利用16S rRNA基因克隆文庫(kù)分析東北自然發(fā)酵酸菜中細(xì)菌多樣性

曹碧璇，胡濱，劉愛(ài)平

(四川農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，四川雅安，625014)

傳統(tǒng)發(fā)酵蔬菜主要是利用乳酸菌等微生物進(jìn)行發(fā)酵制作而成，目前是我國(guó)產(chǎn)量最高的蔬菜加工產(chǎn)品。東北酸菜以白菜為主要發(fā)酵原料，天然附著在白菜表面上的微生物利用白菜中的糖類等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)后產(chǎn)酸發(fā)酵，從而形成一種特色發(fā)酵蔬菜食品。酸菜發(fā)酵過(guò)程與細(xì)菌的生長(zhǎng)代謝、汁液與白菜的生物化學(xué)作用有極其緊密的聯(lián)系，在此過(guò)程中白菜細(xì)胞內(nèi)部的化學(xué)成分會(huì)發(fā)生一系列變化［1-2］，從而形成酸菜獨(dú)特的風(fēng)味，其味道咸酸，口感脆嫩，可以增進(jìn)食欲，幫助消化。

目前，我國(guó)對(duì)傳統(tǒng)發(fā)酵食品中微生物群落組成研究仍然以純培養(yǎng)技術(shù)為主，一般是利用純種分離技術(shù)篩選某一類群微生物(如乳酸菌)［3-9］。但是，隨著研究的不斷深入和技術(shù)的進(jìn)步，逐漸發(fā)現(xiàn)發(fā)酵液中微生物的種類實(shí)際數(shù)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)多于用培養(yǎng)法獲得的種類數(shù)，基于純培養(yǎng)的方法不能準(zhǔn)確反映復(fù)雜樣品中微生物多樣性的真實(shí)情況。近年來(lái)微生物分子生態(tài)學(xué)技術(shù)得到快速發(fā)展，利用這些技術(shù)可以避開(kāi)微生物培養(yǎng)環(huán)節(jié)，通過(guò)提取環(huán)境微生物基因組直接從DNA水平研究環(huán)境微生物的多樣性和群落結(jié)構(gòu)［10-12］。例如，武俊瑞等(2014)采用16S rRNA基因PCR-DGGE技術(shù)開(kāi)展了傳統(tǒng)東北酸菜發(fā)酵液中的微生物多樣性的研究［13］，揭示了傳統(tǒng)酸菜發(fā)酵液中微生物的多樣性，及優(yōu)勢(shì)菌群的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系。本研究在提取發(fā)酵液微生物DNA后，PCR擴(kuò)增16S rRNA基因全長(zhǎng)序列，通過(guò)建立該基因克隆文庫(kù)的方法，進(jìn)一步研究發(fā)酵液中細(xì)菌的種類組成，分析優(yōu)勢(shì)菌群結(jié)構(gòu)，以期準(zhǔn)確了解東北酸菜發(fā)酵液中的微生物資源和酸菜發(fā)酵機(jī)理，為今后改進(jìn)發(fā)酵工藝和發(fā)展相應(yīng)微生態(tài)制劑奠定一定的基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試劑與藥品

細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒、快捷型DNA純化回收試劑盒、2×Power Taq PCR MasterMix、DH5α 感受態(tài)細(xì)胞(Bioteke);Zero Background TA TOPO Cloning Kit(Clone Smarter);瓊脂粉(Amresco);酵母提取物、胰蛋白胨(Oxoid);DL2000 DNA Marker、溴化乙錠、λDNA-Hind Ⅲ Marker(TaKaRa);Tris-base、EDTANa2、氨芐青霉素等為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

Universal HoodII凝膠成像儀，Bio-RAD;臺(tái)式離心機(jī)1-14，Sigma;SW-CJ-2FD凈化工作臺(tái)，蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司;MLS-3780高壓滅菌鍋，SANYO;THZ-98AB恒溫振蕩培養(yǎng)箱，上海一恒科學(xué)儀器有限公司;μQuant酶標(biāo)儀，BioTek;ST16R高速冷凍離心機(jī)，Thermo Scientific;DYY-10水平電泳儀，北京六一儀器廠;Mastercycler nexus gradient eco PCR擴(kuò)增儀，Eppendorf;ExF32086V-ULTS超低溫冰箱，Thermo Scientific。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 樣品的采集及預(yù)處理

樣品采集:樣品釆自遼寧地區(qū)農(nóng)家利用傳統(tǒng)方法制作的自然發(fā)酵成熟的酸菜發(fā)酵液5份，發(fā)酵時(shí)間均不低于50 d。

菌體富集:酸菜發(fā)酵液樣品用滅菌濾紙過(guò)濾以除去酸菜汁中的雜質(zhì)。取30 mL濾液，4℃ 6 800 r/min離心10 min，棄上清液，沉淀加入25 mL的PBS緩沖液，在漩渦混勻器上振蕩2 min，6 800 r/min離心10 min，棄上清液，加少量ddH2O洗滌，將沉淀轉(zhuǎn)移到1 mL的無(wú)菌離心管中，4℃，14 000 r/min離心10 min，棄上清液，菌體于-20℃保存。

1.3.2 樣品細(xì)菌基因組DNA的快速提取

采用細(xì)菌基因組提取試劑盒提取(Bioteke)，具體操作參照說(shuō)明書。

1.3.3 構(gòu)建16S rRNA基因克隆文庫(kù)

以提取的細(xì)菌基因組DNA作為模板，使用細(xì)菌通用引物27F(5＇-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3＇)和 1492R(5＇-GGTTACCTTGTTACGACTT-3＇)對(duì)細(xì)菌16S rRNA基因全長(zhǎng)進(jìn)行擴(kuò)增［14］。PCR反應(yīng)體系(50 μL):PCR MasterMix 25 μL，引物 27F和1492R 各1 μL，模板 DNA 1μL，加去離子水補(bǔ)齊 50 μL。熱循環(huán)反應(yīng)條件:(1)95℃預(yù)熱5 min;(2)95℃變性1 min，57 ℃退火1 min，72 ℃延伸 1 min，30 個(gè)循環(huán);(3)72℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物采用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

PCR產(chǎn)物經(jīng)純化后，與Zero Background TA TOPO Cloning Kit試劑盒內(nèi)pCloneEZ-TOPO載體連接，重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到E.coli DH5α中，然后在含50 μg/mL的氨芐青霉素LB固體瓊脂培養(yǎng)基上37℃培養(yǎng)12～16 h。挑取白色單菌落于2 mL含50 μg/mL氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中37℃搖床振蕩培養(yǎng)12 h，吸取1 μL菌液作為模板，用載體通用引物對(duì)其進(jìn)行PCR擴(kuò)增，采用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)正確的克隆子。

1.3.4 16S rRNA基因序列分析

將含有正確克隆子的菌液送中美泰和公司測(cè)序。手動(dòng)刪除所得序列中的載體序列，然后利用GenBank的BLAST-n程序進(jìn)行相似性比對(duì)，尋找與之親緣關(guān)系最近的可培養(yǎng)菌種的序列。利用DNAMAN軟件進(jìn)行多序列比對(duì)，相似性≥97%視為同一操作分類單元(operational taxonomicunit，OTU)［15］。使用 MEGA4.0軟件中的程序并采用Neighbor-Joining法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，并使用Bootstrap(1 000次)對(duì)進(jìn)化樹(shù)進(jìn)行驗(yàn)證。

2 結(jié)果

2.1 發(fā)酵液細(xì)菌總DNA的提取和16S rRNA基因的PCR擴(kuò)增

采用細(xì)菌基因組提取試劑盒(Bioteke)提取出樣品中的總DNA。選用通用引物27F和1492R對(duì)發(fā)酵液16S rRNA基因的全長(zhǎng)序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物后經(jīng)過(guò)1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，結(jié)果見(jiàn)圖1。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明此引物對(duì)可以較完整地從樣品微生物基因組DNA中擴(kuò)增出清晰單一，無(wú)非特異性擴(kuò)增的片段，長(zhǎng)度約為1 500 bp，符合細(xì)菌16S rRNA基因片段大小。

圖1 酸菜樣品16S rRNA基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳圖譜Fig.1 Agarose gel electrophoresis of 16S rRNA gene PCR products from Suan-Cai sample

2.2 發(fā)酵液16S rRNA基因克隆文庫(kù)分析

將克隆文庫(kù)中菌液PCR鑒定結(jié)果為陽(yáng)性的菌液測(cè)序，去除嵌合體后共98個(gè)克隆子為正確克隆子。測(cè)得的16S rRNA基因全長(zhǎng)序在NCBI(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/)網(wǎng)站上的BLAST-n進(jìn)行比對(duì)。將序列相似性≥97%的序列視作一個(gè)OTU，低于97% 的則列為另一個(gè)OTU，共劃分為9個(gè)OTU(表1)。共有63個(gè)(64.29%)克隆子屬于乳酸桿菌屬(Lactobacillus)，占絕對(duì)優(yōu)勢(shì)，其中 OTU1為 Lac.coryniformis，61個(gè)克隆子;OTU5和 OTU6分別為L(zhǎng)ac.malefermentans和Lac.plantarum，各一個(gè)克隆子(圖2)。片球菌屬(Pediococcus)共22個(gè)克隆子(OTU2)，占22.45%，鑒定為 P.parvulus。OTU3為枸櫞酸桿菌屬(Citrobacter)，共 8個(gè)克隆子，占8.16%，均為 Citr.murliniae。OTU4為梭菌屬(Clostridium)為 2個(gè)克隆子，占 2.04%，鑒定為Clos.Intestinale。OTU7，8和9均包含一個(gè)克隆子，各占1.02%，分別鑒定為串珠菌屬(Leuconostoc)的Leuc.citreum，無(wú)色桿菌屬(Achromobacter)的A.spanius和腸桿菌屬(Enterobacter)的E.cloacae。

表1 所得OTU及與其親緣關(guān)系最近的已知菌種Table 1 OTUs from 16S rRNA gene library and their phylogenetic analysis

圖2 酸菜發(fā)酵液中16S rRNA基因文庫(kù)菌株分布Fig.2 Distribution of microbial genus based on 16S rRNA library of Suan-Cai

2.3 系統(tǒng)發(fā)育分析

選取本研究中所占比例較大的OTU1和OTU2的代表序列和其他OTU的所有序列及具有最高相似性的可培養(yǎng)菌種的序列構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)(圖3)。所得序列分成兩個(gè)門類，分別為Firmicute和Proteobacteria，其中大部分為Firmicute相關(guān)的序列(89.8%)。Firmicute類群含有Lactobacillaceae、Leuconostocaceae和Clostridiaceae的序列。其中，Lactobacillaceae的大部分序列屬于 Lactobacillus，bootstrap支持率為100%，其次為Pediococcus。檢測(cè)到的Lactobacillus序列分別與Lact.coryniformis subsp.torque、Lact.malefermentans和Lact.plantarum的序列聚類在一起，序列數(shù)所占比例最大(62.24%)的OTU1代表序列F2和F3與Lact.coryniformis subsp.torque序列聚為一支，而 OTU2的代表序列 F30(22.45%)與P.parvulus聚類在一起。序列F11、L25和Clostridium intestinale的序列聚類在一起，遠(yuǎn)離其他分支，它們與Lactobacillaceae和Leuconostocaceae的序列親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。另外，在 Firmicute類群中，一個(gè)序列與Leuc.citreum NR 074694密切相關(guān)，相似性達(dá)到100%。在Proteobacteria類群中，本研究所得序列分布在兩個(gè)分支中，分別由Betaproteobacteria和Gammaproteobacteria序列構(gòu)成。Betaproteobacteria亞類中只含有一個(gè)與A.spanius密切相關(guān)的序列。9個(gè)序列與Gammaproteobacteria的Enterobacteriaceae菌株的序列聚類在一起，bootstrap支持率為100%。然而，除了序列R5和F21與Enterobacter ludwigii和Citro.murliniae聚為一支外，其余7個(gè)序列單獨(dú)聚為兩類。

3 討論

本研究采用構(gòu)建克隆文庫(kù)的方法，對(duì)克隆子的16S rRNA基因全長(zhǎng)序列進(jìn)行測(cè)序，在此基礎(chǔ)上鑒定酸菜自然發(fā)酵液微生物群落組成。從總體來(lái)看，東北酸菜自然發(fā)酵液中，乳酸菌占絕對(duì)優(yōu)勢(shì)，這與以往以大白菜為原料的東北酸菜的相關(guān)研究，以及其他蔬菜為原料腌制酸菜的研究結(jié)果相一致［7，11-13］。楊洪巖等以黑龍江省綏化地區(qū)自然發(fā)酵白菜為對(duì)象，開(kāi)展了東北酸菜發(fā)酵過(guò)程中微生物組成動(dòng)態(tài)的研究，在發(fā)酵液中檢測(cè)到Acinetobacter、Pseudomonas、Klebsiella、Citrobacter、Leuconostoc、Lactobacillus 等幾個(gè)屬和 Betaproteobacteria;而且發(fā)酵30 d后，所檢測(cè)到的細(xì)菌全部為 Lactobacillus［16］。武俊瑞等利用 PCR-DGGE 技術(shù)在東北酸菜發(fā)酵液中分離和鑒定出Lactobacillus屬的9個(gè)種［13］。Miyamoto等在哈爾濱地區(qū)酸菜液中分離到乳酸菌的新種(Lact.harbinensisDSM 12745)［17］。本研究選用的發(fā)酵液是成熟發(fā)酵液(50 d以上)，在發(fā)酵液中除檢測(cè)到乳酸菌屬的3個(gè)種外，還檢測(cè)到Pediococcus parvulus、Citrobacter murliniae、Clostridium intestinale、Leuconostoc citreum、Achromobacter spanius和 Enterobacter cloacae。

圖3 基于16S rRNA基因序列構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)Fig.3 Phylogenetic tree based on the complete 16S rRNA gene sequences

美國(guó)的學(xué)者們利用形態(tài)學(xué)和生理生化反應(yīng)鑒定出以圓白菜為原料的酸菜初期發(fā)酵液中包含Leuc.mesenteroides、Lact.brevis、P.pentosaceus和 Lact.plantarum等，而在發(fā)酵后期則主要為L(zhǎng)act.Plantarum［18］。這些屬在本研究中也均被檢測(cè)到，只是所屬的種不同。田偉等(2012)通過(guò)構(gòu)建16S rRNA基因文庫(kù)，研究了四川泡菜發(fā)酵液中細(xì)菌群落組成，發(fā)現(xiàn)所有的克隆子均屬于乳酸菌，主要分布于Lactobacillus和Pediococcus兩個(gè)屬，且Lactobacillus屬占有絕對(duì)的數(shù)量?jī)?yōu)勢(shì)［19］。在本研究中，Lactobacillus和Pediococcus兩個(gè)屬的克隆子分別占64.29%和22.45%，也占絕對(duì)優(yōu)勢(shì)，與以往的研究基本一致，但本研究中的優(yōu)勢(shì)種為L(zhǎng)act.coryniformis、P.parvulus 和 C.murliniae，而 Lact.plantarum雖然也被檢測(cè)到，但克隆子數(shù)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于這幾個(gè)種，這與以往的采用純培養(yǎng)和PCR-DGGE技術(shù)的一些研究結(jié)果有些不同［11-13，20］。其主要原因可能是選用的研究方法和選取的實(shí)驗(yàn)材料不同所致。在酸菜生產(chǎn)過(guò)程，微生物多樣性和群落組成結(jié)構(gòu)一般會(huì)隨著發(fā)酵的進(jìn)程而發(fā)生變化［16，21］，一些真菌在其中也會(huì)起一定的作用［22］，在后續(xù)的研究中應(yīng)該不斷補(bǔ)充和完善，以便更全面地了解酸菜的發(fā)酵機(jī)理。

另外，本研究采用16S rRNA基因的全長(zhǎng)序列構(gòu)建克隆文庫(kù)，序列較長(zhǎng)(1.5 kb)，測(cè)序后進(jìn)行序列比對(duì)鑒定物種時(shí)準(zhǔn)確性較高，可以較真實(shí)地反映實(shí)驗(yàn)樣品的微生物群落結(jié)構(gòu)組成，而且還能提供很多傳統(tǒng)純培養(yǎng)方法所不能提供的信息。準(zhǔn)確掌握發(fā)酵液微生物組成結(jié)構(gòu)對(duì)于深入了解酸菜發(fā)酵機(jī)理、指導(dǎo)生產(chǎn)以及篩選高效酸菜發(fā)酵菌劑都有重要意義。

4 結(jié)論

本研究以傳統(tǒng)東北酸菜為對(duì)象，采用構(gòu)建16S rRNA基因克隆文庫(kù)的方法研究了酸菜成熟發(fā)酵液中細(xì)菌的多樣性和群落的組成結(jié)構(gòu)。酸菜發(fā)酵液中含有的主要微生物種類為L(zhǎng)act.coryniformis、P.parvulus、Citr.murliniae、Clos.intestinale、Lact.malefermentans、Lact.plantarum、Leuc.citreum、A.spanius和 E.cloacae。其中，乳酸桿菌屬(Lactobacillus)、片球菌屬(Pediococcuss)和枸櫞酸桿菌屬(Citrobacter)為優(yōu)勢(shì)菌，分別占64.29%，22.45%和8.16%。

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