蘇云金芽胞桿菌抗癌晶體蛋白的研究進展

付祖姣， 周 琳， 李 敏， 單世平， 劉清術(shù)

(1.長沙醫(yī)學(xué)院 醫(yī)學(xué)檢驗系，湖南 長沙 410219；2.湖南省微生物研究院，湖南 長沙 410009)

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蘇云金芽胞桿菌抗癌晶體蛋白的研究進展

付祖姣1,2， 周 琳1， 李 敏1， 單世平2， 劉清術(shù)2

(1.長沙醫(yī)學(xué)院 醫(yī)學(xué)檢驗系，湖南 長沙 410219；2.湖南省微生物研究院，湖南 長沙 410009)

抗癌晶體蛋白(parasporins，PS)是由沒有殺蟲活性的蘇云金芽胞桿菌產(chǎn)生的一種晶體蛋白，在經(jīng)過蛋白酶酶解后產(chǎn)生的活性多肽對來自人類不同組織的癌細胞具有特異性細胞毒性，而對正常細胞具有較低毒性或不具有毒性，是一種具有很大潛力的微生物抗癌蛋白。就最近幾年蘇云金芽胞桿菌中已發(fā)現(xiàn)的抗癌晶體蛋白的種類、結(jié)構(gòu)特征、細胞活性譜和殺蟲機制進行簡要概述。

蘇云金芽胞桿菌；晶體蛋白；抗癌；細胞毒性

蘇云金芽胞桿菌(Bacillusthuringiensis，Bt)是一種分布廣泛的革蘭陽性細菌。研究發(fā)現(xiàn)，它能在芽胞形成的同時產(chǎn)生殺蟲晶體蛋白或抗癌晶體蛋白[1-2]。其中，殺蟲晶體蛋白對鱗翅目、鞘翅目、雙翅目等農(nóng)林害蟲和一些醫(yī)學(xué)害蟲具有特異毒殺作用。目前，能夠產(chǎn)生殺蟲晶體蛋白的Bt菌株已經(jīng)廣泛應(yīng)用于農(nóng)、林和醫(yī)藥害蟲的生物防治[3-5]。隨著對Bt研究的深入，人們在自然環(huán)境中篩選出了越來越多的Bt菌株，同時也發(fā)現(xiàn)了很多不具有殺蟲活性的Bt菌株[6-9]，這些不能產(chǎn)生殺蟲晶體蛋白的Bt菌株卻可能產(chǎn)生抗癌晶體蛋白?？拱┚w蛋白是近十多年來在Bt菌株中發(fā)現(xiàn)的另外一類活性蛋白，該類蛋白不具有殺蟲毒力，但經(jīng)蛋白酶酶解后釋放出的活性多肽，能夠選擇性識別并殺死體外培養(yǎng)的來自人類不同組織的癌細胞或癌變組織切片，而對正常細胞具有很小或不具有毒性[10-11]。自1999年日本學(xué)者Mizuki等首次發(fā)現(xiàn)第一個具有抗癌活性的Bt菌株至今[12]，抗癌Bt菌株的研究不斷受到研究人員的重視，在日本、越南、加拿大、馬來西亞等國家相繼分離到數(shù)株產(chǎn)生抗癌晶體蛋白的蘇云金芽胞桿菌[13-16]。近年來，又有很多新的抗癌晶體蛋白被發(fā)現(xiàn)，幾種抗癌晶體蛋白的功能機制也正在被逐步解析。目前Bt菌株產(chǎn)生的抗癌晶體蛋白已經(jīng)發(fā)展為6個群(分別命名為PS1、PS2、PS3、PS4、PS5、PS6)，19個亞類(http://parasporin.fitc.pref.fukuoka.jp/list.html)?，F(xiàn)就Bt菌株產(chǎn)生的各種抗癌晶體蛋白的結(jié)構(gòu)特點、功能和作用機制做一簡要概述。

1 抗癌晶體蛋白結(jié)構(gòu)特點

目前，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)15個以上的Bt菌株能產(chǎn)生抗癌晶體蛋白，已鑒定19個抗癌晶體蛋白，其中11個抗癌晶體蛋白屬于PS1類，3個屬于PS2類，2個屬于PS3類，各有1個分別屬于PS4、PS5和PS6類，如表1所示。19個蛋白的進化關(guān)系如圖1所示。各類PS蛋白有各自不同的基本特性，包括大小、活性中心和基本結(jié)構(gòu)特點，見表2所示。

表1 抗癌晶體蛋白的種類及來源

PS1Aa1，也稱為Cry31Aa1，是最早發(fā)現(xiàn)的一類抗癌晶體蛋白，是由Muziki等2000年從Bt A1190菌株中鑒定到。該蛋白原毒素分子量為81 ku，由723個氨基酸殘基組成，具有與Bt菌株產(chǎn)生的殺蟲晶體蛋白(Crystal Protein，簡稱Cry蛋白)類似的典型的3個結(jié)構(gòu)域、5個保守區(qū)。但該蛋白與已經(jīng)鑒定的Cry蛋白和Cyt蛋白的同源性非常低(少于25%)。

PS2Aa1，又稱為Cry46Aa1，是由338個氨基酸殘基組成的37 ku的多肽。與PS1Aa1不同，PS2Aa1不具有與Cry蛋白類似的典型的結(jié)構(gòu)域，也沒有Cry蛋白中常見的保守區(qū)。該蛋白除了與Cry15Aa具有很低的同源性外，與其他的Cry蛋白和Cyt蛋白都沒有同源性。值得注意的是Cry15Aa與球形芽胞桿菌產(chǎn)生的2種殺蚊蟲毒素Mtx2和Mtx3有很高的同源性。對PS2的活性部分進行X-衍射分析，發(fā)現(xiàn)該蛋白主要由很多的β-片層結(jié)構(gòu)圍繞一個長軸卷曲而成，與凝血素類型的β-穿孔毒素非常類似。該多肽含有3個結(jié)構(gòu)域，結(jié)構(gòu)域1由4個短的a螺旋夾著幾個β-片層組成，可能是結(jié)合靶標的單位。另外2個結(jié)構(gòu)域都由β-片層結(jié)構(gòu)組成，可能與毒素的寡聚化和穿孔有關(guān)。結(jié)構(gòu)域2還有個凝血素型的β-發(fā)夾結(jié)構(gòu)，可能是穿孔通道。該蛋白的表面暴露了大量的絲氨酸和蘇氨酸側(cè)鏈，這些側(cè)鏈可能在結(jié)構(gòu)域1結(jié)合靶細胞后，在靶細胞上定向，直到寡聚化和膜穿孔開始形成。

圖1 抗癌晶體蛋白PS1～PS6之間的系統(tǒng)進化樹Fig.1 Dendrogram of parasporins between the PS1～PS6

PS3Aa1，又稱為Cry41Aa1，由825個氨基酸殘基組成，分子量93 ku，具有與Cry蛋白類似的典型的3個結(jié)構(gòu)域和5個保守區(qū)，但與殺蟲的Cry蛋白同源性仍然很低。PS3Aa蛋白與肉毒桿菌產(chǎn)生的血凝素HA-33蛋白非常類似。

PS4Aa1，又稱為Cry45Aa1，由275個氨基酸殘基組成，分子量31 ku。在該蛋白的一級序列中，沒有發(fā)現(xiàn)一個常出現(xiàn)在Cry蛋白中的保守區(qū)，也沒有發(fā)現(xiàn)典型的3個結(jié)構(gòu)域。而且，該蛋白與其他的抗癌晶體蛋白和殺蟲晶體蛋白同源性均低于30%。

PS5Aa1，由305個氨基酸殘基組成，分子量34 ku。該蛋白與Bt finitimus亞種YBT-020和dakota亞種產(chǎn)生的殺蚊蟲毒素MTX2有較高同源性(分別為36%和37%)，與Cry15Aa有32%的同源性。

PS6Aa1，由753個氨基酸殘基組成，分子量84 ku，與具有殺蟲活性的Cry2有較低的同源性(21.9%)，相似性56.4%，具有典型的3個結(jié)構(gòu)域。

表2 抗癌晶體蛋白的基本特性

注：“-”代表未發(fā)現(xiàn)

2 抗癌晶體蛋白的活性

PS1Aa蛋白經(jīng)胰蛋白酶酶解后產(chǎn)生15和56 ku的活性多肽，兩者可能通過形成多肽二聚體對體外培養(yǎng)的多種癌細胞，如宮頸癌細胞HeLa、早幼粒細胞白血病細胞HL-60具有很高的細胞毒力，同時對急性淋巴細胞性白血病細胞系MOLT-4和肝癌細胞HepG2也具有較高毒力，而對正常細胞，如子宮平滑肌細胞UtSMC、淋巴細胞T-cell、肝細胞HC和胚胎肺細胞MRC5卻沒有任何毒力[17,25]。

PS2Aa原毒素經(jīng)蛋白酶K酶解后產(chǎn)生30 ku的活性多肽，對急性淋巴細胞性白血病細胞MOLT-4和早幼粒細胞白血病細胞HL-60、肝癌細胞HepG2、子宮內(nèi)膜癌細胞Sawano和白血病T細胞Jurkat等具有非常高的細胞毒力，而對正常肝細胞HC無毒力，但PS2蛋白對正常細胞UtSMC、T-cell和MRC5仍有低到中等的毒力[21]。

PS3Aa1蛋白經(jīng)蛋白酶K在N端和C端的消化后，該毒素前體可轉(zhuǎn)化為64 ku的活性多肽，對HL-60和HepG2這2種癌細胞具有中等毒力，而對其他幾種檢測的癌細胞和正常細胞均沒有毒力[23]。

PS4Aa1蛋白經(jīng)蛋白酶K在C端酶切后產(chǎn)生27 ku的活性多肽，對子宮內(nèi)膜癌細胞Sawano、急性淋巴細胞性白血病細胞MOLT-4、早幼粒細胞白血病細胞HL-60、宮頸癌細胞TCS和結(jié)直腸癌細胞Caco-2具有較高的細胞毒力，對肝癌細胞和正常細胞UtSMC、T-cell和HC的組織切片均未表現(xiàn)毒性[24,28]。

PS5Aa蛋白的細胞活性譜還在研究中。

而PS6Aa經(jīng)胰蛋白酶在N端消化后產(chǎn)生14和59 ku片段組成的73 ku的活性多肽，對人類肝癌細胞和宮頸癌HeLa細胞具有較高的毒性，對結(jié)直腸癌細胞Caco-2和正常肝細胞HC具有很低的活性[20]。

3 抗癌晶體蛋白的抗癌機制

3.1 PS1蛋白

PS1Aa蛋白發(fā)揮細胞毒性的途徑主要通過誘導(dǎo)靶標細胞內(nèi)的Ca2+濃度的迅速增加而誘發(fā)細胞凋亡[29]。根據(jù)Katayama等的研究，與具有殺蟲活性的Cry蛋白不同，PS1Aa作用靶標癌細胞后不影響靶細胞膜的通透性，也不能形成膜穿孔，但在作用靶細胞1～3 min內(nèi)即可引起胞內(nèi)游離Ca2+濃度大勢升高，使胞內(nèi)蛋白和DNA合成水平整體下降，毒素作用8～10 h后可顯著引發(fā)細胞病變。靶細胞對PS1Aa的敏感程度與胞內(nèi)Ca2+濃度增加的程度成正比。而且，PS1Aa作用HeLa細胞8 h內(nèi)可在細胞內(nèi)檢測到半胱天冬酶-3前體和多聚腺苷二磷酸核糖聚合酶的降解，其中細胞凋亡因子半胱天冬酶-3的濃度隨著毒素作用時間延長而增大。此外，該蛋白的抗癌活性能被人工合成的三聚體G蛋白信號通道和半胱天冬酶的抑制劑抑制。這些證據(jù)強烈地說明PS1Aa蛋白可能通過誘發(fā)靶標癌細胞的凋亡而殺死癌細胞。

3.2 PS2蛋白

Kitada等對PS2蛋白的抗癌機制進行了系統(tǒng)研究，發(fā)現(xiàn)該蛋白與PS1蛋白不同，它能特異性結(jié)合于肝癌細胞的質(zhì)膜，并能快速提高細胞膜通透性。當PS2蛋白作用于肝癌細胞HepG2后，能引起胞內(nèi)外物質(zhì)的大量出入，并能降解細胞骨架和細胞器，但不會引起線粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)的蛋白的外流。該蛋白作用癌細胞的初步機制可能是先通過特異性結(jié)合于靶標癌細胞膜上的某種特異受體蛋白，然后在質(zhì)膜上形成200 ku以上的寡聚體，引起膜通透性增加，形成膜穿孔，使胞內(nèi)物質(zhì)外流而導(dǎo)致細胞裂解[30]。值得注意的是，PS2Aa的氨基酸序列與梭菌ε毒素的氨基酸序列存在很大的同源性，后者就是通過在質(zhì)膜上形成寡聚體引發(fā)膜穿孔而發(fā)揮細胞毒性的。該蛋白活性部分的X-射線衍射結(jié)構(gòu)也同樣支持這種假說。

3.3 PS4蛋白

Okumura等研究發(fā)現(xiàn)，PS4作用靶標細胞后，能誘發(fā)細胞膨脹、細胞核收縮，膨脹的細胞在24 h內(nèi)會裂解。該蛋白與殺蟲Cry蛋白和β-穿孔型的氣單胞菌溶素同源，富含β片層結(jié)構(gòu)，能在靶標癌細胞CACO-2的質(zhì)膜上形成寡聚體，引發(fā)胞內(nèi)外物質(zhì)的互流，但不能引發(fā)細胞凋亡因子半胱天冬酶-3和半胱天冬酶-7的激活。多個實驗表明PS4蛋白是個不依賴膽固醇的獨特的β-穿孔毒素，它在能誘發(fā)膽固醇消耗的環(huán)式糊精的存在下依然表現(xiàn)細胞活性[31]。

3.4 其他抗癌晶體蛋白

PS3Aa蛋白的作用機制還不清楚，初步研究顯示該蛋白作用靶標細胞1 h后即可引起細胞膨脹[23]。PS5的抗癌機制還在研究中。PS6蛋白作用靶標癌細胞HepG2和HeLa細胞后，能引起細胞膨脹并在細胞膜上形成穿孔。其作用癌細胞的機制可能與穿孔毒素一致[20]。

另有一種特殊的抗癌晶體蛋白，還未進行系統(tǒng)命名。該蛋白由Krishnan等從馬來西亞分離的Bt18菌株產(chǎn)生，經(jīng)胰酶酶解激活后能產(chǎn)生68和28 ku的蛋白質(zhì)[16,32]，其中，68 ku的蛋白的N端與殺蟲晶體蛋白Cry24Aa和Cry25Aa有較高的相似性，而28 ku蛋白質(zhì)的N端與Cry15Aa具有較高相似性，兩者與已發(fā)現(xiàn)的PS蛋白未發(fā)現(xiàn)相似性。68 ku的蛋白和未進行分離的胰酶酶解片段對白細胞淋巴細胞系CEM-SS表現(xiàn)出了非常高的細胞毒性，但68 ku蛋白的細胞活性比未分離的酶解片段活性降低了20%左右。該蛋白作用CEM-SS細胞的機制是通過該蛋白的活性多肽與CEM-SS細胞質(zhì)膜上的3-磷酸甘油醛脫氫酶特異性結(jié)合而誘導(dǎo)細胞凋亡，從而發(fā)揮毒殺癌細胞的作用[32]。最近的研究顯示3-磷酸甘油醛脫氫酶是個多功能的酶，在細胞內(nèi)及細胞膜上均有定位，與細胞癌變和細胞凋亡關(guān)系密切[33]。

4 問題與展望

1985年從Bt菌株中獲得第一個殺蟲晶體蛋白至今，人們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了68大類Cry蛋白和3大類Cyt蛋白，共包括600多個殺蟲晶體蛋白(http://www.lifesci.sussex.ac.uk/Home/Neil_Crickmore/Bt/)[34]，為農(nóng)林、醫(yī)藥害蟲的生物防治提供了豐富的毒素庫。Bt菌株產(chǎn)生的對人類癌細胞有特異細胞毒性，而對正常細胞具有無或低毒力的抗癌晶體蛋白，為癌癥的治療提供了良好選擇?？拱┚w蛋白作為一種潛在的抗癌新藥，前景非常廣闊。由于Bt抗癌晶體蛋白近年來才受到學(xué)術(shù)界的關(guān)注，導(dǎo)致發(fā)現(xiàn)的抗癌晶體蛋白種類相比殺蟲晶體蛋白少得多。因為Bt菌株在自然環(huán)境中的廣泛分布，還有大量的Bt新菌株有待分離鑒定，在這些未鑒定的Bt菌株產(chǎn)生的伴胞晶體中，應(yīng)該存在更多不同種類、不同細胞活性譜的抗癌晶體蛋白，可為研制特異性抗癌藥物提供更多、更有效的選擇。

目前，科研工作者已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了6大類19種抗癌晶體蛋白。它們或通過誘導(dǎo)細胞凋亡途徑，或通過在細胞膜上形成穿孔等途徑而導(dǎo)致癌細胞死亡[21]。它們之所以能特異性識別癌細胞可能與癌細胞上特定的受體有關(guān)，但目前還只發(fā)現(xiàn)CEM-SS細胞膜上的3-磷酸甘油醛脫氫酶是Bt18中68 ku抗癌晶體蛋白的特異受體。其他PS蛋白是否也是通過與靶癌細胞上的3-磷酸甘油醛脫氫酶或者是其他受體結(jié)合從而識別癌細胞還有待進一步的研究。此外，PS蛋白進入癌細胞后，逐步引發(fā)癌細胞死亡的具體作用途徑仍然不夠明晰。進一步研究抗癌晶體蛋白作用靶細胞的分子機制，解決其可能對患者產(chǎn)生的免疫學(xué)反應(yīng)及其他副作用，將有助于發(fā)展該蛋白成為新型微生物抗癌藥物。

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Advances in Parasporins from Bacillus thuringiensis

FU Zu-jiao1,2, ZHOU Lin1, LI Min1, SHAN Shi-ping2, LIU Qing-shu2

(1.Dept.ofMed.Lab.,ChangshaMed.Uni.,Changsha410219; 2.HunanInst.ofMicrobiol.,Changsha410009)

Parasporin (PS) is a kind of crystal proteins synthesized byBacillusthuringiensisthat has no insecticidal activity, after digested by protease the zymolytically active polypeptide possessed specific cytotoxicity against human cancer cells from diferent tissues, however, having lower or non toxicity against normal cells; it is a kind of microbial anti-cancer protein with great potency. Category of the PSs that have been discovered inB.thuringiensisin recent years, their structural features, cytoactive spectrum, and insectcidal mechanism were briefly summarized in this paper.KeywordsBacillusthuringiensis; crystal protein; anti cancer; cytotoxicity

湖南省教育廳項目(12C0519)

付祖姣 女，講師。現(xiàn)從事微生物分子生物學(xué)及應(yīng)用研究。E-mail：fzjp2004@hotmail.com

2014-05-05；

2014-06-18

Q939.124

A

1005-7021(2015)01-0095-06

10.3969/j.issn.1005-7021.2015.01.018