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    左歸丸胚胎期干預(yù)對GDM大鼠子代發(fā)生IGT的影響

    2015-12-27 05:48:17王悅堯王永輝許凱霞李艷彥
    關(guān)鍵詞:左歸丸子代胚胎

    王悅堯,王永輝,許凱霞,柴 智,李艷彥,周 然

    (1.成都中醫(yī)藥大學(xué),四川成都611137; 2.山西中醫(yī)學(xué)院,山西太原030024)

    左歸丸胚胎期干預(yù)對GDM大鼠子代發(fā)生IGT的影響

    王悅堯1,王永輝2,許凱霞2,柴 智2,李艷彥2,周 然2

    (1.成都中醫(yī)藥大學(xué),四川成都611137; 2.山西中醫(yī)學(xué)院,山西太原030024)

    目的:研究左歸丸胚胎期干預(yù)能否對妊娠糖尿?。℅DM)大鼠子代高糖高脂飲食誘發(fā)的糖耐量減低(IGT)起到預(yù)防作用。方法:育齡雌性SD大鼠受孕后隨機分為正常對照組、妊娠糖尿組、胰島素組、左歸丸組、聯(lián)合干預(yù)組。受孕當(dāng)日妊娠糖尿病組和3個干預(yù)組按45 mg/kg腹腔內(nèi)注射鏈尿佐菌素(STZ),復(fù)制妊娠糖尿病模型。并于孕4 d~19 d給藥干預(yù)(左歸丸10 g/kg灌胃,胰島素20 IU/kg皮下注射)。孕鼠產(chǎn)子后,每窩取1只雄鼠,組成新組,組別不變。母乳喂養(yǎng)3 w,普通生長飼料喂養(yǎng)2 w,除正常對照組外,其余各組子鼠均于6 w齡開始高糖高脂飲食。10 w后葡萄糖干化學(xué)法測各組子鼠空腹血糖(FPG)、糖負荷后2 h血糖(P2hG),全自動生化儀測血脂,酶聯(lián)免疫法測脂聯(lián)素濃度,并進行HE染色觀察肝臟的病理形態(tài)。結(jié)果:15 w齡末,模型組子鼠發(fā)生IGT;與正常對照組比較,妊娠糖尿病組TC、TG顯著升高,HDL-C、APN顯著降低,藥物干預(yù)組可以改善相關(guān)指標(biāo),聯(lián)合用藥組優(yōu)于單用藥物組。結(jié)論:糖尿病大鼠妊娠期予補腎陰方左歸丸干預(yù)能夠有預(yù)防高糖高脂飲食引發(fā)子代成年大鼠發(fā)生IGT。

    左歸丸;妊娠糖尿?。籌GT;脂聯(lián)素

    糖耐量低減(IGT)是介于正常糖耐量與糖尿病之間的一種糖代謝異常狀態(tài),屬糖尿病前期階段。目前全世界約有3.08億人患IGT[1],IGT人群發(fā)展為糖尿病的可能性與正常人群相比高6倍,總體死亡率高1.48倍[2],故IGT的干預(yù)工作越來越受到重視。大量研究證明,IGT的發(fā)生是多因素綜合作用的結(jié)果,這些因素大致包括了先天遺傳因素和后天影響機體能量代謝的因素。遺傳因素構(gòu)成了個體對后天那些能夠影響機體能量代謝的因素的易感性,而多種后天因素則通過多種信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機制干擾機體能量代謝系統(tǒng)的不同元件和環(huán)節(jié)并激活與之相應(yīng)的基因活性,成為IGT發(fā)生的外部誘因。課題組前期采用補腎方藥于胚胎發(fā)育期給藥,發(fā)現(xiàn)補腎陰方左歸丸可以有效預(yù)防高脂飼料引發(fā)子代成年大鼠IGT的發(fā)生。本實驗在前期研究的基礎(chǔ)上,復(fù)制先天不良因素刺激(宮內(nèi)高糖)加后天不良生活習(xí)慣(高糖高脂喂養(yǎng))的模型,并在胚胎期進行干預(yù),觀察左歸丸是否可以預(yù)防子代大鼠IGT的發(fā)生。

    1 材料與方法

    1.1 實驗材料

    1.1.1 實驗動物 健康的生育期SD雌性大鼠(10 w齡,體重220 g~260 g),雄性大鼠(12 w齡,體重300 g~340 g)。許可證號SCXK(京)2009-0017,由中國食品藥品檢定研究院提供。

    1.1.2 藥物與試劑 左歸丸(河南省宛西制藥股份有限公司,國藥準(zhǔn)字Z41020696);諾和靈R筆芯(諾和諾德,國藥準(zhǔn)字J20121010);STZ(Sigma公司,批號040M1357);檸檬酸(C6H8O7·H2O)、檸檬酸鈉(C6H5Na3O7·2H2O)(天津市科密歐化學(xué)試劑公司);葡萄糖氧化酶法試劑盒(批號1403282)、大鼠脂聯(lián)素酶聯(lián)免疫定量檢測試劑盒(上海西唐生物科技有限公司,批號1411271)。

    1.1.3 實驗飼料 配方:酪蛋白(23.3%)、淀粉(8.5%)、糊精(11.7%)、蔗糖(20.1%)、纖維素(5.8%)、豆油(2.9%)、豬油(20.7%)、胱氨酸(0.4%)、多礦(1.2%)、CaHPO4(1.5%)、CaCO3(0.6%)、多維(1.2%)、檸檬酸鉀(1.9%)、酒石酸膽堿(0.2%),總能:4 730 kJ/kg。由北京華阜康生物科技股份有限公司提供,許可證編號SCXK(京)0219363,2004-0008。

    1.1.4 實驗儀器 羅氏樂康全活力型血糖測定儀(德國羅氏診斷有限公司)、YXJ-2離心機(湘儀離心機儀器有限公司)、電子秤(國產(chǎn),MP200-1)、電子分析天平(德國,A210P)、常溫臺式離心機(日本,Kubota2100)、烘箱(杭州卓馳有限公司)、酶標(biāo)儀(美國伯樂Bio-rad imark)、自動生化分析儀(日本,01ympusAU400)。

    1.2 實驗方法

    1.2.1 分組與給藥 適應(yīng)性飼養(yǎng)1 w后,開始實驗。雌鼠禁食不禁水12 h,剪尾取血測空腹血糖,血糖值≤6.1 mmol/L作為納入標(biāo)準(zhǔn)。以雌、雄比例2∶1合籠過夜,次晨雌鼠陰道涂片鏡檢見精子者,定為受孕。將孕鼠隨機分5組,每組10只,即正常對照組、妊娠糖尿病組、胰島素干預(yù)組(胰島素組)、左歸丸干預(yù)組(左歸丸組)、左歸丸聯(lián)合胰島素干預(yù)組(聯(lián)合干預(yù)組)。除正常對照組外,其余4組于受孕當(dāng)日禁食12 h后,經(jīng)腹腔注射鏈脲佐菌素(STZ)45 mg/kg,特異性損傷胰島β細胞,復(fù)制妊娠糖尿病模型。正常對照組腹腔內(nèi)注射檸檬酸緩沖液。于妊娠第3天測孕鼠血糖,若血糖值≥l6.7 mmol/L,則建模成功。藥物干預(yù)組孕鼠于妊娠第3天開始給藥:左歸丸按10 g/kg體重灌胃,胰島素按20 IU/kg皮下注射,1次/d,至孕19 d。正常對照組和妊娠糖尿病組灌胃蒸餾水,1次/d。孕20 d~22 d孕鼠分娩產(chǎn)子。各組子鼠均每窩隨機取1只雄鼠,組成新組,組別不變。各組子鼠由正常母鼠喂養(yǎng)3 w,普通生長飼料喂養(yǎng)4 w~5 w,6 w齡開始,正常對照組子鼠常規(guī)飼料喂養(yǎng),其余各組子鼠高糖高脂飼料喂養(yǎng)。參考趙寶珍等[3]對糖耐量受損大鼠的檢測方法,每周對子代大鼠做1次糖耐量試驗。實驗過程中,大鼠置于12 h/12 h明暗循環(huán),自由飲食,溫度25℃、濕度50%~60%條件下飼養(yǎng)。1.2.2 指標(biāo)檢測 采用1999年世界衛(wèi)生組織(WHO)糖尿病診斷標(biāo)準(zhǔn):糖負荷試驗后2 h血糖(P2hG)在7.8~11.1 mmol/L時診斷為IGT。15 w齡末,禁食不禁水12 h,剪尾測空腹血糖FPG,后予50%葡萄糖注射液灌胃,2 g/kg,2 h后再次剪尾采血,測P2hG。模型組平均P2hG達IGT標(biāo)準(zhǔn)時,各組動物隔夜禁食12 h,以10%水合氯醛(0.3 mL/100 g)腹腔注射麻醉,腹主動脈采血,用自動生化分析儀檢測血脂;采用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測脂聯(lián)素濃度,采用上海西唐生物科技有限公司提供的ELISA數(shù)據(jù)處理軟件。所有大鼠肝臟組織固定后送至中國輻射防護研究院動物研究所進行常規(guī)石蠟包埋、切片、HE染色,光鏡下觀察形態(tài)學(xué)改變情況。

    1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

    采用SPSS19.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析,所得結(jié)果用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示。各組間均數(shù)比較應(yīng)用單因素方差分析(one-way ANOVA)。該數(shù)據(jù)資料為完全隨機設(shè)計資料,呈正態(tài)分布,經(jīng)方差齊性分析后,兩組之間的比較選擇LSD-t檢驗,P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

    2 結(jié) 果

    2.1 左歸丸胚胎期干預(yù)對子代大鼠FPG、P2hG、APN的影響

    正常對照組、妊娠糖尿病組、胰島素組、左歸丸組、聯(lián)合干預(yù)組空腹血糖相互比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義。妊娠糖尿病組P2hG顯著高于正常對照組(P<0.01),胰島素組、左歸丸組、聯(lián)合干預(yù)組P2hG低于妊娠糖尿病組(P<0.01,P<0.05)。妊娠糖尿病組APN低于正常對照組(P<0.01),聯(lián)合干預(yù)組APN高于妊娠糖尿病組(P<0.05)。結(jié)果見表1。

    2.2 左歸丸胚胎期干預(yù)對子代大鼠血脂的影響

    妊娠糖尿病組TC、TG顯著高于正常對照組(P<0.05),胰島素組和聯(lián)合用藥組TC、TG低于妊娠糖尿病組(P<0.05);妊娠糖尿病組HDL-C較正常對照組顯著降低(P<0.01),胰島素組、左歸丸組、聯(lián)合干預(yù)組HDL-C高于妊娠糖尿病組(P<0.01)。結(jié)果見表2。

    表1 左歸丸胚胎期干預(yù)對子代大鼠FPG、P2hG、APN的影響 (x±s)

    表2 左歸丸胚胎期干預(yù)對子代大鼠血脂的影響 (mmol/L,x±s)

    2.3 對子代大鼠肝臟病理形態(tài)的影響

    正常對照組肝細胞肝小葉結(jié)構(gòu)清晰,肝細胞以中央靜脈為中心向周圍呈放射狀分布,肝竇清晰可見,肝索排列整齊,肝細胞中央有大而圓的核,細胞質(zhì)均勻,未見脂滴沉積。妊娠糖尿病組肝細胞腫脹,部分肝細胞呈氣球樣變,多數(shù)肝細胞內(nèi)可見大小不等,數(shù)量不一的脂滴空泡,一些肝細胞核則被脂肪滴擠得明顯偏位,肝索排列紊亂,偶有點狀壞死。與妊娠糖尿病組相比,左歸丸組和胰島素組肝臟脂肪變有不同程度的減輕,脂滴數(shù)量減少,脂滴變小,細胞及小葉結(jié)構(gòu)不同程度恢復(fù),表明胚胎期的干預(yù)對子代大鼠的肝脂肪變性有一定的預(yù)防作用。聯(lián)合干預(yù)組肝組織結(jié)構(gòu)基本趨于正常,肝索以中央靜脈為中心向四周呈放射狀排列明顯恢復(fù)整齊,輪廓和細胞分界也較其他幾組清晰;無明顯脂肪空泡現(xiàn)象,細胞核圓,胞質(zhì)豐富,但中央靜脈中間仍可見少量淤血,結(jié)果見圖1。

    3 討論

    本課題在造模時,復(fù)制了宮內(nèi)高糖環(huán)境模型,以期觀察妊娠糖尿病對子代發(fā)生IGT是否有影響,妊娠期給予藥物干預(yù)是否可以起到預(yù)防作用。實驗結(jié)果顯示,子代大鼠經(jīng)高糖高脂飼料喂養(yǎng)10 w后,模型組(妊娠糖尿病組)子代大鼠糖負荷試驗平均血糖水平已達到IGT的診斷標(biāo)準(zhǔn),這比許凱霞等[4]用高脂飼料誘發(fā)正常妊娠大鼠的子代發(fā)生IGT的時間要早2 w,推測可能與妊娠大鼠宮內(nèi)高糖環(huán)境有關(guān)。并且模型組的TC與TG顯著高于正常妊娠組,APN與HDL-C低于正常妊娠組,提示在IGT發(fā)生的同時,血脂、脂聯(lián)素等亦發(fā)生伴隨改變。藥物干預(yù)組的相關(guān)指標(biāo)較模型組有明顯改善,聯(lián)合用藥的效果要優(yōu)于單用胰島素或左歸丸,提示兩者在改善相關(guān)指標(biāo)方面具有協(xié)同作用。

    在本實驗中,左歸丸對妊娠糖尿病大鼠子代發(fā)生IGT的預(yù)防作用可以從祖國醫(yī)學(xué)和現(xiàn)代醫(yī)學(xué)兩方面進行解釋。

    糖尿病在祖國醫(yī)學(xué)中稱之為消渴病。中醫(yī)認為多飲、多食、多尿、消瘦的產(chǎn)生,多與肺燥、胃熱、腎虛有關(guān)[5]。然而治療上雖有肺燥、胃熱、腎虛之異,但發(fā)病根本在腎,腎陰虧虛是糖尿病發(fā)病的實質(zhì),治宜注重滋陰補腎。IGT屬于糖尿病前期,故可以從消渴的病因病機上來認識。胚胎期予補腎陰方左歸丸一方面顧及了孕鼠在妊娠期間陰血下聚以蔭胎致其陰血之不足的生理特點,從而有利于胚胎在其腹中有充足的物質(zhì)基礎(chǔ),是中醫(yī)“補母益子”論的體現(xiàn);另一方面,既然糖尿病是以陰虛為本,燥熱為標(biāo),則可認為IGT也類似,通過補其母之真陰,則藥物可通過胎盤間接影響胚胎發(fā)育,在胎兒期補真陰,可充實先天之本,增強后天之免疫力[6]。

    現(xiàn)代醫(yī)學(xué)認為,2型糖尿病(T2DM)是一種復(fù)雜遺傳病,95%是由遺傳、環(huán)境、行為多種因素共同參與、相互作用引起的多基因-多因子?。?]。遺傳因素決定了個體對糖尿病的易感性,而多種環(huán)境因素可能是誘發(fā)糖尿病發(fā)生的外部原因。由于遺傳因素在T2DM的發(fā)病過程中占主要地位,因此,如何在胚胎發(fā)育期阻斷糖尿病遺傳的發(fā)生途徑,成為當(dāng)前研究的一個熱點。

    圖1 對子代大鼠肝臟病理形態(tài)的影響(HE×200)

    健康與疾病的發(fā)展起源(Developmental origins of health and disease,DOHD)學(xué)說認為胎兒對宮內(nèi)不良環(huán)境的反應(yīng)使其自身代謝和器官組織結(jié)構(gòu)發(fā)生適應(yīng)性調(diào)節(jié),如果不良因素得不到及時糾正,這種適應(yīng)性調(diào)節(jié)將導(dǎo)致包括血管、胰腺、肝、肺等機體組織和器官在代謝結(jié)構(gòu)上發(fā)生永久性改變,進而演變?yōu)槌扇似诘募膊。?]。這一漫長“程序化”發(fā)育改變可被諸多后天環(huán)境因素放大,從而加速成人疾病的發(fā)展過程。大量的流行病學(xué)研究已經(jīng)證實,幾乎所有的慢性疾病都與生命早期的環(huán)境存在一定的相關(guān)性;受到成人不良生活方式影響的疾病如胰島素抵抗、2型糖尿病、脂肪代謝異常、肥胖、高血壓和心血管疾病在胎兒期即被程序化,即生命早期的環(huán)境導(dǎo)致的機體結(jié)構(gòu)或功能變化或在基因修飾水平上發(fā)生了永久變化。許凱霞等[6]已發(fā)現(xiàn)補腎方胚胎期干預(yù)可以提高子代大鼠脂聯(lián)素的mRNA表達,而脂聯(lián)素是脂肪組織所表達和分泌的多種產(chǎn)物中與胰島素抵抗關(guān)系最緊密的一個特異性細胞因子,是胰島素抵抗的保護因子。其可以抑制肝臟脂肪合成、促進脂肪氧化分解、減輕餐后血清游離脂肪酸(FFA)的升高,增強周圍組織對胰島素的敏感性,抑制炎癥因子產(chǎn)生,從而阻斷IGT的形成與進展。本實驗中左歸丸和胰島素干預(yù)組的APN值高于模型組,聯(lián)合干預(yù)組的APN值則顯著高于模型組,推測藥物干預(yù)組對APN的影響可能是影響IGT發(fā)病的機制之一。

    在我國相當(dāng)一部分地區(qū),作為糖尿病的后備軍——糖耐量受損的人群超過了糖尿病患者的數(shù)量[9]。近年來,流行病學(xué)資料顯示IGT的發(fā)病呈逐年增長趨勢且年輕化。IGT人群發(fā)生DM的危險明顯高于非IGT人群,而且心血管病變的發(fā)生機制早在IGT階段已啟動。因此,對糖尿病前期患者進行有效的干預(yù),延緩或阻斷糖尿病前期向DM轉(zhuǎn)變,降低DM及其慢性并發(fā)癥的發(fā)生率,對改善人們的生活質(zhì)量、提高健康水平、節(jié)約衛(wèi)生資源有著重大意義[10]。

    [1]Grant S J,Bensoussan A,Chang D,et al.Chinese herbal medicines for people with impaired glucose tolerance or impaired fasting blood glucose[J].Cochrane Database Syst Rev,2009,7(4):1 002-1 006.

    [2]Alberti K G,Zimmet P,Shaw J.International diabetes federation:a consensus on type 2 diabetes prevention[J].Diabete Med,2007,24(3):451-463.

    [3]趙寶珍,謝曉云,張曉瑞.糖耐量受損大鼠血清脂聯(lián)素瘦素與冠狀動脈病變的關(guān)系[J].中國藥物與臨床,2006,6(6):408-410.

    [4]許凱霞,王永輝,楊向竹,等.補腎方胚胎期干預(yù)子代成年大鼠IGT及其胰島素抵抗、瘦素抵抗的研究[J].中國實驗方劑學(xué)雜志,2013,19(8):167-171.

    [5]王靜,王慶,王珍貞,等.中醫(yī)不同治法對四氧嘧啶糖尿病模型大鼠的降糖作用[J].中西醫(yī)結(jié)合學(xué)報,2010,8(8):781-784.

    [6]許凱霞,王永輝,楊向竹,等.補腎方胚胎期干預(yù)預(yù)防子代成年大鼠IGT及其脂聯(lián)素異常的實驗研究[J].山西中醫(yī)學(xué)院學(xué)報,2013,14(2):27-29.

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    [9]許樟榮.護士在糖尿病教育和管理中承擔(dān)著重大責(zé)任[J].中華護理雜志,2004,39(10):727-729.

    [10]趙鐵耘,李秀鈞.糖尿病整治研究新理念[J].中國實用內(nèi)科雜志,2005,25(4):302-304.

    (編輯:翟春濤)

    臨床研究與經(jīng)驗

    Clinic Research and Experience

    西醫(yī)斷病,中醫(yī)辨證,兩者似乎截然不同。但如果戴上分子醫(yī)學(xué)的眼鏡,你就會發(fā)現(xiàn)證原來是寓于病之中的。從病識證,揭示了一條分子診斷和分子治療的新途徑。

    Influence of Zuogui Pill on IGT′s intervention occurred embryonic rats of GDM

    Wang Yueyao1,Wang Yonghui2,Xu Kaixia2,Chai Zhi2,Li Yanyan2,Zhou Ran2
    (1.Chengdu University of Traditional Chinese Medicine,Chengdu Sichuan 611137;2.Shanxi College of Traditional Chinese Medicine,Taiyuan Shanxi 030024)

    Objective:To study the preventive effect of Zuogui Pill on rats with GDM offspring induced by high-fat diet. Methods:Pregnant reproduction SD rats were randomly divided into normal pregnancy group,GDM control group,diabetes insulin treated group,Zuogui Pill treated group,Zuogui Pill combined with insulin treated group.Sreptozotocin(STZ)were injected in rats abdomen so as to induce GDM model in GDM control group and the three treated groups.GDM control group and the three treated groups were prevented by drug respectively.After offsrings were born,a male mouse were taken to form a new group.The mice were given breastfeeding 3 weeks and general growth of diet 2 weeks.Except normal control group,other groups were given the high fat diet after 6 weeks.FPG and P2hG were measured by dry chemical measurement of glucose,blood lipids were measured by ACA,adiponectin concentration were measured by ELISA and liver pathomorphism were stained by HE and observed.Results:At the end of 15 weeks,IGT model were occurred in the model group offspring.Compared with the normal group,model group TC,TG significantly increased,HDL-C,APN significantly reduce.Conclusions:Zuogui Pill prevention in the period of diabete rats pregancy has the prevention offspring adult rats effect of occurrence of IGT induced by high-sugar and high-fat diet in adult rats

    Zuogui pill;gestational diabetes;IGT;adiponectin

    R285.5

    A

    1671-0258(2015)01-0030-04

    山西省科技廳科研創(chuàng)新重點團隊建設(shè)項目(2012081018);山西省國際科技合作項目(2012081055-2)

    王悅堯,在讀博士,E-mail:wangyueyaoys@126.com

    王永輝,博士,副教授,碩士研究生導(dǎo)師,E-mail:wyh766188@sina.com

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