組織芯片分析PRSS2蛋白在胃癌組織中的表達(dá)與意義

,, ,,, ,,,,

(1.南華大學(xué)附屬第一醫(yī)院病理科,湖南 衡陽 421001;2.南華大學(xué)醫(yī)學(xué)院腫瘤研究所,腫瘤細(xì)胞與分子病理學(xué)湖南省高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室;3.湖南省胃癌研究中心;4.南華大學(xué)附屬第二醫(yī)院耳鼻喉科;5.邵陽醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校附屬醫(yī)院病理科;6.衡陽市中心醫(yī)院急診科;7.南華大學(xué)醫(yī)學(xué)院臨床醫(yī)學(xué)卓越醫(yī)師班)

·基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)·

組織芯片分析PRSS2蛋白在胃癌組織中的表達(dá)與意義

趙強(qiáng)1,3,張志偉2,3*,肖娟4,劉重元1,伍石華2,5,李臻6,雷明生7,楊代水7,權(quán)里平7,舒友成7

(1.南華大學(xué)附屬第一醫(yī)院病理科,湖南 衡陽 421001;2.南華大學(xué)醫(yī)學(xué)院腫瘤研究所,腫瘤細(xì)胞與分子病理學(xué)湖南省高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室;3.湖南省胃癌研究中心;4.南華大學(xué)附屬第二醫(yī)院耳鼻喉科;5.邵陽醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校附屬醫(yī)院病理科;6.衡陽市中心醫(yī)院急診科;7.南華大學(xué)醫(yī)學(xué)院臨床醫(yī)學(xué)卓越醫(yī)師班)

目的采用組織芯片分析PRSS2蛋白在胃癌組織中表達(dá)與意義，為獲取胃癌診斷相關(guān)的蛋白分子提供實(shí)驗(yàn)資料。方法首先收集8例胃癌手術(shù)切除標(biāo)本，包括正常胃粘膜、癌旁組織與胃癌組織，選用Western-blotting方法檢測(cè)PRSS2蛋白在正常胃粘膜、癌旁組織與胃癌組織中的表達(dá)；其次運(yùn)用免疫組織化學(xué)染色方法觀察組織芯片(包括正常胃粘膜、癌旁和胃癌組織)中PRSS2蛋白在胃癌組織中的表達(dá)，分析其臨床意義。結(jié)果胃癌組織中PRSS2蛋白表達(dá)較正常胃粘膜和癌旁組織明顯升高，癌旁組織中的表達(dá)較正常胃粘膜組織升高；正常胃粘膜、癌旁和胃癌組織中PRSS2蛋白的陽性表達(dá)率分別為14.29%(5/34)、26.92%(7/26)和77.78%(63/81)，在胃癌組織中高分化、中分化和低分化腺癌的陽性表達(dá)率分別為60.00%(3/5)、70.59%(12/17)和81.36%(48/59)；PRSS2蛋白的陽性表達(dá)與胃癌組織的分化程度也呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)。結(jié)論P(yáng)RSS2蛋白在胃癌組織中表達(dá)較正常胃粘膜和癌旁組織高，癌旁組織中的表達(dá)較正常胃粘膜組織高，該蛋白表達(dá)與胃癌組織的發(fā)生和分化程度有關(guān)。

胃癌； PRSS2蛋白； 蛋白表達(dá)； 分化程度

胃癌是我國最常見的惡性腫瘤之一[1,2]。近年來，我國胃癌發(fā)病率呈逐漸下降趨勢(shì)，但呈現(xiàn)年輕化趨勢(shì)，仍嚴(yán)重威脅著人們的健康與生命[3-5]。早期診斷是目前防治胃癌的關(guān)鍵，因此尋找高效、敏感的胃癌診斷標(biāo)記物，對(duì)提高胃癌早期診斷，改善整體療效，延長患者生命具有十分重要的意義。本研究旨在分析PRSS2蛋白在胃癌中表達(dá)與意義，為胃癌早期診斷及評(píng)估患者預(yù)后提供有價(jià)值的資料。

1 材料與方法

1.1材料收集8例南華大學(xué)附一醫(yī)院胃癌手術(shù)切除標(biāo)本，其中男性7例，女性3例，年齡38～72歲，平均年齡約48歲。標(biāo)本收集時(shí)以距癌灶10 cm以上者為正常胃粘膜組織(經(jīng)病理確診為正常胃粘膜組織)，距癌灶3～5 cm者為癌旁組織(經(jīng)病理確診為非典型增生或伴腸上皮化生的胃粘膜組織)。上述所有患者術(shù)前均未進(jìn)行化療或放療，所有標(biāo)本均經(jīng)病理確診。

組織芯片由湘潭市第一人民醫(yī)院病理科吳勇軍主任醫(yī)師制作贈(zèng)送。芯片中包括正常胃粘膜、癌旁與胃癌組織，芯片中組織樣本取自2003年～2009年湘潭市第一人民醫(yī)院手術(shù)切除胃癌標(biāo)本81例，其中高分化腺癌5例、中分化腺癌17例、低分化腺癌59例。所有胃癌患者中男性56例，女性25例，年齡27～81歲，平均年齡為55.35歲；芯片中另有34例正常胃粘膜對(duì)照(經(jīng)病理確診)，芯片包括5×10個(gè)點(diǎn)陣，芯片中包含的所有組織均經(jīng)病理確診[5]，患者也未進(jìn)行化療或放療。鼠抗人PRSS2蛋白抗體購自上海優(yōu)寧維生物科技有限公司，SP免疫組化檢測(cè)試劑盒均購自福建邁新生物技術(shù)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 Western-blotting 將收集組織加入組織裂解液后，在勻漿器中研磨，制備總蛋白液，測(cè)定濃度后，以各泳道50 μg的總蛋白進(jìn)行10% SDS不連續(xù)聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜、封閉，一抗(1∶1 000)及抗β-actin單體(1∶2 000)4 ℃孵育過夜，洗膜后，HRP標(biāo)記的羊抗兔二抗(1∶1 000)孵育、洗膜、發(fā)光、曝光、顯影、定影以及分析結(jié)果。

1.2.2 免疫組織化學(xué)染色 操作按照超敏SP試劑盒所附說明書進(jìn)行，用已知陽性片作陽性對(duì)照(福建邁新生物有限公司提供)，同時(shí)用PBS替代第一抗體作陰性對(duì)照，實(shí)驗(yàn)步驟如下：將制備好的石蠟切片58 ℃隔水式恒溫培養(yǎng)箱中過夜；二甲苯脫蠟2次后水化，PBS洗片3次，每次3 min；將切片浸入盛有枸椽酸鹽緩沖液容器中微波爐加熱進(jìn)行抗原修復(fù)；加3%過氧化物酶阻斷液，37 ℃ 15 min，PBS洗片3次，每次3 min；加足量非免疫性動(dòng)物血清，37 ℃ 10 min，阻斷非特異性結(jié)合位點(diǎn)；分別滴加一抗，置濕盒中4 ℃冰箱過夜；滴加生物素標(biāo)記的二抗，37 ℃ 15 min；滴加鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶溶液，37 ℃ 15 min； DAB顯色、蘇木素復(fù)染、返藍(lán)、脫水、透明、封片、顯微鏡觀察、照相(結(jié)果陽性部位呈棕黃色)。

1.2.3 免疫組織化學(xué)染色結(jié)果判定 組織芯片中黃色、棕色、棕褐色部位為蛋白陽性表達(dá)。選取五個(gè)不重復(fù)視野，記數(shù)組織中細(xì)胞總數(shù)與陽性表達(dá)細(xì)胞數(shù)，計(jì)算陽性表達(dá)率。蛋白表達(dá)結(jié)果的判定，按染色強(qiáng)度與陽性細(xì)胞數(shù)占細(xì)胞總數(shù)的百分比綜合計(jì)分[2-4]。染色強(qiáng)度：無色者為1分，黃色者為2分，棕褐色者為3分；陽性細(xì)胞數(shù)：≤總數(shù)的10%者為1分；11%～50%者為2分；>50%者為3分。將染色強(qiáng)度分值與陽性細(xì)胞數(shù)分值相乘，1分者為陰性“-”；2～4分者為陽性“+”，≥6分者為強(qiáng)陽性“+++”，其中陽性細(xì)胞數(shù)>l0%者為陽性表達(dá)。

1.2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)所有數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理和分析。選用χ2檢驗(yàn)分析PRSS2蛋白的表達(dá)與不同胃組織臨床資料的關(guān)系，以P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 Western-blotting檢測(cè)PRSS2蛋白的表達(dá)PRSS2蛋白在胃癌組織中的表達(dá)較正常胃粘膜和癌旁組織低。同時(shí)，癌旁組織中PRSS2蛋白表達(dá)較正常胃粘膜組織低(圖1)。

圖1 PRSS2蛋白的表達(dá) 1：正常胃粘膜；2：癌旁組織；3：胃癌組織

2.2免疫組織化學(xué)染色觀察PRSS2蛋白的表達(dá)

采用免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)PRSS2蛋白在組織芯片中的表達(dá)。結(jié)果顯示PRSS2蛋白表達(dá)主要位于細(xì)胞漿(圖2)。

圖2 免疫組織化學(xué)檢測(cè)組織中PRSS2蛋白表達(dá)代表切片A：正常胃粘膜(-)；B：癌旁組織(+)；C：高分化腺癌(++)；D：中分化腺癌(+++)；E：低分化腺癌(+++).A1、B1、C1、D1和E1放大倍數(shù)為40倍；A2、B2、C2、D2和E2放大倍數(shù)為400倍

2.3 PRSS2蛋白表達(dá)情況的分析根據(jù)免疫組織化學(xué)染色結(jié)果，分別計(jì)算PRSS2蛋白在不同類型組織中的陽性表達(dá)率。PRSS2蛋白在正常胃粘膜、癌旁組織及胃癌組織中的陽性表達(dá)率分別為14.29%(5/34)、26.92%(7/26)和77.78%(63/81)。胃癌組織中PRSS2蛋白的陽性表達(dá)率較正常胃粘膜和癌旁組織高。同時(shí)，癌旁組織中PRSS2蛋白的陽性表達(dá)率較正常胃粘膜組織高(表1，P<0.01)。胃高分化、中分化和低分腺癌中PRSS2蛋白的陽性表達(dá)率分別為60.00%(3/5)、70.59%(12/17)和81.36%(48/59)，結(jié)果提示，PRSS2蛋白的表達(dá)與胃癌的發(fā)生及分化程度有關(guān)，即該蛋白在胃癌組織中高表達(dá)，且癌組織分化程度降低，其表達(dá)增加。

表1不同組織中PRSS2蛋白的表達(dá)情況

組 別nPRSS2蛋白表達(dá)-+^+++陽性率(%)正常胃粘膜3425514.29癌旁組織2619726.92a胃癌組織 高分化腺癌52360.00ab 中分化腺癌1751270.59abc低分化腺癌59114881.36abcd

與正常胃粘膜組比較，a:P<0.01；與癌旁組織比較，b:P<0.01；與高分化腺癌比較，c:P<0.01；與中分化腺癌比較，d:P<0.01

3 討 論

近年來，人們對(duì)胃癌的早期診斷做了大量的系統(tǒng)研究，使胃癌的早期篩查、診斷與治療水平均取得了一定程度的提高，但臨床療效仍有待進(jìn)一步改觀?，F(xiàn)已有一些胃癌診斷分子標(biāo)記物應(yīng)用臨床的診斷與治療，如CA19-9[6]、CEA[7]、Span-1[8]等，但它們針對(duì)胃癌早期診斷的應(yīng)用效果尚有待分析。近年來，隨著蛋白組學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，許多胃癌相關(guān)蛋白被不斷的發(fā)現(xiàn)，為獲取胃癌早期診斷的標(biāo)志物提供了可能。

胰蛋白酶原2(PRSS2)是一種絲氨酸蛋白酶，許多研究均證實(shí)其和多種惡性腫瘤密切相關(guān)，因此PRSS2也稱為腫瘤相關(guān)胰蛋白酶原2(PRSS2)。PRSS2具有以下特征[9-11]：多種惡性腫瘤細(xì)胞株和人體惡性腫瘤中均表達(dá)該蛋白，其表達(dá)與腫瘤的侵襲與轉(zhuǎn)移機(jī)制有關(guān)，可直接或間接地水解腫瘤周圍基質(zhì)蛋白，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的侵襲與轉(zhuǎn)移，其抑制劑可抑制腫瘤侵襲，多產(chǎn)生于胰腺外的器官或組織。PRSS2是基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)的激活物，能激活間質(zhì)膠原酶(MMP-1、8和13)，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞周圍的膠原蛋白降解，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移[12]?；赑RSS2蛋白的功能，結(jié)合我們?cè)谖赴┙M織中的檢測(cè)結(jié)果，胃癌組織中該蛋白的表達(dá)與其分化程度成負(fù)相關(guān)，即惡性程度高的低分化腺癌呈現(xiàn)高表達(dá)，低分化腺癌臨床常表現(xiàn)易發(fā)生侵襲與轉(zhuǎn)移，其在轉(zhuǎn)移過程中需要PRSS2蛋白水解癌細(xì)胞周圍的基質(zhì)蛋白、血管壁組織、淋巴管組織，有利于癌細(xì)胞的浸潤、轉(zhuǎn)移。因此，臨床檢測(cè)該蛋白在癌組織中的表達(dá)水平，可分辨癌細(xì)胞的惡性程度與轉(zhuǎn)移能力，對(duì)預(yù)測(cè)評(píng)估患者的預(yù)后具有十分重要的意義。

PRSS2蛋白能夠激活蛋白酶激活受體，促進(jìn)腫瘤的生長發(fā)育[9,10]。有研究報(bào)道[13]，結(jié)直腸腫瘤組織PRSS2的表達(dá)較其周圍的正常粘膜組織明顯上調(diào)。我們?cè)谖赴┙M織中檢測(cè)該蛋白得到了類似的結(jié)果，即PRSS2蛋白在癌組織中高表達(dá)，在非典型增生的胃粘膜也高于正常粘膜組織，結(jié)果提示該蛋白在胃粘膜癌變過程中呈現(xiàn)逐漸上調(diào)的現(xiàn)象。另外，許多研究顯示，多種腫瘤患者體內(nèi)呈現(xiàn)血清PRSS2蛋白的高水平，檢測(cè)血清中該蛋白的變化，可預(yù)測(cè)體內(nèi)腫瘤的進(jìn)展情況[14]。因此，觀察PRSS2蛋白在胃癌組織與患者體內(nèi)血清蛋白的水平，了解該蛋白的改變情況，有望監(jiān)測(cè)患者體內(nèi)胃癌的進(jìn)展情況。由于血清檢測(cè)的簡單、便捷，深入揭示該蛋白在胃癌發(fā)生與發(fā)展中的作用，有望成為胃癌早期診斷與檢測(cè)胃癌發(fā)展的蛋白分子。因胃癌發(fā)生發(fā)展的多基因與多因素參與的復(fù)雜性，以及本次研究樣的本量有限，臨床應(yīng)用前仍需擴(kuò)大檢測(cè)樣本進(jìn)行分析與評(píng)估。

[1] 陳萬青,張思維,鄭榮壽,等.中國腫瘤登記地區(qū)2007年腫瘤發(fā)病和死亡分析[J].中國腫瘤,2011,20(3):162-169.

[2] 張志偉,湯國輝,趙強(qiáng),等.AKT-p27Kip1-Cyclin E在胃癌組織中的表達(dá)及意義[J].世界華人消化雜志,2011,19(21):2233-2240.

[3] 郭玉鳳,張志偉,賀修勝，等.組織芯片檢測(cè)p16蛋白在不同胃組織中的表達(dá)意義.腫瘤學(xué)雜志,2012,18(10):746-749.

[4] 趙強(qiáng),張志偉,劉重元，等.PKCα-Annexin A2-S100A10在胃癌組織中的表達(dá)及意義[J].世界華人消化雜志,2014,22(13):1793-1800.

[5] 楊軍,劉妮,康安靜，等.一種新型胃癌組織學(xué)分型、分級(jí)-評(píng)分系統(tǒng)[J].臨床與實(shí)驗(yàn)病理學(xué)雜志,2013,29(2):159-162.

[6] Chen S,Feng XY,Li YF,et al.The prognosis of gastric cancer patients with marginally elevated carcinoembryonic antigen (CEA) values after D2 radical gastrectomy[J].J Surg Oncol,2013,107(6):641-645.

[7] He CZ,Zhang KH,Li Q,et al.Combined use of AFP,CEA,CA125 and CAl9-9 improves the sensitivity for the diagnosis of gastric cancer[J].BMC Gastroenterol,2013,14(13):87.

[8] Kubo N,Ohira M,Sakurai K,et al.SPan-1 is a useful prognostic marker for patients with stage IV gastric cancer who underwent palliative gastrectomy:a retrospective multivariate study[J].World J Surg,2013,37(7):1681-1687.

[9] Shah RB,Chinnaiyan AM.The discovery of common recurrent transmembrane protease serine 2 (TMPRSS2)-erythroblastosis virus E26 transforming sequence (ETS) gene fusions in prostate cancer:significance and clinical implications[J].Adv Anat Pathol,2009,16(3):145-153.

[10] Vest D,Schalken JA,Muir G,et al.Transmembrane protease serine 2 in prostate cancer[J].BJU Int,2010,105(11):1490-1492.

[11] Gou S,Yu J,Wang C,et al.Three female familial cases of solid pseudopapillary tumors with a protease serine 1 gene mutation[J].Pancreas,2013,42(1):168-173.

[12] Moilanen M,Sorsa T,Stenman M,et al.Tumor-associated trypsinogen-2 (trypsinogen-2) activates procollagenases (MMP-1,-8,-13) and stromelysin-1 (MMP-3) and degrades type I collagen[J].Biochemistry,2003,42(18):5414-5420.

[13] Moilanen M,Sorsa T,Stenman M,et al.Tumor-associated trypsinogen-2 (trypsinogen-2) activates procollagenases (MMP-1,-8,-13) and stromelysin-1 (MMP-3) and degrades type I collagen[J].Biochemistry,2003,42(18):5414-5420.

[14] Williams SJ,Gotley DC,Antalis TM.Human trypsinogen in colorectal cancer[J].Int J Cancer,2001,93(1):67-73.

[15] Gao J,Zhu F,Lv S,et al.Identification of pancreatic juice proteins as biomarkers of pancreatic cancer[J].Oncol Rep,2010,23(6):1683-1692.

SignificanceandExpressionofPRSS2ProteinsAnalyzedbyTissueArrayinGastricCancerTissue

ZHAO Qiang,ZHANG Zhiwei,XIAO Juan,et al

(DepartmentofPathology,theFirstAffiliatedHospital,UniversityofSouthernChina,Hunan,Hengyang421001,China)

ObjectiveThe significance and expression of PRSS2 protein was analyzed by tissue array in gastric cancer tissue and provide valuable data for finding diagnosis related protein of gastric cancer.MethodsThe 8 cases including normal gastric mucosa,cancer side tissue and gastric cancer were respectively collected.The expression of PRSS2 proteins was checked by Western-blotting.Then,the expression of PRSS2 protein was detected in gastric tissue arrays including normal gastric mucosa,cancer side tissue and gastric cancer by immunohistochemistry staining.The clinical pathology significance of expression of PRSS2 protein was analyzed in gastric cancer tissue.ResultsThe expressions of PRSS2 protein was higher in gastric cancer tissue than that in normal gastric mucosa and cancer side tissue.It was higher in cancer side tissue than that in normal gastric mucosa.The expression positive rates of PRSS2 protein were 14.29% (5/34),26.92% (7/26) and 77.78% (63/81) in normal gastric mucosa,cancer side tissue and gastric cancer tissue,respectively.The expressiong of PRSS2 was 60.00% (3/5),70.59% (12/17) and 81.36% (48/59) in gastric well differentiated,middle differentiated and poorly differentiated adenocarcinoma,respectively.(P<0.01).There are negative relation between tissue differentiation level of gastric cancer and the expression positive rate of PRSS2(P<0.01).ConclusionThe expression positive rate of PRSS2 protein was higher in gastric cancer tissue than that in normal gastric mucosa and cancer side tissue and higher in cancer side tissue than in normal gastric mucosa tissue.The expression of PRSS2 protein was related with effluence and differentaiation level of gastric cancer tissue.

Gastric cancer; PRSS2 protein; protein expression; differentaiation level

10.15972/j.cnki.43-1509/r.2015.03.002

2014-10-09；

2015-02-05

湖南省自然科學(xué)衡陽聯(lián)合基金(12JJ9033)；湖南省自然科學(xué)基金(12JJ3102、13JJ3079)；湖南省科技廳項(xiàng)目(2013SK3118、2014SK3081)；湖南省高校創(chuàng)新平臺(tái)基金(12K094、13K082、13K083)；湖南省教育廳課題(11C1112、12C0340)；衡陽市科技局項(xiàng)目(2013KJ12、2013KJ28)；邵陽市科技局重點(diǎn)項(xiàng)目(2013SK13)；湖南省衛(wèi)生廳項(xiàng)目(B2013-048、B2014-163).

*通訊作者，E-mail:nhdxzzw@qq.com.

R735.2

A

(此文編輯：秦旭平)