家蠅共生真菌的抗菌活性篩選及菌株CY-03的初步鑒定

葛艷琴， 邵明偉， 周 璇， 文 丹， 潘倩倩， 張應(yīng)烙,2*

(1.浙江師范大學(xué) 化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，浙江 金華 321004；2.南京大學(xué) 醫(yī)藥生物技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 南京 210093)

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家蠅共生真菌的抗菌活性篩選及菌株CY-03的初步鑒定

葛艷琴1， 邵明偉1， 周 璇1， 文 丹1， 潘倩倩1， 張應(yīng)烙1,2*

(1.浙江師范大學(xué) 化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，浙江 金華 321004；2.南京大學(xué) 醫(yī)藥生物技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 南京 210093)

利用平板分離法從家蠅中分離出14株家蠅共生真菌，活性篩選表明CY-03有較好的抗菌活性，在供試濃度為0.1 mg/mL時(shí)，CY-03發(fā)酵液乙酸乙酯萃取物對(duì)番茄早疫病菌和蘋果樹腐爛病菌具有較好的抑制作用，抑制率約60%；在供試濃度為30 μg/濾紙片時(shí)，與陽(yáng)性對(duì)照相比，乙酸乙酯提取物對(duì)枯草芽胞桿菌有中等的抑制作用，抑菌圈直徑為21.0 mm。進(jìn)一步研究CY-03發(fā)酵液不同極性溶劑萃取物的抗菌活性，結(jié)果表明其活性物質(zhì)主要集中在中等極性部位，在供試濃度為0.1 mg/mL時(shí)，CY-03發(fā)酵液乙酸乙酯提取物對(duì)蘋果樹腐爛病菌、楊樹潰瘍病菌、番茄早疫病菌和苦瓜枯萎病菌等具有較好的抑制作用，抑制率均大于45%；在供試濃度為30 μg/濾紙片時(shí)，乙酸乙酯提取物對(duì)金黃色葡萄球菌、枯草桿菌和大腸埃希菌有中等的抑制作用，抑菌圈直徑范圍為14.8～23.0 mm。通過(guò)形態(tài)學(xué)特征觀察和5.8S rDNA測(cè)序分析，初步確定該菌株為尖孢鐮刀菌(Fusariumoxysporum)。CY-03作為微生物源殺菌劑值得進(jìn)一步研究。

家蠅；共生真菌；抗菌活性；尖孢鐮刀菌

微生物是尋找新抗生素的寶貴資源，上世紀(jì)人們已從土壤微生物中分離得到很多臨床應(yīng)用的抗生素。由于長(zhǎng)期從同樣的陸生生境中分離的往往是相同或相似的微生物，且從中分離得到的化合物往往是已知化合物，出現(xiàn)全新骨架活性化合物的幾率已經(jīng)很低。與此同時(shí)，近年來(lái)制藥領(lǐng)域的發(fā)展也使得人們對(duì)藥用活性物質(zhì)的來(lái)源與特性有了更高的要求，已有結(jié)構(gòu)特征的化合物不能適應(yīng)病原體的快速變化，而傳統(tǒng)來(lái)源的天然產(chǎn)物發(fā)現(xiàn)的途徑也難以滿足具有新結(jié)構(gòu)特征或新作用特點(diǎn)化合物發(fā)現(xiàn)的需要。因此，為了發(fā)現(xiàn)新型天然藥源分子，尋找新的特境微生物資源顯得尤為必要。昆蟲共生菌是一類有待開發(fā)的特境微生物，目前研究較少，是新穎天然產(chǎn)物的廣泛來(lái)源[1]。家蠅生活環(huán)境惡劣，雖然置身于不計(jì)其數(shù)的病菌之中，但自身卻能安然無(wú)恙。一般認(rèn)為蠅類的抗菌活性與其自身含有的抗菌肽有關(guān)[2]，但除此之外，有文獻(xiàn)報(bào)道昆蟲共生菌能幫助昆蟲抵抗致病菌的危害[3]，因此，家蠅抵抗致病菌危害可能也與其共生菌有關(guān)。在較系統(tǒng)研究大刀螳螂、棉蝗和負(fù)蝗共生菌活性代謝產(chǎn)物的基礎(chǔ)上[4-6]，活性篩選實(shí)驗(yàn)表明1株家蠅共生真菌具有較好的抗菌活性，本文報(bào)道該活性菌株并初步確定其分類地位，旨在為開發(fā)新型微生物源殺菌劑奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品采集 供試家蠅捕自浙江師范大學(xué)校園內(nèi)。

1.1.2 供試指示菌 供試植物病原真菌為蘋果樹腐爛病菌(Valsamali)、楊樹潰瘍病菌(Dothiorellagregaria)、番茄早疫病菌(Alternariasolani)、苦瓜枯萎病菌(Fusariumoxysporumf. sp.momordicae)；供試致病細(xì)菌為枯草芽胞桿菌(Bacillussubtilis)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、大腸埃希菌(Escherichiacoli)、沙門氏菌(Salmonellatyphimurium)。

1.1.3 培養(yǎng)基 ①M(fèi)EA培養(yǎng)基：生麥芽20 g，加水煮沸30 min，以紗布濾去殘?jiān)瑸V液加水補(bǔ)足至1 000 mL，加入15～20 g瓊脂加熱熔化，再加蔗糖20 g及蛋白胨1 g溶解，分裝，121 ℃、0.1 MPa滅菌20 min備用。不加瓊脂者為相應(yīng)液體培養(yǎng)基(ME)；②牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基：牛肉膏3 g，蛋白胨10 g，NaCl 5 g，瓊脂15～20 g，加熱熔化，再加水補(bǔ)足至1 000 mL，分裝，121 ℃、0.1 MPa滅菌20 min備用。不加瓊脂者為相應(yīng)液體培養(yǎng)基。

1.2 方法

1.2.1 共生真菌的分離及其發(fā)酵產(chǎn)物的提取 按參考文獻(xiàn)[7]的方法從家蠅中分離共生真菌，將家蠅饑餓24 h后，先用75%酒精表面消毒2 min，無(wú)菌水清洗后，按每只家蠅加0.5 mL無(wú)菌水于滅菌研缽中研磨均勻，取0.1 mL研磨液均勻涂布在MEA培養(yǎng)基平板上，待1～2 d長(zhǎng)出菌落后，按無(wú)菌操作程序挑出真菌，接種在MEA培養(yǎng)基上培養(yǎng)，共分離得到14株共生真菌[8]。將分離到的菌株分別接種于裝有150 mL MEA培養(yǎng)液的250 mL三角瓶中，30 ℃、150 r/min條件下，搖床培養(yǎng)7 d。所得發(fā)酵液經(jīng)4～8層紗布過(guò)濾，濾液分別用乙酸乙酯萃取3次，萃取液經(jīng)蒸餾濃縮得粗浸膏。

1.2.2 CY-03不同極性溶劑發(fā)酵產(chǎn)物的提取 對(duì)CY-03進(jìn)行液體發(fā)酵并得到發(fā)酵濾液，濾液依次用石油醚、乙酸乙酯和正丁醇萃取，萃取液經(jīng)減壓濃縮分別得石油醚提取物、乙酸乙酯提取物、正丁醇提取物和水提取物。

1.2.3 提取物對(duì)植物病原真菌的抑菌活性測(cè)定 采用生長(zhǎng)速率法測(cè)定提取物對(duì)植物病原真菌的抑制活性，具體操作過(guò)程參照馮俊濤等[9]方法。用丙酮定容，使粗浸膏最終質(zhì)量濃度為1.0 mg/mL。帶毒培養(yǎng)基的制備：取所制備的家蠅共生真菌提取物1 mg于滅菌的10 mL試管中，加入9 mL 50 ℃左右MEA培養(yǎng)基，搖勻，倒入滅菌培養(yǎng)皿中即成，使帶毒培養(yǎng)基中提取物的最終質(zhì)量濃度為0.1 mg/mL，以等量丙酮作為陰性對(duì)照。將活化的植物病原真菌用無(wú)菌平板打孔器打成直徑5 mm的菌塊，置于培養(yǎng)基上，每處理3次重復(fù)，培養(yǎng)3～7 d后，采用十字交叉法測(cè)量供試菌菌落直徑。按如下公式計(jì)算抑制率：抑制率(%)=((對(duì)照菌落直徑-處理菌落直徑)/(對(duì)照菌落直徑-5 mm))×100%[10]。

1.2.4 提取物對(duì)致病細(xì)菌的抑菌活性測(cè)定 采用濾紙片法[11-12]測(cè)定發(fā)酵提取物對(duì)致病細(xì)菌的抑制活性。提取物用丙酮溶劑配成濃度為6 mg/mL的藥液，青霉素、硫酸慶大霉素加蒸餾水分別配成濃度為6 mg/mL作為陽(yáng)性對(duì)照，丙酮作為陰性對(duì)照。將細(xì)菌接種于牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基中，恒溫?fù)u床培養(yǎng)1～2 d活化，將上述供試菌充分稀釋，用麥?zhǔn)媳葷峁軐?duì)比，配成1×108cfu/mL，吸取200 μL涂布在牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基上，用移液槍吸取5 μL藥液滴加到直徑為6 mm的無(wú)菌濾紙片上，相同藥劑處理3次，待溶劑完全揮發(fā)后放入上述制備好的固體培養(yǎng)基中，置于28 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1～2 d，觀察是否產(chǎn)生抑菌圈，并采用十字交叉法測(cè)量抑菌圈的直徑[13]。

1.2.5 CY-03菌株鑒定 采用形態(tài)特征和DNA測(cè)序相結(jié)合的方法鑒定CY-03菌株。首先觀察CY-03菌株的菌落形態(tài)，挑取少量菌落制片，用生物顯微鏡觀察菌株孢子的形態(tài)特征；同時(shí)，將培養(yǎng)好的CY-03新鮮菌體作為DNA提取的材料，按照生工SK1201-UNIQ-10柱式植物基因組DNA抽提試劑盒說(shuō)明書提取，使用通用引物ITS1和ITS4進(jìn)行PCR擴(kuò)增5.8S rDNA序列，將PCR產(chǎn)物純化后送上海生工公司測(cè)序，測(cè)序結(jié)果進(jìn)行BLAST比對(duì)分析，選取相似序列，利用MEGA 5.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，確定CY-03菌株的種屬分類地位。

2 結(jié)果與分析

2.1 家蠅共生真菌提取物對(duì)4種植物病原真菌菌絲生長(zhǎng)的抑制作用

14株家蠅共生真菌發(fā)酵液的乙酸乙酯提取物對(duì)4種植物病原真菌生長(zhǎng)的抑制結(jié)果見(jiàn)表1。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，當(dāng)供試濃度為0.1 mg/mL時(shí)，CY-03對(duì)番茄早疫病菌和蘋果樹腐爛病菌的抑制率約為60%；CY-01、CY-05、CY-06、CY-09、CY-10、CY-11和CY-13僅對(duì)其中1種供試菌的抑制率大于60%；其他共生真菌的抑制率較差，均在60%以下。

表1 14株共生真菌提取物對(duì)4種植物病原真菌菌絲生長(zhǎng)的抑制作用

注：提取物供試濃度為0.1 mg/mL；“a”表示菌落直徑(mm)；“b”表示抑制率(﹪)；結(jié)果表示為抑制率±3個(gè)平行測(cè)量值的標(biāo)準(zhǔn)差；CK為陰性對(duì)照，表3同

2.2 家蠅共生真菌提取物對(duì)4種致病細(xì)菌生長(zhǎng)的抑制作用

14株家蠅共生真菌發(fā)酵液的乙酸乙酯提取物對(duì)4種致病細(xì)菌生長(zhǎng)的抑制結(jié)果見(jiàn)表2。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，當(dāng)每濾紙片上藥品含量為30 μg時(shí)，CY-03對(duì)枯草芽胞桿菌有較好的抗菌活性，抑菌圈達(dá)21.0 mm，與陽(yáng)性對(duì)照青霉素和硫酸慶大霉素效果相當(dāng)；其他共生真菌對(duì)供試菌的抑菌效果較弱，抑菌圈直徑均小于14.0 mm。

2.3 CY-03不同極性提取物對(duì)4種植物病原真菌菌絲生長(zhǎng)的抑制作用

家蠅共生真菌CY-03發(fā)酵液的不同極性溶劑的提取物對(duì)4種植物病原真菌生長(zhǎng)的抑制結(jié)果見(jiàn)表3。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，當(dāng)供試濃度為0.1 mg/mL時(shí)，乙酸乙酯提取物對(duì)苦瓜枯萎病菌、番茄早疫病菌、蘋果樹腐爛病菌和楊樹潰瘍病菌等4種植物致病真菌抗菌活性最好，抑制率均大于45%；其他提取物的抗菌活性都不高，抑制率均小于45%。因此，CY-03發(fā)酵液的抗真菌活性物質(zhì)主要集中在中等極性的乙酸乙酯部位。

表2 14株共生真菌提取物對(duì)4種致病細(xì)菌生長(zhǎng)抑制作用的抑菌圈直徑(mm)

注：供試濃度為30 μg/濾紙片；結(jié)果表示為抑菌圈大小±3個(gè)平行測(cè)量值的標(biāo)準(zhǔn)差，表4同

表3 CY-03不同極性提取物對(duì)4種植物病原真菌菌絲生長(zhǎng)的抑制作用

2.4 CY-03不同極性提取物對(duì)4種致病細(xì)菌生長(zhǎng)的抑制作用

家蠅共生真菌CY-03發(fā)酵液不同極性溶劑的提取物對(duì)4種致病細(xì)菌生長(zhǎng)的抑制結(jié)果見(jiàn)表4。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，當(dāng)每濾紙片上藥品含量為30 μg時(shí)，乙酸乙酯提取物對(duì)金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、枯草芽胞桿菌等3種致病細(xì)菌的抗菌活性較好，抑菌圈直徑范圍為14.8～23.0 mm；正丁醇萃取物抗菌效果次之，抑菌圈直徑范圍為10.2～15.5 mm；石油醚提取物和水提取物的抑菌活性較差，抑菌圈直徑均小于16.5 mm。因此，CY-03發(fā)酵液的抗細(xì)菌活性物質(zhì)主要集中在中等極性的乙酸乙酯部位。

2.5 CY-03菌種鑒定

2.5.1 形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果 在MEA培養(yǎng)基上，CY-03菌株菌落呈圓形，質(zhì)地均勻，緊貼平板，生長(zhǎng)旺盛，基內(nèi)菌絲呈暗紅色，氣生菌絲為白色絨狀，能產(chǎn)生大、小型分生孢子，大型分生孢子有隔膜，卵圓形至鐮刀形，小型分生孢子著生于單生瓶梗上，常在瓶梗頂端聚成球團(tuán)，單胞。參考文獻(xiàn)[14-15]，CY-03與尖孢鐮刀菌形態(tài)較一致。

2.5.2 5.8S rDNA序列分析 將CY-03菌的5.8S rDNA基因序列通過(guò)BLAST比對(duì)，發(fā)現(xiàn)CY-03序列(GenBank中保存號(hào)為KJ645965)與尖孢鐮刀菌(FusariumoxysporumJQ701799)的同源性高達(dá)99%，在系統(tǒng)發(fā)育樹上處于同一分支(圖1)，結(jié)合形態(tài)學(xué)鑒定，最終確定CY-03為尖孢鐮刀菌(Fusariumoxysporum)。

表4 CY-03不同極性提取物對(duì)4種致病細(xì)菌生長(zhǎng)抑制作用的抑菌圈直徑(mm)

圖1 基于5.8S rDNA 基因序列構(gòu)建的菌株CY-03與鐮刀菌屬相關(guān)菌株之間的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.1 Phylogenetic tree based on the 5.8S rDNA gene sequences of CY-03 and Fusarium′s related strains

3 討 論

本實(shí)驗(yàn)從家蠅分離得到14株共生真菌，活性篩選表明CY-03具有較好的抗菌活性，進(jìn)一步活性測(cè)試表明CY-03的乙酸乙酯提取物對(duì)苦瓜枯萎病菌、蘋果樹腐爛病菌、番茄早疫病菌、楊樹潰瘍病菌等4種真菌有中等的抑菌活性；對(duì)金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、枯草芽胞桿菌等3種細(xì)菌也有中等的抑菌活性。因此，菌株CY-03具有開發(fā)成微生物源抗菌劑的潛力，值得進(jìn)一步研究。至于CY-03菌株的活性成分的分離鑒定、活性作用機(jī)理等，還有待于進(jìn)一步的研究探討。

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Screening of Antimicrobial Active Substance from Symbiotic Fungi in Housefly and Initial Identification of Strain CY-03

GE Yan-qin1, SHAO Ming-wei1, ZHOU Xuan1, WEN Dan1, PAN Qian-qian1, ZHANG Ying-lao1,2

(1.Coll.ofChem. &LifeSci.,ZhejiangNormalUni.,Jinhua321004; 2.StateKeyLab.ofPharm.Biotech.,NanjingUni.,Nanjing210093)

Fourteen housefly symbiotic fungi were isolated from the gut of housefly by means of spread plate isolation method. Screening of activity showed that strain CY-03 showed better antimicrobial activity, under tested concentration at 0.1 mg/mL, the acetic acetate extract (AAE) of CY-03 fermented broth had preferable antifungal activity against pathogens of tomato early blight, apple canker with inhibition rate at 60%; when the tested concentration was at 30 μg/filter paper, as compared with positive control, AAE had medium inhibition againstB.subtiliswith inhibition ring at 21.0 mm. The antimicrobial activity of CY-03 fermented broth extracted with different polar solvent was further studied, the results showed that the active substances were focused on the parts of medium polarity, when the tested concentraion was at 0.1 mg/mL, the AAE of CY-03 fermented broth had better inhibition against the pathogens of poplar ulcer, tomato early blight, and balsam pear firing with inhibition rate of over 45%; when the tested concentration was at 30 μg/filter paper, the AAE had medium inhibition againstStreptococcusaureus,Bacillussubstilis, andE.coli, with inhibition rings ranged at 14.8～23.0 mm. The strain was initially identified asFusariumoxysporummorphologically and through 5.8S rDNA sequence analysis. CY-03 is worthy to study further as antimicrobial preparation of microbial resources.

housefly; symbiotic fungi; antimicrobial active substance;Alternariasolani

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(21272215)；南京大學(xué)醫(yī)藥生物技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開放課題(KF-GN-201302)；浙江

省高等學(xué)校中青年學(xué)科帶頭人學(xué)術(shù)攀登項(xiàng)目(pd2013059)；浙江省大學(xué)生科技創(chuàng)新活動(dòng)計(jì)劃資助項(xiàng)目(2013R404029)

葛艷琴 女，本科。主要從事應(yīng)用微生物學(xué)研究。E-mail:geyanqin2014@163.com

* 通訊作者。男，副教授，博士。研究方向?yàn)閼?yīng)用微生物學(xué)。Tel:0579-82286419,E-mail:ylzhang@zjnu.cn

2014-03-03；

2014-04-15

Q939.1

A

1005-7021(2015)01-0061-06

10.3969/j.issn.1005-7021.2015.01.012