疏水整體柱在線固相萃取與高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用測(cè)定牛肝中5 種阿維菌素類藥物殘留

李 欣， 張瑤琴， 艾連峰， 王學(xué)生* ， 王曼曼， 徐厚君， 郝玉蘭

（1. 華北理工大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，河北 唐山063000；2. 河北出入境檢驗(yàn)檢疫局，河北 石家莊050000）

阿維菌素類藥物（avermectins，AVMs）是由放線菌產(chǎn)生的一組大環(huán)內(nèi)酯類抗生素，憑借殺蟲活性強(qiáng)、蟲譜廣的特點(diǎn)，廣泛應(yīng)用于動(dòng)物養(yǎng)殖［1，2］。阿維菌素類藥物具有神經(jīng)毒性和發(fā)育毒素，脂溶性較高，極易在動(dòng)物體內(nèi)特別是動(dòng)物肝臟中殘留，人體長(zhǎng)期食用這類動(dòng)物肝臟后會(huì)導(dǎo)致神經(jīng)系統(tǒng)及生殖系統(tǒng)紊亂［3，4］。按照世界衛(wèi)生組織5 級(jí)分類標(biāo)準(zhǔn)，阿維菌素類藥物被列為高毒化合物［5］。美國(guó)、歐盟和中國(guó)等均制定了阿維菌素類藥物的最高殘留限量［6，7］。

通常，由于食品樣品基質(zhì)自身的復(fù)雜性，且待測(cè)物往往處于痕量狀態(tài)，因此需要對(duì)樣品進(jìn)行前處理以去除雜質(zhì)并濃縮待測(cè)物?，F(xiàn)有的食品中阿維菌素類藥物殘留的前處理方法主要是固相萃取法，包括C18固相萃取柱［8］和堿性氧化鋁固相萃取柱［9，10］。這些前處理材料均為一次性使用，成本高，且前處理為離線操作，容易出現(xiàn)人為操作誤差和污染。與離線固相萃取方法相比，在線固相萃取凈化技術(shù)有效地簡(jiǎn)化了前處理過程，同時(shí)保證了方法的靈敏度，自動(dòng)化程度高［11-13］。因此，發(fā)展可以重復(fù)使用的固相萃取材料，并建立在線分析測(cè)定牛肝中阿維菌素類藥物殘留的方法具有重要的研究意義和實(shí)際價(jià)值。

研究表明，作為一種固相萃取材料，整體柱（monolithic column）結(jié)構(gòu)連續(xù)多孔，比表面積大，同時(shí)具有良好的生物兼容性。目前，離子交換整體柱、分子印跡整體柱已經(jīng)成功應(yīng)用于食品、環(huán)境和生物樣品的前處理［14-20］。本實(shí)驗(yàn)利用以甲基丙烯酸丁酯為單體的疏水作用整體柱作為在線固相萃取凈化介質(zhì)，結(jié)合高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（HPLC-MS／MS）分析測(cè)定了牛肝中5 種阿維菌素類藥物的殘留。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器和試劑

SHIMADZU LC-2010 型液相色譜儀（島津公司，日本）；在線凈化液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀（Thermo Fisher 公司，美國(guó)），由CTC 多功能自動(dòng)進(jìn)樣器、兩個(gè)四元梯度液相泵、六通閥切換裝置、多元柱切換裝置和TSQ Quantum Ultra 三重四極桿質(zhì)譜儀組成；Sigma 3K-15 型離心機(jī)（Sigma 公司，美 國(guó)）；PT2100 型均質(zhì)器（KINEMATICA 公司，瑞士）；DKZ-2 型電熱恒溫振蕩水槽（上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備公司）；Milli-Q 純化系統(tǒng)（Millipore 公司，美國(guó)）。

甲基丙烯酸丁酯（butyl methacrylate，BMA）和乙二醇二甲基丙烯酸酯（ethylene dimethacrylate，EDMA）均購自阿拉丁試劑公司，正丙醇購自天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所，偶氮二異丁腈和聚乙二醇400 購自天津市大茂化學(xué)試劑廠。乙酸銨、甲酸、異丙醇、乙腈（ACN）、丙酮和氨水均為色譜純，購自Sigma-Aldrich 公司。

標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)：阿維菌素（abamectin，ABM，純度97%）、伊維菌素（ivermectin，IVM，純度96%）、多拉菌素（doramectin，DOP，純度96%）、莫西菌素（moxidectin，MOX，純度87%）和依普菌素（eprinomectin，EPR，純度91%）購自德國(guó)Dr. Ehrenstorfer 公司。

實(shí)驗(yàn)所用牛肝樣品為送檢樣品。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液和標(biāo)準(zhǔn)工作液的配制

分別準(zhǔn)確稱取5 種阿維菌素類藥物標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)10.0 mg（折合純度后），用甲醇配制質(zhì)量濃度為100.0 mg／L 的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，待用。準(zhǔn)確移取適量上述5 種標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，用甲醇稀釋成1.0 mg／L 混合標(biāo)準(zhǔn)工作液，4 ℃下避光保存。

1.3 聚甲基丙烯酸丁酯疏水整體柱的制備

參照文獻(xiàn)［21］方法合成疏水整體柱。將單體BMA（1.0 mmol）、交聯(lián)劑EDMA（3.0 mmol）、致孔劑正丙醇（13.0 mmol）、聚乙二醇400（2.5 mmol）和引發(fā)劑偶氮二異丁腈10 mg，在室溫下超聲混合、脫氣后灌入不銹鋼柱管（10 mm×2.1 mm）中，兩端密封，55 ℃水浴中反應(yīng)4 h 后接入到高壓泵，用甲醇沖洗，得到聚甲基丙烯酸丁酯疏水整體柱（poly（BMA-co-EDMA）整體柱）。

1.4 樣品的制備

牛肝絞碎、混合均勻后，準(zhǔn)確稱取2.0 g 置于50 mL 離心管中，加入8 mL 乙腈，10 000 r／min 下均質(zhì)1 min，5 000 r／min 下離心5 min，取上清液于50 mL 離心管中。重復(fù)提取兩次后合并上清液，用乙腈定容至30 mL。取3 mL 于10 mL 玻璃離心管中，氮吹至干，用乙腈復(fù)溶并定容至1 mL，經(jīng)0.22 μm 微孔濾膜過濾，濾液供HPLC-MS／MS 測(cè)定。

1.5 在線凈化固相萃取與HPLC-MS／MS 條件

1.5.1 在線凈化及HPLC 條件

在線凈化又稱在線固相萃取和富集技術(shù)，程序分為凈化和分離兩個(gè)過程，在線凈化過程（on-line cleanup chromatography，OCC）通過上樣泵（loading pump）驅(qū)動(dòng)凈化流動(dòng)相在制備的poly（BMAco-EDMA）整體柱上完成，分離過程（HPLC）是洗脫泵（eluting pump）驅(qū)動(dòng)分析流動(dòng)相在分析柱上完成。整個(gè)程序與色譜分析同步完成，其間通過兩個(gè)六通閥切換實(shí)現(xiàn)流路變化，從而實(shí)現(xiàn)固相萃取處理試樣與分析測(cè)定的在線自動(dòng)化。

在線固相萃取包括上樣、淋洗、轉(zhuǎn)移、平衡4 個(gè)步驟。上樣泵流動(dòng)相A 為10 mmol／L 乙酸銨水溶液、B 為乙腈、C 為丙酮／乙腈／異丙醇（1 ∶1 ∶1，v／v／v）。HPLC 分析柱為Hypersil GOLD C18柱（100 mm×4.6 mm，3 μm，Thermo Fisher 公司，美國(guó)）。洗脫泵流動(dòng)相A 為乙腈，流動(dòng)相B 為0.1% 氨水溶液。進(jìn)樣量為50 μL。在線凈化程序見表1，其中OCC 在程序中每步的變化采用瞬變模式，HPLC 每步的變化除第4 步采用漸變模式外，其他步驟之間的轉(zhuǎn)換均采用瞬變模式。程序中各步所用流路模式如圖1 所示。

表1 牛肝中阿維菌素類藥物的在線凈化和HPLC-MS／MS 分離程序Table 1 Gradient elution procedure of on-line clean-up and HPLC-MS／MS of the avermectins from bovine liver

圖1 在線凈化流路切換模式示意圖Fig.1 Schematic diagrams of on-line cleanup flow channel switching

1.5.2 MS／MS 條件

電離源：大氣壓化學(xué)電離源（APCI）；掃描模式：多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）負(fù)離子掃描；鞘氣壓力：40 unit；輔助氣壓力：30 unit；離子源溫度：350 ℃；APCI 電流：4 μA；源內(nèi)誘導(dǎo)解離電壓（SID）：10 V；毛細(xì)管溫度：350 ℃；Q1和Q3單位分辨率：Q1＝0.4 u，Q3＝0.7 u；其他測(cè)定條件見表2。

表2 HPLC-MS／MS 分析待測(cè)物的保留時(shí)間、母離子、子離子和裂解能量Table 2 Retention times，precursor ions，product ions and collision energies of the analytes for HPLC-MS／MS analysis

2 結(jié)果與討論

2.1 基于poly（BMA-co-EDMA）整體柱在線固相萃取阿維菌素類藥物的條件優(yōu)化

阿維菌素類藥物是一種弱極性的化合物，C18固相萃取柱往往用于食品樣品中該類藥物的固相萃取。本實(shí)驗(yàn)合成的poly（BMA-co-EDMA）整體柱，由于聚合物骨架表面帶有丁基而成為一種典型的疏水作用整體柱［22，23］。為了考察poly（BMA-co-EDMA）整體柱對(duì)牛肝樣品的凈化和富集能力，將poly（BMA-co-EDMA）整體柱接入高效液相色譜儀（配紫外檢測(cè)器），在梯度洗脫模式下，分別對(duì)牛肝提取液和阿維菌素標(biāo)準(zhǔn)溶液作為典型分析物進(jìn)樣分析。當(dāng)流動(dòng)相為10 mmol／L 乙酸銨緩沖溶液時(shí)，牛肝提取液中的大量雜質(zhì)流出，而在該條件下未發(fā)現(xiàn)阿維菌素色譜峰；當(dāng)流動(dòng)相由10 mmol／L 乙酸銨緩沖溶液轉(zhuǎn)變?yōu)橐译鏁r(shí)，阿維菌素可由乙腈洗脫（圖2）?？梢?，poly（BMA-co-EDMA）整體柱能夠有效去除牛肝提取液中的雜質(zhì)并富集阿維菌素。

圖2 牛肝提取液和阿維菌素標(biāo)準(zhǔn)溶液的色譜圖Fig.2 Chromatograms of a bovine liver sample and abamectin standard solution

應(yīng)用制備的poly（BMA-co-EDMA）整體柱，不接分析柱，采用分流模式對(duì)在線固相萃取參數(shù)（主要是對(duì)上樣流動(dòng)相的種類和洗脫流速）進(jìn)一步優(yōu)化。分別以0.5% 甲酸水溶液、純水、10 mmol／L 乙酸銨緩沖溶液為上樣流動(dòng)相，乙腈作為洗脫流動(dòng)相，對(duì)上樣流動(dòng)相進(jìn)行考察。結(jié)果如圖3 所示，上樣流動(dòng)相為純水或0.5% 甲酸水溶液時(shí)，阿維菌素類藥物的色譜峰拖尾嚴(yán)重，峰形不佳；以10 mmol／L 乙酸銨緩沖溶液為上樣流動(dòng)相時(shí)，色譜峰尖銳、集中，上樣效率最高，因此選用10 mmol／L 乙酸銨緩沖溶液為上樣流動(dòng)相。

圖3 不同上樣流動(dòng)相下阿維菌素類藥物的MRM 譜圖Fig.3 MRM chromatograms of on-line SPE of the avermectins under different loading solutions

在洗脫過程中，以10 mmol／L 乙酸銨緩沖溶液為上樣流動(dòng)相，乙腈為洗脫流動(dòng)相，分別在流速為0.3、0.5、0.8 mL／min 條件下對(duì)阿維菌素類藥物進(jìn)行洗脫。隨著流速的增大，5 種阿維菌素類藥物的色譜峰峰形逐漸改善（見圖4），但考慮到連接分析柱后儀器承受的壓力過大會(huì)對(duì)儀器產(chǎn)生不利影響，故最終選用0.5 mL／min 作為洗脫流速。

圖4 不同洗脫流速下阿維菌素類藥物的MRM 譜圖Fig.4 MRM chromatograms of on-line SPE of the avermectins under various elution flow rates

2.2 HPLC-MS／MS 條件的確立

整個(gè)固相萃取過程為自動(dòng)化控制，在線固相萃取和HPLC-MS／MS 聯(lián)用能夠提高方法的自動(dòng)化程度和靈敏度，同時(shí)降低人為操作引起的誤差和成本。在線凈化柱處理的分析物洗脫后直接轉(zhuǎn)移至HPLC-MS／MS 系統(tǒng)進(jìn)行分析，從而實(shí)現(xiàn)前處理和分離測(cè)定的連接。分析流動(dòng)相的種類影響化合物檢測(cè)的靈敏度、峰形及分離效果。圖5 是分別選用乙腈-0.5% 甲酸溶液（1 ∶9，v／v）、乙腈-0.1% 氨水溶液（1∶9，v／v）為分析流動(dòng)相時(shí)阿維菌素類藥物的響應(yīng)值?？梢娛褂靡译?0.1% 氨水溶液為分析流動(dòng)相時(shí)阿維菌素類藥物的響應(yīng)值較高，這是因?yàn)閴A性環(huán)境下阿維菌素類藥物易電離形成［M-H］-離子。

圖5 不同分離流動(dòng)相條件下阿維菌素類物質(zhì)的響應(yīng)值Fig.5 Responses of avermectins with different desorption solutions

阿維菌素類藥物在質(zhì)譜的電噴霧離子源（ESI）和大氣壓力化學(xué)離子源（APCI）模式下均有響應(yīng)，ESI 模式下［M＋NH4］＋或［M＋Na］＋正離子響應(yīng)強(qiáng)；APCI 模式下［M-H］-負(fù)離子響應(yīng)強(qiáng)。實(shí)驗(yàn)對(duì)兩種模式進(jìn)行了考察，發(fā)現(xiàn)APCI 模式下5 種分析物的響應(yīng)值較ESI 模式下的響應(yīng)值穩(wěn)定，且基質(zhì)效應(yīng)影響小，尤其是對(duì)于肝臟這類復(fù)雜樣品，ESI 模式基質(zhì)效應(yīng)明顯，響應(yīng)值下降50%。因此，本方法選擇APCI 離子源。MRM 及離子源參數(shù)的優(yōu)化是用蠕動(dòng)泵以10 μL／min 向質(zhì)譜系統(tǒng)注入1.0 mg／L 的標(biāo)準(zhǔn)溶液來確定最佳的質(zhì)譜條件，包括選擇特征離子對(duì)，優(yōu)化鞘氣壓力、輔助氣壓力、碰撞能量等質(zhì)譜分析條件。

2.3 基質(zhì)效應(yīng)

基質(zhì)與溶劑標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率的比值可反映基質(zhì)效應(yīng)的強(qiáng)弱。斜率比值在0.8 ～1.2 范圍內(nèi)顯示基質(zhì)效應(yīng)不明顯，超出該范圍則顯示基質(zhì)效應(yīng)較為明顯。用乙腈配制1、5、10、20、50、70 和100 μg／L 的系列混合標(biāo)準(zhǔn)溶液；稱取牛肝陰性樣品，按照前處理步驟提取凈化，以提取液稀釋標(biāo)準(zhǔn)溶液，得到一系列與溶劑標(biāo)準(zhǔn)溶液相同濃度的基質(zhì)混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別以標(biāo)準(zhǔn)溶液的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X，μg／L），峰面積（Y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸分析。結(jié)果顯示，溶劑和基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性良好，相關(guān)系數(shù)r 均大于0.995。如表3 所示，以牛肝為基質(zhì)的基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線與溶劑標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率比值未超出0.8 ～1.2 的范圍，基質(zhì)效應(yīng)不明顯。結(jié)合圖2 的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，poly（BMA-co-EDMA）整體柱對(duì)于牛肝中的阿維菌素類藥物殘留具有良好的凈化作用。

2.4 方法的線性范圍和檢出限

按照1.4 節(jié)方法對(duì)牛肝陰性樣品進(jìn)行處理，用提取液稀釋配制一系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，經(jīng)poly（BMA-co-EDMA）在線固相萃取-HPLC-MS／MS 分析，以分析物的峰面積（Y）對(duì)溶液的質(zhì)量濃度（X，μg／L）線性回歸，得到方法的線性范圍為1 ～100 μg／L，線性相關(guān)系數(shù)r＞0.995。將一定量的阿維菌素類藥物標(biāo)準(zhǔn)溶液加入至牛肝陰性樣品中，依照本法處理、測(cè)定，以信噪比（S／N）為10 計(jì)阿維菌素類藥物的定量限為5 μg／kg。圖6 是添加10 μg／kg 阿維菌素類藥物的牛肝樣品的MRM 譜圖。結(jié)果表明，制備的poly（BMA-co-EDMA）整體柱可以有效地去除牛肝中復(fù)雜基質(zhì)的干擾，實(shí)現(xiàn)了樣品純化富集的目的，達(dá)到國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)（GB／T 21320-2007）所規(guī)定的測(cè)定要求。

表3 牛肝提取液和溶劑的標(biāo)準(zhǔn)曲線及其斜率比值Table 3 Standard curves of avermectins in solvent and matrix ratios and their slope ratios

圖6 （a）空白牛肝樣品和（b）添加10 μg／kg 阿維菌素類藥物的牛肝樣品的MRM 色譜圖Fig.6 MRM mass chromatograms of （a）a blank bovine liver sample and （b）a bovine liver sample spiked with avermectins at 10 μg／kg

2.5 方法的回收率和精密度

在陰性樣品中分別添加4 個(gè)不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行加標(biāo)回收和精密度試驗(yàn)。通過回歸方程計(jì)算，得到加標(biāo)回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）（見表4），方法的加標(biāo)回收率為77.4% ～98.4%，日內(nèi)和日間相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為4.46% ～8.03% 和4.79%～8.68%。

表4 空白牛肝中5 種阿維菌素類藥物的加標(biāo)回收率和精密度Table 4 Recoveries and RSDs of the five avermectins spiked in a blank bovine liver sample

2.6 Poly（BMA-co-EDMA）整體柱的使用壽命

在優(yōu)化的條件下，同一根poly（BMA-co-EDMA）整體柱在重復(fù)使用400 次后，其背壓和萃取效率均無明顯變化。不同使用次數(shù)和不同批次整體柱對(duì)牛肝基質(zhì)中阿維菌素藥物在線凈化前處理后得到的譜圖無明顯差異，色譜峰峰形良好，響應(yīng)值穩(wěn)定，說明該整體柱具有良好的機(jī)械強(qiáng)度、穩(wěn)定性和重現(xiàn)性。相比于傳統(tǒng)的一次性使用的固相萃取柱，該整體柱能夠反復(fù)使用，節(jié)約了分析成本。

2.7 實(shí)際樣品測(cè)定

應(yīng)用該在線凈化分析測(cè)定方法對(duì)送檢的61 例牛肝樣品進(jìn)行分析，其中5 例檢出伊維菌素，含量在5.6 ～6.4 μg／kg 之間。

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)建立了以poly（BMA-co-EDMA）整體柱在線固相萃取，結(jié)合高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜分析測(cè)定牛肝中阿維菌素類藥物殘留的方法，滿足了國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)對(duì)阿維菌素類藥物殘留的測(cè)定要求；方法的自動(dòng)化程度高，萃取材料可以重復(fù)使用達(dá)400 次以上，極大地節(jié)約了分析成本，有望推廣用于其他復(fù)雜基質(zhì)中弱極性藥物殘留分析的前處理。

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