鼠，經(jīng)自然交配后繁殖的后代用于實(shí)驗(yàn)研究。上述實(shí)驗(yàn)用小鼠由湖南中醫(yī)藥大學(xué)SPF級(jí)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心飼養(yǎng)。

1.2主要試劑TG、FFA測(cè)定試劑盒(南京建成生物工程研究所)；動(dòng)物組織總RNA提取試劑盒(北京TIANGEN生物技術(shù)公司)；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(Fermentas公司)；PCR引物由上海生工公司合成；2×Taq PCR MasterMIX(北京TIANGEN生物技術(shù)公司)。

1.3實(shí)驗(yàn)分組隨機(jī)選取8周齡FVB/N野生小鼠10只作為正常對(duì)照組。20只8周齡經(jīng)遺傳鑒定的MKR鼠根據(jù)性別、體質(zhì)量，隨機(jī)分為MKR組、MKR高脂組，每組10只。MKR高脂組以高脂飼料喂養(yǎng)，高脂飼料為動(dòng)物基礎(chǔ)飼料加15%豬油、1%膽固醇。FVB/N野生小鼠、MKR組以基礎(chǔ)飼料喂養(yǎng)8 w，試驗(yàn)中無(wú)小鼠死亡。

1.4肝組織形態(tài)學(xué)觀察取小鼠肝臟最大葉距邊緣5 mm處肝組織，10%甲醛溶液固定，石蠟包埋，病理切片，HE染色后光鏡觀察，拍照。同時(shí)取一大小約1 mm3的肝組織，4%戊二醛溶液固定，用于透射電鏡(日本JEOL公司1230型)觀察肝臟的超微結(jié)構(gòu)。

1.5肝臟TG和FFA的測(cè)定取新鮮肝臟組織，用9 g/L的生理鹽水4℃制備10%的肝勻漿，3 000 rp/min離心15 min，取上清。嚴(yán)格按照試劑盒要求測(cè)定TG和FFA含量。

1.6RT-PCR檢測(cè)MKR小鼠肝組織脂代謝ERS相關(guān)基因的表達(dá)取各組小鼠新鮮肝臟組織，用動(dòng)物組織總RNA提取試劑盒抽提其總RNA，采用紫外分光光度計(jì)測(cè)定其濃度。取1 μg總RNA，用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒以O(shè)ligo(dT)為引物進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。使用DNAStar 6.0軟件，根據(jù)GenBank中小鼠的ERS相關(guān)靶基因葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白(GRP)78、X盒結(jié)合蛋白(XBP)1、C/EBP同源蛋白(CHOP)、固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白(SREBP)1c、脂肪酸合酶(FAS)、乙酰輔酶A羧化酶(ACC-α)、糖原合酶激酶(GSK3)β、Apo B100和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)甘露糖苷酶樣蛋白(EDEM)1 mRNA序列設(shè)計(jì)PCR引物(見(jiàn)表1)。選擇最適條件分別對(duì)小鼠肝臟靶基因和內(nèi)參基因β-肌動(dòng)蛋白(β-actin)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR產(chǎn)物進(jìn)行2.5%瓊脂糖凝膠電泳，凝膠掃描分析系統(tǒng)拍照并分析電泳條帶灰度值，以靶基因與β-actin電泳條帶密度比值計(jì)算各靶基因mRNA相對(duì)表達(dá)量。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取均值。

表1　小鼠肝臟內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關(guān)基因RT-PCR引物序列

2結(jié)果

2.1肝臟組織形態(tài)學(xué)變化見(jiàn)圖1。FVB/N野生小鼠和MKR鼠肝臟大體形態(tài)基本相似，MKR鼠肝臟色澤較深；MKR高脂組小鼠肝臟外觀呈彌漫性腫大，邊緣鈍而厚，質(zhì)如面團(tuán)，表面色澤蒼白。光鏡下，F(xiàn)VB/N野生小鼠和MKR鼠肝臟肝小葉結(jié)構(gòu)正常；肝細(xì)胞排列規(guī)則成條索狀，以中央靜脈為中心，呈放射狀分布，肝細(xì)胞大小正常，胞核位于細(xì)胞中央。MKR高脂組小鼠肝細(xì)胞大泡性脂變混有小泡性脂變，在大泡性脂變?yōu)橹鞯募?xì)胞中，胞核擠至邊側(cè)。 電鏡下，F(xiàn)VB/N野生小鼠和MKR鼠肝細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)正常，有豐富的線粒體。MKR高脂組小鼠肝細(xì)胞內(nèi)堆滿大小不一的脂滴。

2.2肝臟TG和FAA含量檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表2。與正常對(duì)照組比較，MKR組小鼠肝臟TG和FAA含量增加，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。與MKR組小鼠比較，MKR高脂組小鼠肝臟TG和FAA含量異常增加(P<0.01)。

A：肝臟大體形態(tài)(左：MKR組；中：MKR高脂組，右：FVB/N野生小鼠)；B1：MKR組(HE，×400)；B2：MKR高脂組(HE，×400)；C1：MKR組(EM，×9 700)；C2：MKR高脂組(EM，×9 700)　 圖1　各組小鼠肝臟病理變化

組別nTG(μmol/g)FAA(μmol/g)正常對(duì)照組1024.64±2.5528.24±4.12MKR組1026.50±4.2130.21±5.35MKR高脂組1052.94±5.731)102.23±12.281)

與MKR組比較：1)P<0.01

2.3肝臟內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和脂代謝相關(guān)基因表達(dá)變化見(jiàn)圖2、表3。與正常對(duì)照組比較，MKR組小鼠肝臟GRP78、XBP1、FAS、ACC-α、GSK3β mRNA表達(dá)水平明顯升高(P<0.05)；CHOP、SREBP1c和EDEM1 mRNA表達(dá)升高，ApoB100 mRNA表達(dá)降低，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。與MKR組小鼠比較，MKR高脂組小鼠肝臟內(nèi)質(zhì)應(yīng)激和脂代謝相關(guān)基因mRNA表達(dá)異常進(jìn)一步加劇，GRP78、XBP1、CHOP、SREBP1c 、FAS、ACC-α、GSK3β 和EDEM1 mRNA表達(dá)水平均顯著增加(P<0.01)，而ApoB100 mRNA表達(dá)水平顯著降低(P<0.01)。

表3　小鼠肝臟ERS相關(guān)基因mRNA

與正常對(duì)照組比較，1)P<0.05，2)P<0.01；與MKR組比較，3)P<0.05，4)P<0.01

M：電泳Marker；NG：正常對(duì)照組；MG：MKR組；HG：MKR高脂組 圖2　小鼠ERS相關(guān)基因RT-PCR電泳結(jié)果

3討論

肥胖、糖尿病、高脂血癥被認(rèn)為是NAFLD患者脂肪肝發(fā)生發(fā)展的危險(xiǎn)因素〔6〕。本研究所選骨骼肌特異性胰島素樣生長(zhǎng)因子1受體功能缺失鼠(MKR鼠)在出生5 w左右即可表現(xiàn)為顯著的肌肉、肝臟、脂肪組織胰島素抵抗及高血糖、胰島β細(xì)胞功能紊亂等情況〔7，8〕。盡管MKR鼠肝臟TG及FFA水平較FVB/N野生鼠有升高趨勢(shì)，但差異沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，且肝臟組織形態(tài)學(xué)未見(jiàn)病理改變。而高脂飲食MKR鼠肝臟TG及FFA水平則顯著升高，光鏡及電鏡下更可見(jiàn)大泡和小泡混合性肝細(xì)胞脂肪變性明顯，表明該2型糖尿病合并NAFLD動(dòng)物模型建立成功。

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是蛋白質(zhì)合成、折疊、運(yùn)輸以及儲(chǔ)存鈣的主要場(chǎng)所，對(duì)各種刺激極為敏感。當(dāng)機(jī)體功能紊亂時(shí)，錯(cuò)誤折疊和未折疊的蛋白在腔內(nèi)聚集且細(xì)胞內(nèi)鈣平衡紊亂的狀態(tài)稱為ERS〔9〕。近年來(lái)，研究表明ERS介導(dǎo)了肥胖、T2DM以及NAFLD等病變生理過(guò)程〔3，4，10〕。一方面，細(xì)胞通過(guò)非折疊蛋白反應(yīng)(UPR)來(lái)適應(yīng)ERS。位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的肌醇需要酶(IRE)1、雙鏈RNA活化蛋白激酶樣內(nèi)質(zhì)網(wǎng)激酶(PERK)和活化轉(zhuǎn)錄因子(ATP)6是UPR反應(yīng)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白。當(dāng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)非折疊或錯(cuò)誤折疊蛋白積累時(shí)，GRP78與上述3種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白解離并激活它們。激活的IRE1則催化轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)蛋白XBP1 mRNA剪切表達(dá)〔11〕。XBP1+/-小鼠肝臟中ERS反應(yīng)增強(qiáng)，同時(shí)胰島素信號(hào)傳導(dǎo)效率降低，在高脂飲食誘導(dǎo)的條件下容易產(chǎn)生IR和2型糖尿病〔10〕。早期ERS通過(guò)激活UPR及時(shí)有效逆轉(zhuǎn)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的內(nèi)環(huán)境增強(qiáng)細(xì)胞存活能力，但ERS持續(xù)存在，凋亡勢(shì)必為最終結(jié)果。CHOP是一種ERS特異轉(zhuǎn)錄因子，當(dāng)各種應(yīng)激情況出現(xiàn)后表達(dá)顯著增加，影響細(xì)胞的存活。Oyadoman等〔12〕發(fā)現(xiàn)CHOP基因敲除后可增強(qiáng)細(xì)胞對(duì)抗ERS所致凋亡的能力，阻止2型糖尿病的發(fā)生。因此，GRP78、XBP1和CHOP被廣泛視為ERS的標(biāo)志性分子。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果揭示，MKR小鼠肝臟GRP78、XBP1 mRNA表達(dá)水平較FVB/N野生鼠明顯升高，表明MKR鼠體內(nèi)已開(kāi)始誘發(fā)ERS。而高脂飲食MKR小鼠肝臟上述3種基因的mRNA表達(dá)水平較MKR鼠進(jìn)一步升高，表明高脂飲食MKR小鼠肝臟ERS程度加劇。

ERS還直接通過(guò)影響脂代謝相關(guān)基因，導(dǎo)致肝細(xì)胞脂肪合成增多，在2型糖尿病并發(fā)脂肪肝中具有重要作用〔5，13〕。ERS時(shí)可激活內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上的膜連接蛋白SREBP1c作為轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)入胞核，調(diào)控靶基因包括脂肪合成酶如ACC-α、FAS等的表達(dá)〔14〕。當(dāng)SREBP-1c表達(dá)上調(diào)至超過(guò)機(jī)體的自我調(diào)節(jié)及適應(yīng)能力時(shí)，則引起其靶基因過(guò)度表達(dá)，F(xiàn)FA合成異常增多，肝臟脂質(zhì)代謝障礙，更易導(dǎo)致NAFLD的發(fā)生〔15〕。 李小山等〔16〕高脂喂養(yǎng)大鼠12 w后，肝臟ACC-α、FAS基因在 mRNA和蛋白質(zhì)水平上表達(dá)均顯著升高，形成NAFLD。ERS還能調(diào)節(jié)肝臟中ApoB100合成和分泌，通過(guò)減少VLDL形成來(lái)減少肝脂肪輸出，加劇肝細(xì)胞中脂肪堆積〔17〕。另外，ERS可以通過(guò)JNK(c-JUN NH2 terminal kinase)途徑激活GSK3β的表達(dá)，激活下游膽固醇/甘油三酯合成和攝取相關(guān)基因表達(dá)，促進(jìn)肝細(xì)胞內(nèi)FFA和膽固醇的積累〔18〕。本實(shí)驗(yàn)中，MKR鼠肝臟脂肪酸合成相關(guān)基因僅FAS、ACC-ɑ以及GSK3β mRNA表達(dá)水平較FVB/N野生鼠明顯升高，而高脂喂養(yǎng)的MKR小鼠肝臟SREBP1c、FAS、ACC-ɑ以及GSK3β mRNA表達(dá)水平較MKR鼠均顯著增加，ApoB100表達(dá)則顯著下降，表明ERS加劇了脂代謝紊亂。

EDEM1是通過(guò)XBP1作用產(chǎn)生的一種α-甘露糖苷酶樣應(yīng)激蛋白，能促進(jìn)ERS時(shí)產(chǎn)生的不完全折疊或錯(cuò)誤折疊蛋白的降解，是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關(guān)性降解途徑的標(biāo)志分子之一〔19〕。研究發(fā)現(xiàn)高脂飲食T2DM小鼠在18周齡時(shí)肝臟EDEM1 mRNA表達(dá)顯著增加，可能影響了2型糖尿病小鼠肝臟ApoB100和VLDL合成和分泌，加速了脂肪肝的形成〔4〕。本實(shí)驗(yàn)中，高脂喂養(yǎng)的MKR小鼠肝臟較FVB/N野生鼠、MKR小鼠同樣EDEM1m RNA表達(dá)明顯升高，這進(jìn)一步表明高脂飲食MKR鼠ERS增加了肝臟脂質(zhì)積累，更易導(dǎo)致脂肪肝。

綜上所述，高脂喂養(yǎng)的MKR鼠，從生化及組織形態(tài)學(xué)上均顯示肝臟存在脂肪性變。同時(shí)，研究結(jié)果表明2型糖尿病MKR鼠肝臟內(nèi)存在ERS，導(dǎo)致少數(shù)脂代謝相關(guān)基因FAS、ACC-ɑ以及GSK3β mRNA表達(dá)水平升高，但在實(shí)驗(yàn)期間暫未形成脂肪肝；以高脂喂養(yǎng)的MKR鼠肝臟脂代謝相關(guān)基因SREBP1c 、FAS、ACC-ɑ、GSK3β、ApoB100和EDEM1 mRNA表達(dá)均異常增加，說(shuō)明高脂飲食加劇了MKR鼠肝臟ERS，ERS進(jìn)而又促進(jìn)肝臟脂類合成，抑制肝臟脂類輸出，從而參與肝臟脂肪性變。肝臟ERS和脂代謝相關(guān)基因蛋白表達(dá)的差異有待進(jìn)一步研究。因此，本研究可為T(mén)2DM合并NAFLD的治療提供新靶點(diǎn)。

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〔2013-07-18修回〕

(編輯徐杰)