多重耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌耐藥性及β-內(nèi)酰胺酶耐藥基因的研究

楊 艷, 王厚照 , 張 玲

(安徽醫(yī)科大學(xué) 解放軍174臨床學(xué)院,福建 廈門 361003)

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多重耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌耐藥性及β-內(nèi)酰胺酶耐藥基因的研究

楊 艷, 王厚照*, 張 玲

(安徽醫(yī)科大學(xué) 解放軍174臨床學(xué)院,福建 廈門 361003)

研究多重耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌的耐藥性及β-內(nèi)酰胺酶耐藥基因的攜帶情況。采用VIKET Compact 2 全自動(dòng)細(xì)菌鑒定系統(tǒng)進(jìn)行細(xì)菌鑒定，采用紙片擴(kuò)散法(K-B法)測定鮑曼不動(dòng)桿菌對(duì)抗菌藥物的耐藥性，應(yīng)用聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)法檢測β-內(nèi)酰胺酶耐藥基因。32株多重耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌對(duì)13種常用抗菌藥物的耐藥率均>80%，對(duì)亞胺培南和美羅培南耐藥率分別高達(dá)78.1%和71.9%，頭孢哌酮/舒巴坦耐藥率31.3%，多粘菌素B抗菌活性最好，耐藥率0%。檢出超廣譜β-內(nèi)酰胺酶(ESBLs)和頭孢菌素酶(AmpC)耐藥基因，未檢出金屬β-內(nèi)酰胺酶(MBLs)耐藥基因。32株多重耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌TEM基因均陽性，17株檢出PER基因，29株檢出ADC基因。有16株菌同時(shí)攜帶TEM、PER、ADC基因。結(jié)果表明，同時(shí)攜帶TEM、PER、ADC基因是安徽醫(yī)科大學(xué)解放軍174臨床學(xué)院鮑曼不動(dòng)桿菌產(chǎn)生多重耐藥性的原因之一。

鮑曼不動(dòng)桿菌；多重耐藥性；β-內(nèi)酰胺酶；耐藥基因

鮑曼不動(dòng)桿菌是導(dǎo)致醫(yī)院內(nèi)感染重要的病原菌，近年來隨著抗菌藥物的廣泛應(yīng)用和侵入性診療措施的普及，引起的感染率逐年增加。由于其基因組的特殊性，具有快速獲得耐藥性的特征，導(dǎo)致鮑曼不動(dòng)桿菌耐藥現(xiàn)象越來越嚴(yán)重，多重耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌(Multidrug-resistant Acinetobacter baumannii，MDR-AB)檢出率日益上升，引起臨床的廣泛關(guān)注。鮑曼不動(dòng)桿菌耐藥機(jī)制非常復(fù)雜，對(duì)β-內(nèi)酰胺類藥物的耐藥機(jī)制主要包括：產(chǎn)生β-內(nèi)酰胺酶、外膜蛋白(Outer Membrane Protein，OMP)丟失、青霉素結(jié)合蛋白(Penicillin Binding Proteins，PBPs)的改變和外排泵過表達(dá)等[1]，其中產(chǎn)生β-內(nèi)酰胺酶最重要[2-3]。MDR-AB中已發(fā)現(xiàn)包括TEM、SHV、CTX-M、PER、VEB、IMP、VIM、 SIM 、ADC、OXA-23、OXA-24等多種β-內(nèi)酰胺酶基因[4-6]，不同國家不同地區(qū)流行的β-內(nèi)酰胺酶基因型不同，導(dǎo)致細(xì)菌的耐藥特性也不盡相同。為了解安徽醫(yī)科大學(xué)解放軍174臨床學(xué)院多重耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌耐藥性與β-內(nèi)酰胺酶耐藥基因的關(guān)系，本研究對(duì)臨床分離的32株多重耐藥菌株進(jìn)行了分析。

1 材料與方法

1.1 材料

菌株來源 收集2013年11月至2014年3月安徽醫(yī)科大學(xué)解放軍174臨床學(xué)院臨床感染的鮑曼不動(dòng)桿菌，剔除同一患者相同菌株，共收集95株鮑曼不動(dòng)桿菌，從中選取32株多重耐藥菌株。標(biāo)本來源包括痰及咽拭子、血液、分泌物、引流液、尿液等。質(zhì)控菌株：大腸埃希菌ATCC25922、銅綠假單胞菌ATCC27853，購自衛(wèi)生部臨床檢驗(yàn)中心。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)菌鑒定與藥敏 采用法國梅里埃公司的VIKET Compact 2 全自動(dòng)細(xì)菌鑒定儀進(jìn)行細(xì)菌鑒定。藥敏紙片氨曲南、環(huán)丙沙星、左氧氟沙星、頭孢曲松、頭孢唑啉、頭孢吡肟、頭孢西丁、氨芐西林、哌拉西林、呋喃妥因、慶大霉素、阿莫西林/克拉維酸、妥布霉素、亞胺培南、頭孢哌酮/舒巴坦、多粘菌素B均購自英國OXOID 公司，藥敏試驗(yàn)采用紙片擴(kuò)散法(K-B法)。藥敏結(jié)果判斷按照美國臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化研究所(CLSI 2013年版)的標(biāo)準(zhǔn)[7]。

1.2.2 引物設(shè)計(jì) 耐藥基因引物由上海生工生物工程有限公司合成，見表1。

表1 基因引物序列及產(chǎn)物終長度

續(xù)表1

1.2.3 鮑曼不動(dòng)桿菌DNA模板的制備 將實(shí)驗(yàn)菌株接種血平板，37 ℃培養(yǎng)18～24 h，取適量純培養(yǎng)菌落至裝有200 μL無菌蒸餾水的0.5 mL EP 管中，震蕩混勻成均勻的菌懸液。 100 ℃恒溫金屬浴煮沸10 min,煮沸時(shí)防止管蓋爆開，取出冷卻，14 000 r/min離心10 min，取上清，采用德國 IMPLEN超微量分光光度計(jì)檢測提取的 DNA 模板的含量，調(diào)整為實(shí)驗(yàn)所需濃度(<500 ng/μL)。

1.2.4 耐藥基因檢測 采用聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)法檢測，反應(yīng)體系總體積為50 μL，其中10×PCR buffer 5 μL，25 mmol/L MgCl23 μL，dNTP 4 μL，上下游引物各1 μL，DNA模板2 μL，Taq酶0.3 μL，無菌水補(bǔ)充至50 μL。反應(yīng)參數(shù)：93 ℃預(yù)變性2 min，93 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 60 s，35個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸5 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物在2%瓊脂糖凝膠中，120 V電壓，電泳35 min，紫外凝膠成像儀觀察結(jié)果并拍照。

1.2.5 耐藥基因序列分析 PCR擴(kuò)增陽性產(chǎn)物經(jīng)上海生工生物工程有限公司測序，并與GenBank數(shù)據(jù)庫序列進(jìn)行比對(duì)。

2 結(jié)果與分析

2.1 鮑曼不動(dòng)桿菌藥敏試驗(yàn)結(jié)果

32株多重耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌對(duì)抗菌藥物耐藥情況嚴(yán)重，對(duì)青霉素類、頭孢菌素類、喹諾酮類、氨基糖苷類、單環(huán)酰胺類、硝基呋喃類均大于80%，對(duì)亞胺培南和美羅培南耐藥率高達(dá)78.1%和71.9%，頭孢哌酮/舒巴坦耐藥率31.3%，多粘菌素B抗菌活性最好，未出現(xiàn)耐藥菌株，耐藥率0%。見表2。

表2 多重耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌對(duì)抗菌藥物的藥敏試驗(yàn)結(jié)果(%)

2.2 多重耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌β-內(nèi)酰胺酶基因檢測結(jié)果

32株多重耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌TEM基因陽性32株，陽性率100%;PER基因陽性17株，陽性率53.1%;ADC基因陽性29株，陽性率90.6%,電泳結(jié)果見圖1～3。

圖1 TEM基因PCR產(chǎn)物電泳圖Fig.1 Electrophorogram of TEM gene amplified productsM: DNA markerⅠ；P：陽性對(duì)照；N：陰性對(duì)照；1～4：陽性樣本M: DNA markerⅠ; P: Positive control; N: Negative control; 1～4: Positive samples

圖2 PER基因PCR產(chǎn)物電泳圖Fig.2 Electrophorogram of PER gene amplified productsM: DNA marker Ⅱ；P：陽性對(duì)照；N：陰性對(duì)照；3、6、8：陽性樣本；9：陰性樣本M: DNA marker Ⅱ; P: Positive control; N: Negative control; 3,6,8: Positive samples; 9: Negative samples

圖3 ADC基因PCR產(chǎn)物電泳圖Fig.3 Electrophorogram of ADC gene amplified productsM: DNA markerⅠ；P：陽性對(duì)照；N：陰性對(duì)照；1、2、3、5、6、7：陽性樣本M: DNA markerⅠ; P: Positive control; N: Negative control; 1,2,3,5,6,7: Positive samples

2.3 多重耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌基因型在菌株中的分布

32株多重耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌β-內(nèi)酰胺酶基因型分布，以TEM+PER+ADC基因陽性組合最多，共16株，占50.0%；其次為TEM+ADC陽性13株，占40.1%；單TEM陽性2株，占6.3%；TEM+PER陽性1株，占3.1%，見表3。

表3 多重耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌各基因型的分布

2.4 藥敏結(jié)果與β-內(nèi)酰胺酶基因型分布比較

從鮑曼不動(dòng)桿菌藥敏結(jié)果與β-內(nèi)酰胺酶基因型可以看出，以耐藥基因TEM+PER+ADC陽性最常見，此16株菌對(duì)除頭孢哌酮/舒巴坦和多粘菌素B外其余所測藥物全部耐藥，較單TEM基因陽性、TEM+PER基因陽性和TEM+ADC基因陽性耐藥性更為嚴(yán)重。

3 討 論

本研究結(jié)果顯示，收集到的95株鮑曼不動(dòng)桿菌中多重耐藥菌株32株，占33.7%，可見MDR-AB分離率較高，應(yīng)引起臨床注意。MDR-AB對(duì)抗菌藥物的藥敏結(jié)果顯示：對(duì)常用的青霉素類、頭孢菌素類、氨基糖苷類、喹諾酮類耐藥率均大于80%，對(duì)亞胺培南和美羅培南的耐藥率分別高達(dá)78.1%和71.9%，可見對(duì)臨床常用抗菌藥物耐藥率較高，臨床可選用的抗生素有限，給治療造成了困難。對(duì)頭孢哌酮/舒巴坦的耐藥率較低為31.3%，可能與舒巴坦對(duì)鮑曼不動(dòng)桿菌具有獨(dú)特的殺菌作用有關(guān)[8]。值得注意的是頭孢哌酮/舒巴坦中介率達(dá)25.0%，提示臨床醫(yī)生應(yīng)更規(guī)范使用該藥，達(dá)到治療效果的同時(shí)控制耐藥菌株的產(chǎn)生。多粘菌素B抗菌活性最好，未出現(xiàn)耐藥菌株，臨床上對(duì)MDR-AB所致的感染可選用多粘菌素B。

β-內(nèi)酰胺酶可分為 A、B、C和D 四類：A 類為超廣譜β-內(nèi)酰胺酶(ESBLs)，B 類為金屬β-內(nèi)酰胺酶(MBLs)， C 類為頭孢菌素酶(AmpC)，D 類為苯唑西林酶(OXA)[9]。對(duì)安徽醫(yī)科大學(xué)解放軍174臨床學(xué)院MDR-AB進(jìn)行A、B、C類β-內(nèi)酰胺酶耐藥基因的檢測結(jié)果顯示：檢出ESBLs的TEM基因和PER基因、AmpC類的ADC基因，未檢出金屬β-內(nèi)酰胺酶基因。說明安徽醫(yī)科大學(xué)解放軍174臨床學(xué)院MDR-AB主要攜帶A、C類β-內(nèi)酰胺酶基因，不含有所檢測幾種的B類β-內(nèi)酰胺酶基因。

32株多重耐藥菌株全部攜帶TEM基因，檢出率100%，可見TEM型基因在MDR-AB中廣泛存在，與報(bào)道相同[10-11]。TEM基因是鮑曼不動(dòng)桿菌最常見的β-內(nèi)酰胺酶基因型，TEM型ESBLs能夠擴(kuò)大作用底物,使得細(xì)菌的耐藥譜擴(kuò)大，從而表現(xiàn)為多重耐藥現(xiàn)象。蔣曉飛等[12]早在2001年首次在鮑曼不動(dòng)桿菌中發(fā)現(xiàn)PER-1基因。在歐洲、美洲和亞洲爆發(fā)流行的鮑曼不動(dòng)桿菌菌株中普遍存在PER-1[13-14]。安徽醫(yī)科大學(xué)解放軍174臨床學(xué)院32株MDR-AB中有17株菌檢出PER基因陽性，陽性率53.1%。顯示MDR-AB中PER基因攜帶率較高，產(chǎn)PER型ESBLs鮑曼不動(dòng)桿菌可高水平耐青霉素和廣譜頭孢菌素,但對(duì)碳青霉烯類抗菌藥物仍敏感。

鮑曼不動(dòng)桿菌中AmpC 酶基因主要為ADC基因，DHA基因近年在世界各地也有報(bào)道。本研究顯示安徽醫(yī)科大學(xué)解放軍174臨床學(xué)院MDR-AB攜帶ADC基因，陽性率90.6%。ADC型AmpC酶為不動(dòng)桿屬菌所特有，由染色體介導(dǎo)，因此被命名為 ADC(Acinetobacter-derived cephalosporiases)[15]。AmpC酶能水解包括青霉素、1-3代頭孢菌素、單環(huán)酰胺類及頭霉素類在內(nèi)的多種β-內(nèi)酰胺類抗生素，但第4代頭孢菌素和碳青霉烯類敏感。由于AmpC酶能優(yōu)先水解頭孢菌素，因此又稱為頭孢菌素酶，以第3代頭孢菌素水解作用最強(qiáng)，是鮑曼不動(dòng)桿菌對(duì)第3代頭孢菌素耐藥的主要原因。藥敏結(jié)果顯示32株MDR-AB對(duì)頭孢曲松耐藥率為100%，與ADC基因的高攜帶率有關(guān)。

耐藥基因的分布與藥敏結(jié)果比較發(fā)現(xiàn)，以TEM+PER+ADC基因陽性組合最多，共16株，占50.0%。研究發(fā)現(xiàn)此16株菌對(duì)除頭孢哌酮/舒巴坦和多粘菌素B外其余所測藥物全部耐藥，表明3種基因同時(shí)陽性較兩種基因和單基因陽性的菌株耐藥譜更廣、耐藥情況更嚴(yán)重。 可見同一菌株攜帶多種耐藥基因可能是安徽醫(yī)科大學(xué)解放軍174臨床學(xué)院鮑曼不動(dòng)桿菌對(duì)β-內(nèi)酰胺類抗菌藥物表現(xiàn)為多重耐藥性的原因之一。

綜上所述，安徽醫(yī)科大學(xué)解放軍174臨床學(xué)院鮑曼不動(dòng)桿菌多重耐藥性與β-內(nèi)酰胺酶耐藥基因TEM、PER、ADC有關(guān)。關(guān)于耐藥基因與抗菌藥物耐藥性的關(guān)系還需進(jìn)一步深入研究。因此，加強(qiáng)鮑曼不動(dòng)桿菌對(duì)β-內(nèi)酰胺類抗菌藥物耐藥機(jī)制的研究，合理應(yīng)用抗菌藥物，對(duì)有效控制細(xì)菌感染及耐藥菌株出現(xiàn)具有重要意義。

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Resistance and Resistant Genes of β-Lactamase in Multiple Drug Resistant Acinetobacter baumannii

YANG Yan, WANG Hou-zhao, ZHANG Ling

(PLA174Clin.Coll.ofAnhuiMed.Uni.,Xiamen361003)

The carrying situation of the resistance and the resistant genes of β-lactamases in multiple drug resistantAcinetobacterbaumannii(MDR-AB) was studied. The bacterial identification were performed by VITEK 2 compact full-automatic bacterial identification system. Paper diskette diffusion method (K-B method) was used to detect the drug resistance ofA.baumanniito antibiotic drugs. The β-lactamase resistance genes were amplified by PCR. The results showed that drug resistance rates of 32 stains of MDR-AB to 13 kinds of commonly used antibiotic drugs were all over 80%. The resistance rates of MDR-AB to imipenem and meropenem were as high as 78.1% and 71.9%, respectively, to cefoperazone/sulbactam was 31.3%. Polymyxin B performed the best antibiotic activity, resistance rates was 0%. The resistance genes of extrabroad-spectrum β-lactamases (ESBLs) and cephalosporinase (AmpC) were detected, but non metal β-lactamase (MBLs) resistance genes was detected. Of 32 strains of MDR-AB, TEM genes were positive in all strains, 17 strains detected PER gene, 29 strains detected ADC genes. 16 strains simultaneously carry TEM, PER, ADC genes. In conclusion, simultaneously carrying TEM, PER, ADC genes may have been one reason that causedA.baumanniimulti-drug resistance.

Acinetobacterbaumannii; multiple drug resistance; β-lactamase; resistance genes

廈門市科技創(chuàng)新項(xiàng)目 (3502Z20134024)； 福建省科技計(jì)劃項(xiàng)目(2013D006)；全軍醫(yī)學(xué)科技青年培育項(xiàng)目(13QNP047)

楊艷 女,主管檢驗(yàn)師，碩士研究生。 主要從事臨床免疫學(xué)和微生物學(xué)檢驗(yàn)。E-mail:yangyan_1878@126.com

* 通訊作者。男，副主任技師，碩士，檢驗(yàn)科主任。主要從事檢驗(yàn)科管理工作。E-mail:wanghouzhao@126.com

2015-04-08；

2015-06-15

Q939.93; R37

A

1005-7021(2015)04-0054-05

10.3969/j.issn.1005-7021.2015.04.010