萌發(fā)菌HL-003胞內(nèi)多糖的提取及抗氧化性研究

鄭朋朋，楊曉波，李 珊，陳玉惠，敖新宇

（西南林業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，云南昆明650224）

萌發(fā)菌HL-003胞內(nèi)多糖的提取及抗氧化性研究

鄭朋朋，楊曉波，李 珊，陳玉惠，敖新宇*

（西南林業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，云南昆明650224）

采用乙醇沉淀法提取多糖，在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上進(jìn)行正交試驗(yàn)，探討萌發(fā)菌HL-003胞內(nèi)多糖提取的最佳條件；分別采用Fe2+/H2O2體系和鄰苯三酚自氧化法探討多糖清除羥基自由基和氧自由基的能力。結(jié)果表明，最佳提取條件為液料比20∶1（m L∶g）、提取時(shí)間1.5 h、提取溫度70℃、乙醇體積分?jǐn)?shù)80%，其最佳提取率為7.63%；萌發(fā)菌HL-003胞內(nèi)多糖對羥自由基和氧自由基清除作用明顯，是一種良好的天然抗氧化劑。

萌發(fā)菌；多糖提??；正交試驗(yàn)；抗氧化性

真菌多糖是指從各種真菌的子實(shí)體或菌絲體分離提取的一類高分子化合物，是人體健康的重要營養(yǎng)和保健成分[1-5]。真菌多糖可應(yīng)用于人類的疾病治療和保健，具有調(diào)節(jié)機(jī)體免疫力、抗腫瘤、抗病毒、抗氧化、抗輻射、抗衰老、健胃保肝、降血糖、血脂、血壓等多種功能[6-10]。胞內(nèi)多糖不僅具有多方面的生物活性，且多無毒，是比較理想的藥物，如昆布多糖和肝素有抗凝血作用，硫酸軟骨素可防止血管硬化。除了食用菌多糖（如銀耳多糖、靈芝多糖、蜜環(huán)菌多糖）外，刺五加多糖、黃芪多糖、茯苓多糖、枸杞多糖等還具有免疫功能和抗腫瘤作用[10-12]。

萌發(fā)菌HL-003是天麻種子萌發(fā)時(shí)的共生菌，為真菌界擔(dān)子菌門小菇屬（Mycena），屬于高等擔(dān)子菌[13-17]。本研究針對萌發(fā)菌HL-003胞內(nèi)多糖進(jìn)行提取條件優(yōu)化和體外抗氧化性研究。通過對萌發(fā)菌HL-003胞內(nèi)多糖提取過程中液料比、浸提溫度、提取時(shí)間、乙醇體積分?jǐn)?shù)4個(gè)因素進(jìn)行單因素試驗(yàn)，在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上進(jìn)行正交試驗(yàn)，從而對萌發(fā)菌HL-003胞內(nèi)多糖提取工藝進(jìn)行優(yōu)化篩選；并對分離提取的胞內(nèi)多糖進(jìn)行體外抗氧化性探究。旨在探究提取萌發(fā)菌HL-003胞內(nèi)多糖最優(yōu)工藝條件和胞內(nèi)多糖抗氧化性能力，為拓展和大規(guī)模生產(chǎn)萌發(fā)菌HL-003胞內(nèi)多糖提供參考依據(jù)，同時(shí)也為其他的真菌胞內(nèi)多糖的提取提供參考和依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 試驗(yàn)材料

萌發(fā)菌HL-003：西南林業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院生化教研組提供。

1.1.2 試劑

葡萄糖、瓊脂、KH2PO4、MgSO4、蒽酮、水楊酸、硫酸亞鐵、Tris、鄰苯三酚均為分析純：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；正丁醇、氯仿、無水乙醇、濃硫酸、HCl、H2O2：汕滇藥業(yè)有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

BHC-1300無菌超凈工作臺(tái)：江蘇泰諾源生物技術(shù)有限公司；HZ-88搖床：常州普天儀器制造有限公司；BS224S電子天平、Eppendorf-5430 R離心機(jī)：德國賽多利斯公司；MLS-3750高壓滅菌鍋：日本Sanyo公司；RE-2000E真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：無錫中冶結(jié)晶器有限公司；UNIC-WFZVU-480s紫外分光光度計(jì)：上海精密儀器儀表有限公司；HWS-12水浴鍋：上海一恒電熱恒溫水浴鍋；DHG-9240A電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱：上海環(huán)試電子科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 萌發(fā)菌HL-003菌絲體的制備

馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（potato dextrose agar，PDA）進(jìn)行菌株的活化與擴(kuò)繁，之后接入馬鈴薯葡萄糖（potato dextrose，PD）培養(yǎng)基進(jìn)行液體發(fā)酵培養(yǎng)15 d[18]。三層紗布過濾，蒸餾水反復(fù)沖洗菌絲體；菌絲體放入60℃烘箱烘干，粉碎過篩后裝入廣口瓶，放入干燥器備用。

1.3.2 菌體胞內(nèi)多糖的提取與測定

萌發(fā)菌胞內(nèi)多糖的提取流程如下：

菌絲體粉末→水提→濃縮→脫蛋白→醇析→粗多糖→蒸餾水透析12 h→精制多糖→定容待測

葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制：準(zhǔn)確稱取105℃烘箱恒質(zhì)量的葡萄糖10mg，溶解后定容至100m L，配成100μg/m L的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液。分別準(zhǔn)確移取0、0.2m L、0.4m L、0.6m L、0.8m L、1.0 m L標(biāo)準(zhǔn)液于試管中，用蒸餾水補(bǔ)水至1 m L，立即加入4.0 m L蒽酮-硫酸試劑，迅速置于冰水浴中冷卻，各管加完后一起浸于沸水浴中，準(zhǔn)確煮沸10 min后取出，用流水冷卻，室溫放置10 m in，在波長620 nm處測定吸光度值，運(yùn)用Origin 8.0對結(jié)果進(jìn)行分析，繪制葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線。

多糖含量測定：取1 m L稀釋10倍后的待測溶液放入試管中（1 m L蒸餾水作空白對照），其他步驟同上。多糖提取率按照公式（1）計(jì)算：

式中：A為波長620 nm處的吸光度值；m為菌絲體粉末質(zhì)量，g。

1.3.3 單因素試驗(yàn)

液料比對多糖提取率的影響：在浸提溫度60℃，提取時(shí)間2.0h，乙醇體積分?jǐn)?shù)75%條件下，分別設(shè)定液料比10∶1、20∶1、30∶1、40∶1、50∶1（m L∶g）進(jìn)行單因素試驗(yàn)。

浸提溫度對多糖提取率的影響：在液料比20∶1（m L∶g），提取時(shí)間2.0 h，乙醇體積分?jǐn)?shù)75%條件下，分別設(shè)定浸提溫度40℃、50℃、60℃、70℃、80℃進(jìn)行單因素試驗(yàn)。

提取時(shí)間對多糖提取率的影響：在液料比20∶1（m L∶g），浸提溫度60℃，乙醇體積分?jǐn)?shù)75%條件下，分別設(shè)定提取時(shí)間1.0 h、1.5 h、2.0 h、2.5 h、3.0 h進(jìn)行單因素試驗(yàn)。

乙醇體積分?jǐn)?shù)對多糖提取率的影響：在液料比20∶1（m L∶g），浸提溫度60℃，提取時(shí)間2.0 h條件下，分別設(shè)定乙醇體積分?jǐn)?shù)50%、60%、70%、80%、90%進(jìn)行單因素試驗(yàn)。1.3.4正交試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上選定合理的試驗(yàn)因素水平進(jìn)行正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)[21]。分別對液料比（A）、浸提溫度（B）、提取時(shí)間（C）、乙醇體積分?jǐn)?shù)（D）選取3個(gè)水平，運(yùn)用SPSS軟件進(jìn)行4因素3水平正交試驗(yàn)，對試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行軟件分析，得出最佳的試驗(yàn)條件，正交試驗(yàn)的因素水平設(shè)計(jì)見表1。

表1 多糖提取條件優(yōu)化正交試驗(yàn)因素與水平Table 1 Factors and levels of orthogonal experiment for polysaccharide extraction conditions optimization

1.3.5 抗氧化性試驗(yàn)

多糖清除·OH能力的測定：采用Fe2+/H2O2體系測定糖提取液清除·OH的能力[22-23]。分試驗(yàn)組和對照組，試驗(yàn)組分別為粗多糖和精多糖，加入不同質(zhì)量濃度樣品本底組，通過預(yù)實(shí)驗(yàn)確定待測樣品濃度梯度。然后在10 m L的離心管中加入6 mmol/L水楊酸-無水乙醇和6 mmol/L硫酸亞鐵各1 m L后，加入不同質(zhì)量濃度的樣品液1 m L（加1 m L不同質(zhì)量濃度的VC溶液作為參比；加1 m L雙蒸水作為空白），最后加1 m L 6 mmol/L H2O2（樣品本底管加1 m L H2O），立即置37℃水浴30 min。在波長510 nm處測量吸光度值A(chǔ)，試驗(yàn)重復(fù)3次，清除率按下式計(jì)算：

式中：A1為對照吸光度值，A2為樣品吸光度值，A3為樣品本底吸光度值。

多糖抑制超氧陰離子自由基（O2-·）生成能力測定：采用鄰苯三酚自氧化法[20]，測定O2-·清除能力[24-25]。通過預(yù)實(shí)驗(yàn)確定實(shí)驗(yàn)物濃度梯度后在試管中首先加入4.5 m L 50 mmol/L Tris-HCL緩沖液（pH 8.20，含1mmol/L二乙基三胺五乙酸），然后再加入不同濃度樣品液1 m L（加入1 m L不同溶度的VC溶液作為參比）、蒸餾水3.2 m L，對照管中加4.2 m L蒸餾水，25℃水浴30 min，再加入300 μL 3 mmol/L鄰苯三酚（含10 mmol/L HCl）后，立即在吸收波長325 nm處，每隔30 s記錄1次吸光度值，測量時(shí)間3 min，試驗(yàn)重復(fù)3次。按下式計(jì)算抑制率：

式中：ΔA對照表示對照溶液吸光度值隨時(shí)間變化率；ΔA樣品為樣品溶液吸光度值隨時(shí)間變化率。

2 結(jié)果與分析

2.1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

采用Origin8.0測量結(jié)果進(jìn)行分析和繪圖，以葡萄糖質(zhì)量濃度（C）為橫坐標(biāo)，吸光度值（A）為縱坐標(biāo)，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖1所示。得到線性回歸方程：A=0.003 95C-0.006 07，相關(guān)系數(shù)R2=0.998，表明線性關(guān)系良好。

圖1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve of glucose

2.2 單因素試驗(yàn)

2.2.1 液料比對多糖提取率的影響

液料比對多糖提取率的影響如圖2。由圖2可知，液料比在10∶1～20∶1（m L∶g）時(shí)，HL-003胞內(nèi)多糖的提取率隨著液料比的增加而逐漸增大，當(dāng)液料比為20∶1（m L∶g）時(shí)，HL-003胞內(nèi)多糖的提取率達(dá)到最大值，液料比再增加，多糖提取率不再增加，表明最佳液料比為20∶1（m L∶g）。

圖2 液料比對多糖提取率的影響Fig.2 Effect of liquid-solid ratio on extraction rate of polysaccharides

2.2.2 浸提溫度對多糖提取率的影響

圖3 浸提溫度對多糖提取率的影響Fig.3 Effect of extraction temperature on extraction rate of polysaccharides

浸提溫度對多糖提取率的影響如圖3。由圖3可知，浸提溫度在40～60℃時(shí)，隨浸提溫度升高，HL-003胞內(nèi)多糖的提取率隨之增大，浸提溫度為60℃時(shí)，HL-003胞內(nèi)多糖的提取率達(dá)到最大，繼續(xù)升高浸提溫度多糖提取率有所下降，表明最佳浸提溫度為60℃。

2.2.3 提取時(shí)間對多糖提取率的影響

提取時(shí)間對多糖提取率的影響見圖4。由圖4可知，提取時(shí)間在1.0～2.0 h時(shí)，提取時(shí)間延長，HL-003胞內(nèi)多糖的提取率也隨之增大，提取時(shí)間為2.0 h時(shí)，HL-003胞內(nèi)多糖的提取率達(dá)到最大，繼續(xù)延長時(shí)間多糖提取率有所下降，表明最佳提取時(shí)間為2.0 h。

圖4 提取時(shí)間對多糖提取率的影響Fig.4 Effect of extraction time on extraction rate of polysaccharides

2.2.4 乙醇體積分?jǐn)?shù)對多糖提取率的影響

乙醇體積分?jǐn)?shù)對多糖提取率的影響見圖5。由圖5可知，乙醇體積分?jǐn)?shù)在50%～80%時(shí)，隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)增加，HL-003胞內(nèi)多糖的提取率也隨之增大，乙醇體積分?jǐn)?shù)為80%時(shí)，HL-003胞內(nèi)多糖的提取率達(dá)到最大，繼續(xù)延長時(shí)間多糖提取率有所下降，表明最佳乙醇體積分?jǐn)?shù)為80%。

圖5 乙醇體積分?jǐn)?shù)對多糖提取率的影響Fig.5 Effect of ethanol content on extraction rate of polysaccharides

2.3 正交試驗(yàn)

分別以液料比（A）、浸提溫度（B）、提取時(shí)間（C）、乙醇體積分?jǐn)?shù)（D）為評價(jià)因素，多糖提取率為評價(jià)指標(biāo)，正交試驗(yàn)結(jié)果與分析見表2。

表2 多糖提取條件正交試驗(yàn)優(yōu)化結(jié)果與分析Table 2 Results and analysis of orthogonal experiments for polysaccharides extraction conditions optimization

由表2可知，各因素對多糖提取率的影響為A＞D＞B＞C，液料比對多糖提取率的影響最大，乙醇體積分?jǐn)?shù)次之，浸提溫度再次之，提取時(shí)間最小。在試驗(yàn)范圍之內(nèi)最佳優(yōu)化組合為A2B3C1D2，即提取液料比為20∶1（m L∶g），浸提溫度為70℃，提取時(shí)間為1.5 h，乙醇體積分?jǐn)?shù)為80%。在此條件下，萌發(fā)菌HL-003多糖提取率最高，為7.63%。

2.4 多糖抗氧化性試驗(yàn)

2.4.1 多糖清除·OH能力

圖6 多糖及VC對·OH的清除率Fig.6 Scavenging rate of polysaccharides and VC on·OH

多糖和VC清除·OH能力如圖6所示。由圖6可知，胞內(nèi)粗多糖和精多糖都具有清除·OH的能力，其中5 mg/m L精多糖清除能力最大，可達(dá)79.7%。具有一定的清除·OH的能力。相同質(zhì)量濃度下，精制多糖清除·OH的能力強(qiáng)于粗多糖?！H的清除率與多糖質(zhì)量濃度成正相關(guān)性即多糖質(zhì)量濃度越高，清除·OH的能力也越強(qiáng)，與相同質(zhì)量濃度的VC相比較，粗多糖、精多糖的清除·OH能力弱于VC。

2.4.2 多糖抑制O2-·生成能力

多糖和VC抑制O2-·生成能力如圖7所示。由圖7可知，萌發(fā)菌HL003胞內(nèi)粗多糖、胞內(nèi)精制多糖都具有抑制O2-·的能力，多糖純度越高，效果越好，相同質(zhì)量濃度下精制多糖對O2-·生成的抑制強(qiáng)于粗多糖，當(dāng)精制多糖質(zhì)量濃度達(dá)5mg/m L時(shí)對O2-·生成的抑制率最高，可達(dá)66.4%。但與相同質(zhì)量濃度的VC相比，粗多糖、精多糖的抑制率要比VC弱。

圖7 多糖及VC對O2-·的抑制率Fig.7 Scavenging rate of polysaccharides and VC on O2-·

3 結(jié)論

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上進(jìn)行正交試驗(yàn)，優(yōu)化出萌發(fā)菌HL-003胞內(nèi)多糖的最佳提取條件為：液料比20∶1（m L∶g），浸提溫度70℃，提取時(shí)間1.5 h，乙醇體積分?jǐn)?shù)80%，在此條件下，多糖提取率為7.63%。對胞內(nèi)多糖的抗氧化性的研究表明，萌發(fā)菌胞內(nèi)多糖具有較強(qiáng)的抗氧化活性，尤其是精多糖，其中5mg/m L精多糖對羥自由基的清除效率達(dá)到79.7%，抑制氧自由基的效率達(dá)到66.4%?？梢娒劝l(fā)菌胞內(nèi)多糖具有開發(fā)利用的價(jià)值。

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Extraction and antioxidant activity of intracellular polysaccharide from germination fungus HL-003

ZHENG Pengpeng,YANG Xiaobo,LI Shan,CHEN Yuhui,AO Xinyu*
(Co llege of Life Science,Southwest Forestry University,Kunming 650224,China)

Polysaccharides were extracted by ethanol precipitation,and the optimum conditions for intercellular polysaccharide extraction from germination fungus HL-003 were determined by single factor experiment and orthogonal experiment.The hydroxyl radicals and oxygen radicals scavenging activity of polysaccharide were determined by Fe2+/H2O2system and pyrogallol autoxidation method.Results showed that the optimal extraction conditions were liquid-solid ratio 20∶1(m l∶g),extraction time 1.5 h,extraction temperature 70℃,alcohol content 80%,and the optimum extraction rate was 7.63%.Polysaccharides have strong scavenging activity on hydroxyl radicals and oxygen radicals and they are good natural antioxidant.

germination fungus;polysaccharide extraction;orthogonal experiment;antioxidant activity

TS201.2

A

0254-5071（2015）03-0071-05

10.11882/j.issn.0254-5071.2015.03.016

2015-01-19

云南省優(yōu)勢特色重點(diǎn)學(xué)科生物學(xué)一級(jí)學(xué)科建設(shè)項(xiàng)目（50097505）

鄭朋朋(1990-)，男，碩士研究生，研究方向?yàn)樯锘瘜W(xué)與分子生物學(xué)。

*通訊作者：敖新宇（1978-），男，副教授，碩士，主要從事分子生物學(xué)研究工作。