熒光猝滅法測定魚肉中苯胺綠含量*

毛永強，劉艷，楊森，李娜

(遼寧工程技術(shù)大學(xué) 理學(xué)院，遼寧阜新，123000)

苯胺綠(aniline green，AG)別名堿性綠、鹽基塊綠、孔雀綠、維多利亞綠或中國綠，曾作為驅(qū)蟲劑和殺菌劑在水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)中預(yù)防與治療魚的水霉病、鰓霉病等。但苯胺綠易在魚體內(nèi)累積，可通過食物鏈進入人體，對人體具有致癌、致畸、致突變等毒副作用［1-2］，因此包括美國、日本、中國等在內(nèi)的許多國家都將其列為禁用藥物。目前苯胺綠含量的檢測方法主要有紫外光譜法［3］、熒光光譜法［4］、液相色譜法［5］、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法［6-7］、酶聯(lián)免疫吸附法［8］、化學(xué)傳感器［9］等，但這些方法過程復(fù)雜、操作耗時，難以普及推廣應(yīng)用，因此建立一種成本低廉、快速檢測苯胺綠含量的方法具有重要現(xiàn)實意義。

近些年，熒光分光光度法因具有操作簡便、選擇性好、靈敏度高等優(yōu)點而倍受關(guān)注，量子點(quantum dots，QDs)作為一種新型的熒光納米探針，彌補了傳統(tǒng)有機染料的一些缺陷，已經(jīng)廣泛應(yīng)用于致病菌［10-11］、生物毒素［12-13］、農(nóng)藥殘留［14-15］、獸藥殘留［16-17］和重金屬［18-19］等食品安全檢測領(lǐng)域。

本文以巰基乙酸為穩(wěn)定劑，采用水熱法制備CdTe量子點，基于苯胺綠對CdTe量子點熒光強度的猝滅作用，建立一種熒光分光光度法測定苯胺綠含量的新方法。該方法簡單快速、靈敏度高，已用于魚肉中苯胺綠含量的測定。同時對反應(yīng)機理進行初步探討，發(fā)現(xiàn)苯胺綠與CdTe量子點構(gòu)建熒光共振能量轉(zhuǎn)移體系所致。

1 實驗

1.1 儀器與試劑

F-4500型熒光分光光度計(日本日立公司);UV-3010型紫外-可見分光光度計(日本日立公司);AUX320型電子分析天平(日本島津公司);pHS-3C型pH計(上海精密科學(xué)儀器有限公司);DF-101S型集熱式恒溫加熱磁力攪拌器(山東鄄城華魯電熱儀器有限公司);KQ-50DB型數(shù)控超聲波清洗器(江蘇昆山市超聲儀器有限公司)，3-30K高速臺式冷凍離心機(德國西格瑪有限公司)。

苯胺綠(AG)，購于阿法埃莎化學(xué)有限公司;碲粉(Te)，天津市科密歐化學(xué)試劑開發(fā)中心;硼氫化鈉(NaBH4)，國藥集團化學(xué)試劑公司;巰基乙酸(TGA)，百靈威科技有限公司，氯化鎘(CdCl2·2.5H2O)，天津市科密歐化學(xué)試劑開發(fā)中心;所用其他試劑均為分析純;實驗用水為二次蒸餾水。

1.2 CdTe量子點的制備

采用水熱法制備巰基乙酸修飾的CdTe量子點［20］。準(zhǔn)確稱取43 mg碲粉和80 mg NaBH4于10 mL比色管中，加入5 mL蒸餾水溶解后，通氮除氧10 min，磁力攪拌下反應(yīng)至溶液澄清透明，生成NaHTe前驅(qū)體溶液。在250 mL三口燒瓶中加入0.285 g CdCl2，100 mL蒸餾水溶解后加入230 μL巰基乙酸溶液，用1 mol/L的NaOH溶液調(diào)節(jié)溶液pH值為11.0;在氮氣保護和劇烈攪拌條件下，加入新制備的NaHTe溶液，100℃加熱回流反應(yīng)2 h，得到實驗所需的CdTe量子點。CdTe量子點濃度以溶液中Cd2+濃度計算。

1.3 測定方法

在5 mL比色管中，依次加入1.0 mL CdTe量子點溶液、3.0 mL pH值6.0的Tris-HCl緩沖溶液和一定量的苯胺綠溶液，蒸餾水定容到刻度，混勻。室溫下放置5 min后，在激發(fā)波長330 nm、發(fā)射波長518 nm條件下(激發(fā)和發(fā)射狹縫寬度均為5 nm)，測定體系的熒光強度F。以不加苯胺綠的溶液為空白，測定其熒光強度F0，計算體系熒光猝滅強度△F=F0-F。

2 結(jié)果與討論

2.1 CdTe量子點和苯胺綠作用的熒光光譜圖

在5.0 mL比色管中分別加入相同量的水溶液和苯胺綠溶液，同時加入CdTe量子點溶液和Tris-HCl緩沖溶液，反應(yīng)一段時間后測定體系的熒光強度，考察CdTe量子點溶液加入苯胺綠溶液前后的熒光光譜性質(zhì)(如圖1與圖2所示)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，CdTe量子點的激發(fā)光譜寬而連續(xù)，最大熒光發(fā)射峰位于513 nm。當(dāng)CdTe量子點溶液中加入苯胺綠溶液后，CdTe量子點的熒光強度顯著降低;且隨著苯胺綠濃度的增加，CdTe量子點的熒光強度逐漸降低，但熒光發(fā)射峰位保持不變，這說明苯胺綠對CdTe量子點熒光強度具有很強的猝滅作用。

圖1 CdTe量子點的激發(fā)光譜(a)和發(fā)射光譜(b)Fig.1 Excitation spectrum(a)and emission spectrum(b)of CdTe QDs

圖2 不同濃度苯胺綠存在時CdTe量子點熒光光譜的變化Fig.2 Fluorescence emission spectrum of CdTe QDs in the presence AG with various concentrations，the concentration of AG from a to k:0.0，1.0，2.0，3.0，4.0，5.0，6.0，7.0，8.0，9.0，10.0(μmol/L);cCdTe=4.5 ×10-6mol/L;pH=6.0;t=5 min

2.2 反應(yīng)介質(zhì)及其pH值對體系熒光強度的影響

考察 Tris-HCl、Na2CO3-NaHCO3、檸檬酸-檸檬酸鈉等緩沖溶液對體系熒光猝滅強度的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在Tris-HCl緩沖溶液中，體系熒光猝滅強度最大且穩(wěn)定，因此實驗選擇Tris-HCl緩沖溶液調(diào)節(jié)體系的酸堿度。同時在5.0 mL比色管中加入CdTe量子點溶液和苯胺綠溶液，分別加入不同pH值Tris-HCl緩沖溶液，反應(yīng)一段時間后測定體系的熒光強度，考察緩沖溶液pH值對體系熒光猝滅強度的影響(如圖3所示)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，當(dāng)pH值在5.0～6.0內(nèi)，體系熒光猝滅強度隨pH值升高而迅速增加;但當(dāng)pH值大于6.0時，體系熒光猝滅強度逐漸降低。因此實驗選擇Tris-HCl緩沖溶液pH值為6.0。

圖3 pH值對體系熒光猝滅強度的影響Fig.3 Effect of pH value on fluorescence quenching intensity of CdTe QDs in the presence of AG cCdTe=4.5×10-6 mol/L;cAG=5.0 μmol/L;t=5 min

2.3 CdTe量子點濃度對體系熒光強度的影響

在5.0 mL比色管中分別加入不同濃度的CdTe量子點溶液，同時加入Tris-HCl緩沖溶液和苯胺綠溶液，反應(yīng)一段時間后測定體系的熒光強度，考察CdTe量子點濃度對體系熒光猝滅強度的影響(圖4)。

圖4 CdTe濃度對體系熒光猝滅強度的影響Fig.4 Effect of CdTe concentration on fluorescence quenching intensity of CdTe QDs in the presence of AG cAG=5.0 μmol/L;pH=6.0;t=5 min

結(jié)果發(fā)現(xiàn)，隨著CdTe量子點濃度的增加，體系熒光猝滅強度逐漸增大，當(dāng)增大到4.5×10-6mol/L時體系熒光猝滅強度達到最大值;繼續(xù)增加CdTe量子點濃度，體系熒光猝滅強度反而逐漸降低。因此實驗選擇CdTe量子點濃度為4.5×10-6mol/L。

2.4 反應(yīng)時間對體系熒光強度的影響

在5.0 mL比色管中分別加入CdTe量子點溶液、Tris-HCl緩沖溶液和苯胺綠溶液，反應(yīng)不同時間后測定體系的熒光強度，考察反應(yīng)時間對體系熒光猝滅強度的影響(如圖5所示)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，當(dāng)CdTe量子點溶液加入苯胺綠溶液后，體系熒光猝滅強度迅速增大，反應(yīng)5 min后趨于穩(wěn)定，且在25 min內(nèi)保持不變。因此實驗選擇反應(yīng)5 min后測定體系的熒光強度。

圖5 反應(yīng)時間對體系熒光猝滅強度的影響Fig.5 Effect of time on fluorescence quenching intensity of CdTe QDs in the presence of AG cCdTe=3.5×10-6mol/L;cAG=5.0 μmol/L;pH=6.0

2.5 工作曲線、相關(guān)系數(shù)與檢出限

在最佳實驗條件下，在5.0 mL比色管中分別加入不同濃度的苯胺綠溶液，同時加入CdTe量子點溶液和Tris-HCl緩沖溶液，反應(yīng)5 min后測定體系的熒光強度，以體系熒光猝滅強度(△F)對苯胺綠濃度(c)作圖(如圖6所示)。

圖6 標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.6 Standard curve

結(jié)果發(fā)現(xiàn)，苯胺綠濃度在1.0～10.0 μmol/L內(nèi)與體系熒光猝滅強度呈良好的線性關(guān)系，線性回歸方程為△F=13.488c+0.295 5，相關(guān)系數(shù)r為0.999 3，檢出限為0.018 μmol/L。同時對5.0 μmol/L 的苯胺綠溶液進行11次平行測定，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.2%。

2.6 干擾實驗

在最佳實驗條件下，當(dāng)苯胺綠濃度為1.0 μmol/L時，考察魚肉中常見物質(zhì)對苯胺綠含量測定的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在±5%相對誤差允許范圍內(nèi)，500倍的 K+、Na+、Mg2+、Ca2+、Zn2+、NO3-、Cl-、L-精氨酸、L-賴氨酸、L-脯氨酸、L-半胱氨酸、L-甘氨酸、葡萄糖、VC、VE，幾乎對測定結(jié)果不造成干擾，表明該方法具有較好的選擇性。

2.7 樣品測定與回收率實驗

鯉魚、鯽魚、鰱魚、青魚、草魚等購自當(dāng)?shù)厥袌?，?jīng)剖殺后去除頭、骨、內(nèi)臟，取肌肉部分切成小塊狀，用電動絞肉機打成漿狀。分別稱取搗碎的鯉魚、鯽魚、鰱魚、青魚、草魚等魚肉樣品10.0 g于50 mL離心管中，加入5 mL乙腈，超聲水浴提取5 min，渦旋振蕩提取3 min，8 000 r/min轉(zhuǎn)速離心10 min后，上清液轉(zhuǎn)移至10 mL容量瓶中;用5 mL乙腈將殘渣按上述操作再提取1次，合并上清液，用乙腈定容，搖勻備用。用5 mL乙腈活化中性氧化鋁萃取柱，氮氣吹干;準(zhǔn)確轉(zhuǎn)移提取液10 mL到中性氧化鋁萃取柱上，100 mL茄形瓶接收流出液;再用5 mL乙腈洗滌中性氧化鋁柱，收集全部流出液，于45℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至近干;殘渣用2 mL等體積比乙腈和5 mol/L乙酸銨混合溶液溶解，超聲振蕩清洗5 min，經(jīng)0.22 μm有機相濾膜過濾，濾液供熒光測定。

吸取一定量待測液，按照實驗方法對10份魚肉樣品進行檢測，為考察該方法的可靠性，同時對其進行加標(biāo)回收試驗(如表1所示)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，其中鯉魚、青魚2份樣品中檢出結(jié)晶紫，含量在3.7～4.2 nmol/kg，表明市售鮮魚存在濫用結(jié)晶紫的情況;同時魚肉樣品中苯胺綠的加標(biāo)回收率在97.6%～103.2%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于2.3%，表明該方法具有較好的準(zhǔn)確度和精密度。

表1 魚肉樣品中苯胺綠含量測定與回收率實驗(n=6)Table 1 Analytical results of AG in fish muscle samples and recovery test(n=6)

2.8 反應(yīng)機理探討

采用熒光光譜法和紫外可見吸收光譜法，考察CdTe量子點的熒光發(fā)射光譜和苯胺綠的紫外-可見吸收光譜(如圖7所示)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，CdTe量子點熒光發(fā)射峰位于513 nm處，而苯胺綠吸收光譜在616 nm處有最大吸收峰，且與CdTe量子點熒光發(fā)射光譜在450～600 nm內(nèi)有相當(dāng)程度的重疊;同時在pH值6.0條件下，巰基乙酸修飾的CdTe量子點表面帶負電荷，而苯胺綠是帶正電荷的三苯甲烷類陽離子染料，二者可通過靜電引力而結(jié)合，從而發(fā)生有效的熒光共振能量轉(zhuǎn)移(fluorescence resonance energy transfer，F(xiàn)RET)。因此當(dāng)苯胺綠加入 CdTe量子點溶液后，苯胺綠能夠吸收CdTe量子點的熒光發(fā)射能量，導(dǎo)致CdTe量子點熒光強度逐漸降低，從而建立一種測定苯胺綠含量的熒光分析法。

圖7 CdTe量子點的熒光發(fā)射光譜(a)和苯胺綠的紫外-可見吸收光譜(b)Fig.7 Emission spectrum(a)of CdTe QDs and UV-Vis absorption spectrum(b)of AG

3 結(jié)論

采用水熱法制備巰基乙酸修飾的CdTe量子點，基于苯胺綠對CdTe量子點熒光強度的猝滅效應(yīng)，建立一種熒光測定苯胺綠含量的新方法。該方法簡單快速、成本低廉、選擇性好、靈敏度高，能用于測定魚肉中苯胺綠含量，其回收率在97.6% ～103.2%，將為苯胺綠含量的快速檢測提供一種參考方法。

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