• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    以agr基因?yàn)榘悬c(diǎn)快速檢測(cè)金黃色葡萄球菌方法的建立

    2015-12-27 00:52:50廖穎玲金曉璐權(quán)春善金黎明胡文忠
    微生物學(xué)雜志 2015年4期
    關(guān)鍵詞:甜菜堿金黃色葡萄球菌

    廖穎玲, 耿 寧, 金曉璐, 權(quán)春善,2*, 金黎明,2, 胡文忠,2

    (1. 大連民族大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院,遼寧 大連 116600; 2. 生物技術(shù)與資源利用國(guó)家民委-教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,遼寧 大連 116600)

    ?

    以agr基因?yàn)榘悬c(diǎn)快速檢測(cè)金黃色葡萄球菌方法的建立

    廖穎玲1, 耿 寧1, 金曉璐1, 權(quán)春善1,2*, 金黎明1,2, 胡文忠1,2

    (1. 大連民族大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院,遼寧 大連 116600; 2. 生物技術(shù)與資源利用國(guó)家民委-教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,遼寧 大連 116600)

    本文旨在建立一種以agr基因?yàn)榘悬c(diǎn),快速檢測(cè)金黃色葡萄球菌的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(LAMP)方法。針對(duì)金黃色葡萄球菌附屬基因調(diào)控基因agr序列,設(shè)計(jì)了4條特異性引物;優(yōu)化了LAMP體系中甜菜堿、dNTP濃度、長(zhǎng)短引物比等因素;通過(guò)對(duì)14株不同金黃色葡萄球菌菌株和4株其他常見(jiàn)食品致病菌株進(jìn)行檢測(cè),評(píng)估引物特異性。結(jié)果表明,在Mg2+濃度為2.4 mmol/L,dNTP濃度為0.8 mmol/L,甜菜堿濃度為0.1 mol/L,長(zhǎng)短引物比為1∶8,65 ℃反應(yīng)50 min條件下擴(kuò)增可達(dá)最佳效果。優(yōu)化后的LAMP對(duì)14株金黃色葡萄球菌均表現(xiàn)為陽(yáng)性,對(duì)4株非金黃色葡萄球菌菌株表現(xiàn)為陰性,證明引物具有特異性。本文首次利用agr基因作為靶基因片段,建立了一個(gè)簡(jiǎn)單、快速、特異性強(qiáng)的檢測(cè)金黃色葡萄球菌的方法,在食品安全檢測(cè)方面極具意義。

    金黃色葡萄球菌;agr;環(huán)介導(dǎo)恒溫?cái)U(kuò)增;快速檢測(cè)

    金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus,SA),是目前細(xì)菌性食物中毒和人類化膿性感染中最常見(jiàn)的病原體之一[1],在自然界中分布極為廣泛。據(jù)美國(guó)疾病控制中心報(bào)告,近年來(lái)由金黃色葡萄球菌引起的感染占細(xì)菌感染的第二位,僅次于大腸埃希菌。金黃色葡萄球菌對(duì)人類的危害極大,能夠引起多種人體局部和全身感染,并且是一個(gè)非常重要的社區(qū)獲得性和醫(yī)院獲得性病原菌[2]。由此可見(jiàn),金黃色葡萄球菌污染已成為一個(gè)世界性的衛(wèi)生問(wèn)題,威脅著人類的健康和生命,迫切需要建立一種快速檢測(cè)金黃色葡萄球菌的方法并及時(shí)預(yù)防處理。金黃色葡萄球菌的微生物病原特性非常復(fù)雜并且與大量的毒力因子有關(guān),而這些毒力因子的表達(dá)受一個(gè)由許多基因位點(diǎn)組成的復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)所調(diào)控[3]。在這些基因中附屬基因調(diào)節(jié)(accessory gene regulator,agr)系統(tǒng)在毒力基因的表達(dá)與調(diào)控中起決定作用,它也是唯一一個(gè)已知的通過(guò)群體感應(yīng)機(jī)制調(diào)控的調(diào)節(jié)系統(tǒng)[4-5]。目前金黃色葡萄球菌快速檢測(cè)方法包括傳統(tǒng)的細(xì)菌分離鑒定、免疫檢測(cè)[6]、PCR方法[7-9]、基因芯片(gene chip)等。細(xì)菌分離鑒定法操作繁瑣、耗時(shí)長(zhǎng);免疫學(xué)方法如乳膠微粒凝集試驗(yàn)、ELISA等,可以縮短檢測(cè)時(shí)間,但可能受到食物成分及葡萄球菌A蛋白的干擾[10];而基因芯片方法其生化反應(yīng)條件和過(guò)程不可控,反應(yīng)效率較低,檢測(cè)結(jié)果重復(fù)性較差。本文選用Notomi 等[11]報(bào)道的依賴于能夠識(shí)別靶序列上 6 個(gè)特異區(qū)域的 4 條引物和一種具有鏈置換特性的DNA 聚合酶的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP) 技術(shù),在等溫條件下高效、快速、高特異地?cái)U(kuò)增agr靶序列,達(dá)到快速檢測(cè)食物中金黃色葡萄球菌的目的。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    1.1.1 菌株 金黃色葡萄球菌(ATCC 6538)、大腸埃希菌(CMCC 44102)、副溶血弧菌(CGMCC 1.1616)、鼠傷寒沙門(mén)氏菌(CMCC 50115)、單增李斯特菌(GIM 1.229)均購(gòu)自中國(guó)微生物菌種網(wǎng);14株金黃色葡萄球菌由大連民族大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院崔京春教授惠贈(zèng)。

    1.1.2 試劑 蛋白胨、胰蛋白胨、酵母浸粉、NaCl購(gòu)自北京奧博星生物技術(shù)有限公司;乙二胺四乙酸(EDTA)購(gòu)自北京夏新生物技術(shù)有限公司;Bst DNA聚合酶、DL5000 Marker、MgCl2、甜菜堿、dNTP Mixture、6×Loading Buffer 購(gòu)自大連寶生物公司;引物委托上海博亞生物技術(shù)有限公司合成。

    1.1.3 儀器與設(shè)備 ABI 9700型PCR擴(kuò)增儀(美國(guó)ABI公司),DYCP-31DN型電泳儀(北京六一儀器廠),GelDoc-It型凝膠成像儀(美國(guó)UVP公司),SW-OJ-2FD型潔凈工作臺(tái)(蘇州安泰安氣技術(shù)有限公司),H1850R型離心機(jī)(湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開(kāi)發(fā)有限公司),Eppendorf移液槍(德國(guó)Eppendorf公司),海爾微波爐(青島海爾微波制品有限公司),MT-180B生化恒溫培養(yǎng)箱(上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司)。

    1.2 方法

    1.2.1 提取模板DNA 分別挑取金黃色葡萄球菌和其他待檢菌株于LB固體培養(yǎng)基平板上劃線接種,37 ℃恒溫培養(yǎng)過(guò)夜。按史偉峰等[12]提取DNA的方法稍作修改。挑取培養(yǎng)好的單菌落置于裝有50 μL無(wú)菌水的PCR小管中,95 ℃反應(yīng)5 min后取出,13 000 r/min 離心2 min 待用。

    1.2.2 引物設(shè)計(jì) 根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中agr基因序列,采用引物設(shè)計(jì)軟件Primer Explorer 3.0進(jìn)行設(shè)計(jì),得到一套特異性的LAMP引物,包括外引物F3、B3和內(nèi)引物FIP、BIP,引物序列見(jiàn)表1。

    表1 LAMP 引物

    1.2.3 PCR反應(yīng)條件 利用B3、F3、BIP、FIP引物擴(kuò)增靶基因,反應(yīng)體系為 25.0 μL,包含外引物(F3和B3)各 1.6 μmol/L,內(nèi)引物(FIP和BIP)各0.2 μmol/L,dNTP 0.5 mmol/L,Bst DNA polymerase 1.0 μL(8 U),甜菜堿 0.032 mmol/L,模板 2.0 μL,MgCl22 mmol/L,ddH2O補(bǔ)足體積至 25.0 μL。擴(kuò)增反應(yīng)條件:95 ℃反應(yīng)5 min,冷卻,取出加入 Bst DNA聚合酶,繼續(xù)反應(yīng)。反應(yīng)參數(shù)為 65 ℃ 擴(kuò)增50 min, 80 ℃ 10 min使酶滅活。

    1.2.4 擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳檢測(cè) 將獲得的產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè),取 10 μL擴(kuò)增產(chǎn)物與2 μL 6×Loading Buffer 混勻后,加樣到 1.5%瓊脂糖凝膠中,110 V電泳 30 min,于凝膠成像系統(tǒng)中觀察,記錄結(jié)果。

    1.2.5 特異性分析 利用外引物F3、B3和內(nèi)引物FIP、BIP,按照上述LAMP方法,對(duì)大腸埃希菌、副溶血弧菌、沙門(mén)氏菌、單增李斯特菌、14 株金黃色葡萄球菌進(jìn)行檢測(cè),擴(kuò)增得到的產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

    1.2.6 反應(yīng)條件的優(yōu)化 為增加LAMP方法檢測(cè)的準(zhǔn)確性,利用單一變量的方法分別對(duì)反應(yīng)溫度(67~61 ℃),反應(yīng)時(shí)間(20~60 min),MgCl2濃度(0.8~4.0 mmol/L),dNTP濃度(0.3~1.0 mmol/L),甜菜堿濃度(0.1~0.4 mol/L)和內(nèi)、外引物濃度比等擴(kuò)增條件進(jìn)行優(yōu)化。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 LAMP反應(yīng)條件的優(yōu)化

    為提高LAMP方法的檢測(cè)效果,分別對(duì)其反應(yīng)溫度、反應(yīng)時(shí)間、MgCl2濃度、dNTP濃度、甜菜堿濃度和引物比例等擴(kuò)增條件進(jìn)行了優(yōu)化。

    2.1.1 LAMP反應(yīng)溫度的優(yōu)化 設(shè)置反應(yīng)溫度分別為67、65、63、61 ℃,擴(kuò)增50 min,使用1.5%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測(cè),結(jié)果見(jiàn)圖1。由圖1可知,當(dāng)反應(yīng)溫度為65 ℃時(shí)擴(kuò)增條帶最清晰。故確定65 ℃為L(zhǎng)AMP最適反應(yīng)溫度。

    2.1.2 LAMP反應(yīng)時(shí)間的優(yōu)化 設(shè)置反應(yīng)時(shí)間分別為 20、30、40、50、60 min,擴(kuò)增50 min,使用1.5%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測(cè)實(shí)驗(yàn),結(jié)果見(jiàn)圖2。由圖2可知,反應(yīng)40 min后開(kāi)始出現(xiàn)擴(kuò)增條帶,但條帶不清楚,反應(yīng)50 min后擴(kuò)增條帶逐漸變亮、變清晰。故確定50 min作為L(zhǎng)AMP最適反應(yīng)時(shí)間。

    圖1 反應(yīng)溫度的優(yōu)化Fig.1 The optimization of the reaction temperatureM:DNA marker 5 000 bp ;1~4:反應(yīng)溫度分別為67、65、63、61 ℃;5為陰性對(duì)照M:DNA marker 5 000 bp; 1:67 ℃; 2:65 ℃; 3:63 ℃; 4:61 ℃; 5:negative control

    圖2 反應(yīng)時(shí)間的優(yōu)化Fig.2 Optimization of the reaction timeM:DNA marker 5 000 bp;1~5:反應(yīng)時(shí)間分別為 20、30、40、50、60 minM:DNA marker 5 000 bp; 1:20 min; 2:30 min; 3:40 min; 4:50 min; 5:60 min

    2.1.3 LAMP反應(yīng)體系中MgCl2濃度的優(yōu)化結(jié)果 調(diào)整反應(yīng)體系中MgCl2濃度分別為0.8、1.6、2.0、2.4、3.2、4.0 mmol/L,擴(kuò)增50 min,使用1.5%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測(cè)實(shí)驗(yàn),結(jié)果見(jiàn)圖3。由圖3可知,擴(kuò)增條帶的亮度隨MgCl2濃度增加而變亮,當(dāng)MgCl2濃度達(dá)到2.4 mmol/L時(shí)最清晰,但不再隨MgCl2濃度增加而改變。故確定LAMP反應(yīng)體系中MgCl2最適濃度為2.4 mmol/L。

    2.1.4 LAMP反應(yīng)體系中dNTP濃度的優(yōu)化 設(shè)dNTP濃度分別為0.3、0.5、0.8、1.0 mmol/L,擴(kuò)增50 min,使用1.5%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測(cè)實(shí)驗(yàn),結(jié)果見(jiàn)圖4。由圖4可知,擴(kuò)增條帶的亮度隨dNTP濃度增加而逐漸增大,當(dāng)dNTP濃度達(dá)到0.8 mmol/L時(shí)最清晰。故確定LAMP反應(yīng)體系中dNTP最適濃度為0.8 mmol/L。

    圖3 MgCl2濃度的優(yōu)化Fig.3 The optimal concentration of MgCl2M:DNA marker 5 000 bp;1~6:MgCl2濃度分別為0.8、1.6、2.0、2.4、3.2、4.0 mmol/LM:DNA marker 5 000 bp; 1:0.8 mmol/L; 2:1.6 mmol/L; 3:2.0 mmol/L; 4:2.4 mmol/L; 5:3.2 mmol/L; 6:4.0 mmol/L

    圖4 dNTP 濃度的優(yōu)化Fig.4 The optimal concentration of dNTPM:DNA marker 5 000 bp;1~4:dNTP濃度分別為0.3、0.5、0.8、1.0 mmol/L M:marker 5 000 bp; 1:0.3 mmol/L; 2:0.5 mmol/L; 3:0.8 mmol/L; 4:1.0 mmol/L

    2.1.5 LAMP反應(yīng)體系中甜菜堿濃度的優(yōu)化 將甜菜堿濃度分別調(diào)整到0.1、0.2、0.3、0.4 mol/L,擴(kuò)增50 min,使用1.5%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測(cè),結(jié)果見(jiàn)圖5。由圖5可知,擴(kuò)增條帶的亮度隨甜菜堿濃度增加而減弱,甜菜堿濃度在 0.1 mol/L時(shí)條帶最清晰。故確定LAMP反應(yīng)體系中甜菜堿最適濃度為0.1 mol/L。

    2.1.6 LAMP反應(yīng)體系中外引物和內(nèi)引物濃度比的優(yōu)化 調(diào)整外、內(nèi)引物濃度比分別為1∶4(即外引物各0.4 μmol/L,內(nèi)引物各1.6 μmol/L)和1∶8(即外引物各0.2 μmol/L,內(nèi)引物各1.6 μmol/L),擴(kuò)增50 min,使用1.5%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測(cè),結(jié)果見(jiàn)圖6。由圖6可知,擴(kuò)增條帶在引物濃度比為1∶8時(shí)條帶最清晰,故確定LAMP反應(yīng)體系中外、內(nèi)引物最適濃度比為1∶8。

    圖5 甜菜堿濃度的優(yōu)化Fig.5 The optimal concentration of BetaineM:DNA marker 5 000 bp ;1~4:甜菜堿濃度分別為0.1、0.2、0.3、0.4 mol/LM:DNA marker 5 000 bp; 1:0.1 mol/L; 2:0.2 mol/L; 3:0.3 mol/L; 4:0.4 mol/L

    圖6 引物濃度比的優(yōu)化Fig.6 The optimal concentration of primersM:DNA marker 5 000 bp; 1:引物濃度比為1∶4;2:引物濃度比為1∶8 M:DNA marker 5 000 bp; 1:the concentration ratio between inner primer and outer primer is 1∶4; 2:the concentration ratio between inner primer and outer primer is 1∶8

    2.2 引物的特異性

    圖7 金黃色葡萄球菌的特異性檢測(cè)結(jié)果Fig.7 The result of primers specificity

    M:DNA marker 2 000 bp ;1~14:不同的金黃色葡萄球菌;

    15:陰性對(duì)照;16:陽(yáng)性對(duì)照;17~20:副溶血弧菌、大腸埃希菌、單增李斯特菌、沙門(mén)氏菌

    M:DNA marker 2 000 bp; 1~14:differentS.aureusstrain; 15:negative control; 16:positive control; 17:Vibrioparahaemolyticus; 18:Escherichiacoli; 19:Listeriamonocytogenes; 20:Salmonellarange

    用優(yōu)化后的LAMP體系分別對(duì)18株實(shí)驗(yàn)菌株進(jìn)行擴(kuò)增,特異性檢測(cè)結(jié)果如圖7所示,14株金黃色葡萄球菌均得到陽(yáng)性結(jié)果,其他4株非金黃色葡萄球菌表現(xiàn)為陰性。

    3 討 論

    隨著科技的發(fā)展及生活水平的提高,人們?cè)絹?lái)越關(guān)心自身的健康問(wèn)題,對(duì)于食品安全的關(guān)注也更為迫切。目前,用于金黃色葡萄球菌檢測(cè)的靶基因主要從特異性基因位點(diǎn)、抗藥性基因和毒素基因三個(gè)方面入手[13]。包括耐藥性相關(guān)基因mecA和femA,毒素相關(guān)基因SEA、SEB、SEC、SED、SEI和SEJ等,特異性鑒別基因nuc、clfA、scpA、sspB和SmaI酶切片段等[14]。本研究通過(guò)對(duì)不同食品中金黃色葡萄球菌特有的分子特征和生理生化特性進(jìn)行比較分析,選擇了agr作為檢測(cè)金黃色葡萄球菌的特異靶基因。在病原菌中存在復(fù)雜的調(diào)節(jié)致病因子分泌的機(jī)制,agr和sarA是金黃色葡萄球菌中研究最多的毒力響應(yīng)調(diào)節(jié)因子,其中起中心作用的是agr群體感應(yīng)系統(tǒng),近年來(lái)成為細(xì)菌毒素分泌調(diào)節(jié)研究及新型抗菌藥物研發(fā)的熱點(diǎn)[15]。由于agr具有較好的特異性,因此利用agr作為一個(gè)新的藥物靶點(diǎn)來(lái)進(jìn)行研究,具有良好的應(yīng)用前景。

    設(shè)計(jì)引物時(shí),將agr的基因序列在GenBank上同源對(duì)比,對(duì)獲得的同源序列進(jìn)行分析,發(fā)現(xiàn)目標(biāo)片段的DNA序列與數(shù)據(jù)庫(kù)的SA具有100%同源性,而與其他葡萄球菌和非葡萄球菌沒(méi)有同源性或同源性很低。同時(shí),對(duì)設(shè)計(jì)出來(lái)的4種引物進(jìn)行特異性檢測(cè),發(fā)現(xiàn)其具有良好的特異性,并且能明確地?cái)U(kuò)增靶基因,達(dá)到預(yù)期的結(jié)果。最后,評(píng)估LAMP檢測(cè)方法的特異性并對(duì)其反應(yīng)條件進(jìn)行細(xì)致的優(yōu)化,包括反應(yīng)溫度、反應(yīng)時(shí)間、MgCl2濃度、dNTP濃度、甜菜堿濃度和長(zhǎng)短引物濃度比等擴(kuò)增條件。

    本研究建立了一種新的LAMP檢測(cè)方法,該方法將對(duì)金黃色葡萄球菌的臨床診斷和食品安全監(jiān)測(cè)發(fā)揮重要作用。

    [1] Tirado C, Schimdt K. WHO surveillance programme for control of food-borne infections and intoxications: preliminary results and trends across greater Europe [J]. Infect, 2001, 43: 80-84.

    [2] Turabelidze G, Lin M, Wolkoff B, et al. Personal hygiene and methicillin-resistantStaphylococcusaureusinfection[J]. Emerg Infect Dis, 2006, 12: 422-427.

    [3] Pragman AA, Schlievert PM. Virulence regulation inStaphylococcusaureus: the need for in vivo analysis of virulence factor regulation [J]. FEMS Immunol Med Microbiol, 2006, 42(2):147-154.

    [4] 王軍華, 權(quán)春善, 鄭維, 等. 金黃色葡萄球菌附屬基因調(diào)節(jié)系統(tǒng)[J]. 中國(guó)生物工程雜志, 2008, 28(6): 93-99.

    [5] 權(quán)春善, 范圣第. 新型藥物靶點(diǎn) agr 群體感應(yīng)系統(tǒng)的研究進(jìn)展及其應(yīng)用[J]. 微生物學(xué)雜志, 2008, 28(4): 74-77.

    [6] Yazdankhah SP, Solverod L, Simonsen S, et al. Developmentand evaluation of an immunomagnetic separation-ELISA for the detection ofStaphylococcusaureusthermostable nuclease incomposite milk[J]. Vet Microbiol, 1999, 67(2): 113-125.

    [7] Wilson IG, Cooper JE, Gilmour A. Detection of enterotoxigenicStaphylococcusaureusin dried skimmed milk: use of the polymerase chain reaction for amplification and detection of staphylococcal enterotoxin genesentB andentC1 and the thermonuclease gene nuc[J]. Appl Environ Microbiol, 1991, 57(6): 1793-1798.

    [8] Straub JA, Hertel C, Hammes WP. A 23S rDNA-targeted polymerase chain reaction-based system for detection ofStaphylococcusaureusin meat starter cultures and dairy products[J]. J Food Prot, 1999, 62(10): 1150-1156.

    [9] 田靜, 計(jì)融, 楊軍, 等. PCR 方法快速檢測(cè)食品中的金黃色葡萄球菌[J]. 衛(wèi)生研究, 2007, 2:183-186.

    [10]唐夢(mèng)君, 周生, 葛慶聯(lián), 等. 應(yīng)用LAMP快速檢測(cè)金黃色葡萄球菌的研究[J]. 現(xiàn)代食品科技,2011, 27(6): 719-722.

    [11]Notomi T, Okayama H, Masubuchi H, et al.Loop-mediated isothermal amplification of DNA[J]. Nucleic Acids Res, 2000, 28(12):63.

    [12]史偉峰, 史梅, 羅光華, 等. 環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)快速檢測(cè)金黃色葡萄球菌[J]. 臨床檢驗(yàn)雜志,2011, 29(5): 339-341.

    [13]范一靈, 潘峰, 史賢明. 金黃色葡萄球菌分子檢測(cè)技術(shù)的常用靶基因[J]. 微生物學(xué)雜志,2008, 28(3): 72-76.

    [14]姜延龍, 張宇, 田波, 等. PCR 技術(shù)檢測(cè)金黃色葡萄球菌進(jìn)展[J]. 食品科學(xué), 2006, 27(5): 265-269.

    [15]ChanWC, Coyle B, Williams P. Regulation of virulence determinants inStraphylococcusaureus: complexity and applications [J]. FEMS Microbiol Rev,2004, 28(2):183-200.

    The Establishment of a Rapid agr Gene-Targeting Detection Method for Staphylococcus aureus

    LIAO Ying-ling1, GENG Ning1, JIN Xiao-lu1, QUAN Chun-shan1,2, JIN Li-ming1,2, HU Wen-zhong1,2

    (1.Coll.ofLifeSci.,DalianNationalitiesUni.,Dalian116600; 2.KeyLab.ofBiotech. &Bio-Res.Util.,TheStateEthnicAffairsComm. &Minist.ofEdu.,Dalian116600)

    This paper aims to establish a method of a loop-mediated isothermal amplification assay (LAMP) for the rapid detection ofStaphylococcusaureus. Firstly, a highly specific set of four primers was designed according to the accessory gene regulator ofS.aureus. Secondly, the concentration of betaine, dNTP and the ratio of long and short primer ratio, and other factors in the LAMP system were optimized. Finally, the specificity of primers was tested and evaluated against 14S.aureusstrains and 4 other pathogenic strains. The results showed that the effect of the amplification reached to an optimal effects under 65 ℃ react for 50 min, concentration of Mg2+at 2.4 mmol/L, concentration of dNTP at 0.8 mmol/L, and betaine at 0.1 mol/L, and the ratio of long and short primer at 1∶8. After the optimization the LAMP assay forS.aureuswas positive, while negative for non-S.aureusstrains, thus proved that the primers had the specificity. A simple, rapid and strong specific assay for detectingS.aureushas been established usingagrgene as the target gene for the first time. It possessed significance in food security detection.

    Staphylococcusaureus;agr; loop-mediated isothermal amplification; rapid detection

    科技部十二五國(guó)家科技支撐計(jì)劃(2012BAD38B05);中央高?;究蒲谢?DC12010118)

    廖穎玲 女,本科。研究方向?yàn)樯锕こ獭el:0411-87656219, E-mail:yingling2014@139.com

    * 通訊作者。女,教授,博士。研究方向?yàn)樯锕こ?、微生物學(xué)。Tel:0411-87656219,E-mail:mikyeken@dlnu.edu.cn

    2014-10-12;

    2014-11-18

    Q789; R378.2+1

    A

    1005-7021(2015)04-0019-05

    10.3969/j.issn.1005-7021.2015.04.004

    猜你喜歡
    甜菜堿金黃色葡萄球菌
    一起金黃色葡萄球菌食物中毒的病原學(xué)分析
    如何防治兔葡萄球菌病
    那一抹金黃色
    那一抹金黃色
    金黃色
    肉雞葡萄球菌病診療
    磺基甜菜堿的研究進(jìn)展及在洗護(hù)用品中的應(yīng)用
    一例水牛疥螨繼發(fā)感染葡萄球菌病的診治
    La(Ⅲ)、Nd(Ⅲ)與甜菜堿類衍生物形成的包含(H2O)6分子簇的配合物的晶體結(jié)構(gòu)
    雞葡萄球菌病的綜合防治措施
    18禁在线无遮挡免费观看视频| 国产精品麻豆人妻色哟哟久久| 欧美日韩亚洲高清精品| 亚洲欧美清纯卡通| 国产精品成人在线| 国产精品.久久久| 精品人妻熟女毛片av久久网站| 久久精品国产鲁丝片午夜精品| 侵犯人妻中文字幕一二三四区| av片东京热男人的天堂| 大话2 男鬼变身卡| 欧美人与善性xxx| 在线观看一区二区三区激情| 青春草国产在线视频| 大片免费播放器 马上看| www.熟女人妻精品国产 | 综合色丁香网| 大香蕉97超碰在线| 久久国产精品男人的天堂亚洲 | 视频中文字幕在线观看| 欧美精品亚洲一区二区| tube8黄色片| 大香蕉久久网| 视频在线观看一区二区三区| 少妇被粗大猛烈的视频| 免费久久久久久久精品成人欧美视频 | 免费人成在线观看视频色| 久久久久精品人妻al黑| 九九在线视频观看精品| 国产 一区精品| 亚洲内射少妇av| 欧美性感艳星| 亚洲婷婷狠狠爱综合网| 自线自在国产av| 夜夜爽夜夜爽视频| 亚洲久久久国产精品| 亚洲欧美一区二区三区黑人 | 国产成人午夜福利电影在线观看| 国产av精品麻豆| 国产一区二区三区av在线| 日韩制服骚丝袜av| √禁漫天堂资源中文www| 18禁在线无遮挡免费观看视频| 国产精品一区www在线观看| 青春草国产在线视频| 国产成人欧美| 久久亚洲国产成人精品v| 国产成人精品福利久久| 中文字幕另类日韩欧美亚洲嫩草| 日本av免费视频播放| 国产麻豆69| 少妇的丰满在线观看| 国产亚洲午夜精品一区二区久久| 国产av国产精品国产| 婷婷色综合www| 免费黄色在线免费观看| 少妇的逼水好多| 女人久久www免费人成看片| 亚洲欧美精品自产自拍| 啦啦啦在线观看免费高清www| 国产高清国产精品国产三级| 99久国产av精品国产电影| 丝袜在线中文字幕| 男女无遮挡免费网站观看| 欧美人与善性xxx| 午夜福利在线观看免费完整高清在| 午夜日本视频在线| 成人国产av品久久久| 欧美日韩亚洲高清精品| 伦精品一区二区三区| 国产av码专区亚洲av| 国产成人91sexporn| 人人妻人人添人人爽欧美一区卜| 国产精品一二三区在线看| 国产又色又爽无遮挡免| 日韩av在线免费看完整版不卡| 亚洲综合色惰| 日本爱情动作片www.在线观看| 蜜桃国产av成人99| 免费看光身美女| 永久免费av网站大全| 亚洲av福利一区| 美女福利国产在线| 久久久久久久国产电影| 免费看光身美女| 久久99一区二区三区| 婷婷色综合大香蕉| 久久97久久精品| 香蕉精品网在线| 少妇被粗大的猛进出69影院 | 亚洲国产欧美在线一区| 欧美国产精品va在线观看不卡| 国产深夜福利视频在线观看| 在线观看一区二区三区激情| 日本与韩国留学比较| 国产av码专区亚洲av| 国产熟女欧美一区二区| 少妇的逼水好多| 亚洲av在线观看美女高潮| 免费黄色在线免费观看| 国产精品99久久99久久久不卡 | 精品卡一卡二卡四卡免费| 夫妻午夜视频| www.熟女人妻精品国产 | 久久久久久人妻| 成人毛片60女人毛片免费| 亚洲伊人久久精品综合| 亚洲国产精品成人久久小说| 80岁老熟妇乱子伦牲交| 日韩一本色道免费dvd| 亚洲综合色惰| 精品国产乱码久久久久久小说| 美女视频免费永久观看网站| 人妻系列 视频| 亚洲国产最新在线播放| 9色porny在线观看| 亚洲精品色激情综合| 日韩大片免费观看网站| 日本vs欧美在线观看视频| 一区在线观看完整版| 如日韩欧美国产精品一区二区三区| 日韩av在线免费看完整版不卡| 亚洲欧美一区二区三区黑人 | 国产成人aa在线观看| 国产精品久久久av美女十八| 22中文网久久字幕| 欧美国产精品一级二级三级| 九色亚洲精品在线播放| 欧美日本中文国产一区发布| 精品国产一区二区久久| 欧美精品国产亚洲| 大香蕉97超碰在线| 久久这里有精品视频免费| 免费女性裸体啪啪无遮挡网站| 各种免费的搞黄视频| 大片免费播放器 马上看| 18禁观看日本| 欧美变态另类bdsm刘玥| 日本av免费视频播放| 丰满迷人的少妇在线观看| 亚洲欧美一区二区三区国产| 欧美日本中文国产一区发布| 日韩中字成人| 综合色丁香网| 最近2019中文字幕mv第一页| av视频免费观看在线观看| 免费观看在线日韩| 亚洲av成人精品一二三区| 久久午夜福利片| 国产精品蜜桃在线观看| 免费高清在线观看日韩| 国产精品免费大片| 国产精品99久久99久久久不卡 | 午夜91福利影院| 欧美 日韩 精品 国产| 日本黄色日本黄色录像| 又大又黄又爽视频免费| 一本久久精品| 午夜福利乱码中文字幕| 男女边摸边吃奶| 国产成人精品婷婷| 蜜桃国产av成人99| 免费看光身美女| freevideosex欧美| 一级毛片电影观看| 建设人人有责人人尽责人人享有的| 国产av一区二区精品久久| 捣出白浆h1v1| 菩萨蛮人人尽说江南好唐韦庄| 人人妻人人添人人爽欧美一区卜| 久久久久久人人人人人| 插逼视频在线观看| 午夜激情久久久久久久| 久久韩国三级中文字幕| 国产亚洲精品第一综合不卡 | 中文字幕av电影在线播放| 建设人人有责人人尽责人人享有的| 国产xxxxx性猛交| 久久精品aⅴ一区二区三区四区 | 亚洲经典国产精华液单| 亚洲国产日韩一区二区| 欧美日韩综合久久久久久| 大香蕉久久成人网| 在线观看免费日韩欧美大片| 日本vs欧美在线观看视频| 日本av手机在线免费观看| av不卡在线播放| 女的被弄到高潮叫床怎么办| 国产欧美日韩一区二区三区在线| 亚洲久久久国产精品| 精品国产一区二区三区久久久樱花| 日本与韩国留学比较| 两性夫妻黄色片 | 亚洲av电影在线进入| 免费高清在线观看日韩| 国产极品天堂在线| 亚洲伊人久久精品综合| 国产精品偷伦视频观看了| 在线看a的网站| 人妻一区二区av| 新久久久久国产一级毛片| 超碰97精品在线观看| 亚洲精品第二区| 午夜老司机福利剧场| 一级毛片电影观看| 久久人人爽人人爽人人片va| 亚洲成国产人片在线观看| 波多野结衣一区麻豆| 国产精品偷伦视频观看了| 1024视频免费在线观看| 熟女电影av网| 国产免费现黄频在线看| 一本久久精品| 美女福利国产在线| 国产精品国产三级国产专区5o| 欧美3d第一页| 欧美 日韩 精品 国产| 亚洲av在线观看美女高潮| 亚洲精品一二三| 久久久久久久久久久免费av| 香蕉丝袜av| 纵有疾风起免费观看全集完整版| 欧美日韩视频精品一区| av网站免费在线观看视频| 国产极品粉嫩免费观看在线| 欧美国产精品一级二级三级| √禁漫天堂资源中文www| 美女福利国产在线| 少妇 在线观看| 成年人午夜在线观看视频| 99热这里只有是精品在线观看| 久久婷婷青草| 亚洲欧美一区二区三区黑人 | 久久久久人妻精品一区果冻| 国产成人av激情在线播放| 国产成人a∨麻豆精品| 一区二区三区乱码不卡18| 女性被躁到高潮视频| 精品第一国产精品| 成人影院久久| 视频中文字幕在线观看| 老司机亚洲免费影院| 国产精品蜜桃在线观看| 亚洲国产看品久久| 久久人妻熟女aⅴ| 亚洲av福利一区| 一区二区三区四区激情视频| 青春草国产在线视频| 在线观看免费视频网站a站| 久久精品aⅴ一区二区三区四区 | 最近的中文字幕免费完整| 成年女人在线观看亚洲视频| 国产成人精品久久久久久| 26uuu在线亚洲综合色| 精品少妇久久久久久888优播| 亚洲四区av| 少妇的逼好多水| 欧美日韩国产mv在线观看视频| 久久久精品区二区三区| 亚洲精品一二三| 国产成人精品无人区| 少妇人妻 视频| 国产综合精华液| 一级黄片播放器| 秋霞伦理黄片| 大话2 男鬼变身卡| 最近最新中文字幕免费大全7| 免费观看无遮挡的男女| 一区二区三区四区激情视频| 亚洲欧美清纯卡通| 天天躁夜夜躁狠狠躁躁| 亚洲,欧美,日韩| 亚洲美女视频黄频| 久久国内精品自在自线图片| 亚洲精品美女久久av网站| 日日撸夜夜添| 三级国产精品片| 久久这里有精品视频免费| 大香蕉久久成人网| 一区二区三区乱码不卡18| 国产av一区二区精品久久| 国产精品无大码| 一区二区三区四区激情视频| 高清毛片免费看| 成年动漫av网址| 秋霞在线观看毛片| 另类精品久久| 午夜福利乱码中文字幕| 亚洲欧美一区二区三区黑人 | 免费大片黄手机在线观看| 日韩av不卡免费在线播放| 午夜免费鲁丝| 国产无遮挡羞羞视频在线观看| 精品少妇黑人巨大在线播放| 婷婷色麻豆天堂久久| 国产精品一国产av| 爱豆传媒免费全集在线观看| 国产成人91sexporn| 日韩av免费高清视频| 中文字幕av电影在线播放| 久久久久网色| 乱人伦中国视频| 高清视频免费观看一区二区| 欧美最新免费一区二区三区| 最新的欧美精品一区二区| 极品人妻少妇av视频| 9色porny在线观看| 久久精品夜色国产| 国产精品国产av在线观看| 又大又黄又爽视频免费| 亚洲精品成人av观看孕妇| 日韩,欧美,国产一区二区三区| 午夜久久久在线观看| 国产亚洲一区二区精品| 日本-黄色视频高清免费观看| 9色porny在线观看| 亚洲精品久久成人aⅴ小说| 69精品国产乱码久久久| 在现免费观看毛片| 制服丝袜香蕉在线| 日韩成人av中文字幕在线观看| 午夜免费观看性视频| 99久久中文字幕三级久久日本| 黄色 视频免费看| 最近最新中文字幕大全免费视频 | 午夜老司机福利剧场| 国精品久久久久久国模美| 男人爽女人下面视频在线观看| 日韩一区二区三区影片| 新久久久久国产一级毛片| 看免费成人av毛片| 男女下面插进去视频免费观看 | 婷婷色麻豆天堂久久| 亚洲一级一片aⅴ在线观看| 日本av手机在线免费观看| 韩国高清视频一区二区三区| 老熟女久久久| 深夜精品福利| 视频在线观看一区二区三区| 草草在线视频免费看| 制服人妻中文乱码| 九色亚洲精品在线播放| 国产亚洲av片在线观看秒播厂| 狠狠精品人妻久久久久久综合| 欧美xxxx性猛交bbbb| 一个人免费看片子| 人体艺术视频欧美日本| 国产女主播在线喷水免费视频网站| 一级毛片 在线播放| 亚洲av电影在线观看一区二区三区| 水蜜桃什么品种好| 91成人精品电影| 国产免费现黄频在线看| 日本与韩国留学比较| 亚洲av电影在线观看一区二区三区| 2021少妇久久久久久久久久久| 97人妻天天添夜夜摸| 亚洲国产欧美日韩在线播放| 伦精品一区二区三区| 国产极品天堂在线| 一级a做视频免费观看| 曰老女人黄片| 日韩精品免费视频一区二区三区 | 男人舔女人的私密视频| 成人午夜精彩视频在线观看| 亚洲国产精品一区二区三区在线| 青春草亚洲视频在线观看| 91成人精品电影| 午夜av观看不卡| 免费看av在线观看网站| a级毛片在线看网站| 咕卡用的链子| 成人亚洲欧美一区二区av| 欧美日韩视频高清一区二区三区二| 精品一区二区三卡| 免费在线观看黄色视频的| 晚上一个人看的免费电影| 中文天堂在线官网| 久久国内精品自在自线图片| 国产男女超爽视频在线观看| 午夜福利视频精品| 日本黄色日本黄色录像| 亚洲色图综合在线观看| 热99久久久久精品小说推荐| 99热网站在线观看| 一边摸一边做爽爽视频免费| 在线看a的网站| 在现免费观看毛片| 久久久国产精品麻豆| 伦理电影免费视频| 午夜福利视频在线观看免费| 观看av在线不卡| 日本欧美国产在线视频| 国产成人精品久久久久久| 国精品久久久久久国模美| 久久这里有精品视频免费| 七月丁香在线播放| 久久人人97超碰香蕉20202| 亚洲精品aⅴ在线观看| 美女xxoo啪啪120秒动态图| 国产亚洲av片在线观看秒播厂| 在线观看免费日韩欧美大片| 国产老妇伦熟女老妇高清| 精品酒店卫生间| 最近中文字幕高清免费大全6| 宅男免费午夜| 国产激情久久老熟女| 两个人免费观看高清视频| av一本久久久久| 欧美精品一区二区免费开放| 少妇的丰满在线观看| www.熟女人妻精品国产| 人妻丰满熟妇av一区二区三区 | 日韩免费高清中文字幕av| 亚洲熟女毛片儿| 乱人伦中国视频| 亚洲av日韩精品久久久久久密| 制服诱惑二区| 国产高清videossex| 中文亚洲av片在线观看爽 | 久久久国产一区二区| 亚洲一区中文字幕在线| 啦啦啦免费观看视频1| 在线看a的网站| 国产高清videossex| 亚洲欧美激情在线| 午夜福利,免费看| 一级作爱视频免费观看| 脱女人内裤的视频| 黄色 视频免费看| 在线天堂中文资源库| 国产国语露脸激情在线看| 王馨瑶露胸无遮挡在线观看| 国产男靠女视频免费网站| 免费女性裸体啪啪无遮挡网站| 国产成人啪精品午夜网站| 黑人巨大精品欧美一区二区mp4| 亚洲av美国av| 99精品久久久久人妻精品| 亚洲欧美一区二区三区久久| 天天影视国产精品| 亚洲欧美一区二区三区黑人| www.精华液| 亚洲精品国产区一区二| 女人久久www免费人成看片| 午夜精品在线福利| 精品一区二区三区av网在线观看| 建设人人有责人人尽责人人享有的| 国产午夜精品久久久久久| 亚洲免费av在线视频| 日日爽夜夜爽网站| 91成人精品电影| 国产男女超爽视频在线观看| 久久久久久亚洲精品国产蜜桃av| 下体分泌物呈黄色| 另类亚洲欧美激情| 亚洲色图 男人天堂 中文字幕| 精品高清国产在线一区| 国产精品久久久av美女十八| 亚洲欧美精品综合一区二区三区| 美女午夜性视频免费| 黄色视频,在线免费观看| 久久久久国产一级毛片高清牌| 搡老熟女国产l中国老女人| 国产又色又爽无遮挡免费看| 黄色 视频免费看| 日本欧美视频一区| 一个人免费在线观看的高清视频| 最新在线观看一区二区三区| 好看av亚洲va欧美ⅴa在| av在线播放免费不卡| 69av精品久久久久久| 国产高清videossex| 少妇粗大呻吟视频| 中文字幕另类日韩欧美亚洲嫩草| 女人被狂操c到高潮| 欧美日韩av久久| 在线免费观看的www视频| 国产成人av教育| 欧美性长视频在线观看| 久久亚洲精品不卡| 欧美精品一区二区免费开放| 91精品国产国语对白视频| 日本欧美视频一区| 国产黄色免费在线视频| 精品少妇久久久久久888优播| 久久婷婷成人综合色麻豆| 国产午夜精品久久久久久| 女人被狂操c到高潮| 黄色成人免费大全| 国产精品九九99| 少妇的丰满在线观看| 老司机在亚洲福利影院| 亚洲精品粉嫩美女一区| 亚洲免费av在线视频| 亚洲欧美精品综合一区二区三区| 女性生殖器流出的白浆| 女警被强在线播放| 欧美 亚洲 国产 日韩一| 亚洲成人国产一区在线观看| 亚洲人成伊人成综合网2020| 国产精品99久久99久久久不卡| 深夜精品福利| 老司机福利观看| 亚洲国产欧美日韩在线播放| 男女下面插进去视频免费观看| 99精品在免费线老司机午夜| 精品国产一区二区三区四区第35| 视频在线观看一区二区三区| 少妇猛男粗大的猛烈进出视频| 色在线成人网| 成人手机av| 岛国在线观看网站| 国产欧美亚洲国产| 午夜成年电影在线免费观看| 精品国产亚洲在线| 国产一区二区三区在线臀色熟女 | 高清毛片免费观看视频网站 | 国产精品成人在线| 天天躁日日躁夜夜躁夜夜| 亚洲男人天堂网一区| 久久久国产成人精品二区 | 十分钟在线观看高清视频www| 麻豆成人av在线观看| 午夜亚洲福利在线播放| 免费在线观看日本一区| 韩国精品一区二区三区| 成人免费观看视频高清| 国产精品欧美亚洲77777| 麻豆成人av在线观看| 国产欧美亚洲国产| 久久影院123| 国产亚洲精品第一综合不卡| 国产成人影院久久av| 啦啦啦在线免费观看视频4| 精品国产一区二区三区四区第35| 男女床上黄色一级片免费看| 亚洲国产看品久久| 国产区一区二久久| 后天国语完整版免费观看| 成年人黄色毛片网站| 国产精品秋霞免费鲁丝片| 黄片大片在线免费观看| 国产在视频线精品| 欧美在线黄色| 99国产综合亚洲精品| 国产高清国产精品国产三级| 亚洲精品一卡2卡三卡4卡5卡| 欧美日韩亚洲综合一区二区三区_| 成人影院久久| 久久国产精品男人的天堂亚洲| 中文字幕人妻熟女乱码| 午夜两性在线视频| 香蕉丝袜av| 国产精品欧美亚洲77777| 村上凉子中文字幕在线| 99香蕉大伊视频| 午夜两性在线视频| 香蕉丝袜av| 精品卡一卡二卡四卡免费| 欧美黄色片欧美黄色片| av网站在线播放免费| 色婷婷久久久亚洲欧美| 国产一区二区三区在线臀色熟女 | 久久天躁狠狠躁夜夜2o2o| 久久 成人 亚洲| 国产一区在线观看成人免费| 在线观看免费午夜福利视频| 日韩中文字幕欧美一区二区| 狠狠婷婷综合久久久久久88av| 一区二区三区国产精品乱码| 久久天堂一区二区三区四区| 欧美另类亚洲清纯唯美| 中文字幕最新亚洲高清| 国产欧美日韩一区二区三区在线| 欧美成狂野欧美在线观看| 9热在线视频观看99| 狠狠狠狠99中文字幕| 看免费av毛片| 十八禁网站免费在线| 国产精品一区二区在线不卡| 啦啦啦免费观看视频1| 无人区码免费观看不卡| 成年人午夜在线观看视频| 久久久国产精品麻豆| 久久人人爽av亚洲精品天堂| 亚洲欧美色中文字幕在线| tocl精华| 国产精品国产高清国产av | 国产精品亚洲av一区麻豆| 亚洲av成人不卡在线观看播放网| 亚洲黑人精品在线| 欧美精品啪啪一区二区三区| 宅男免费午夜| 免费av中文字幕在线| 一进一出抽搐gif免费好疼 | 国产欧美亚洲国产| 欧美黄色淫秽网站| 韩国精品一区二区三区| tocl精华| 免费在线观看影片大全网站| 亚洲国产欧美一区二区综合| 又黄又爽又免费观看的视频| 极品教师在线免费播放| 亚洲自偷自拍图片 自拍| 亚洲精品美女久久av网站| 高潮久久久久久久久久久不卡| 国产欧美日韩一区二区三| 日韩欧美在线二视频 | 男女免费视频国产| 欧美乱色亚洲激情| 免费高清在线观看日韩| 国产主播在线观看一区二区| 国产国语露脸激情在线看| 欧美日韩黄片免|