黃芩中黃芩苷提取精制工藝研究

鄭艷紅，常艷芬，周玉枝，秦雪梅，杜冠華(山西大學(xué)中醫(yī)藥現(xiàn)代研究中心，太原 00006;山西大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院;中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院藥物研究所“藥物靶點(diǎn)研究與新藥篩選”北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室;通訊作者，E-mail:zhouyuzhi@sxu．edu．cn)

黃芩為唇形科植物(Scutellaria baicalensis Georgi)的干燥根，其性寒味苦，具有清熱燥濕，瀉火解毒、止血、安胎的功效［1］，主要產(chǎn)于我國(guó)東北、河北、山西、河南、陜西、內(nèi)蒙古等地。其成分黃芩苷具有抑菌抗炎、清熱解毒、螯合金屬離子、鎮(zhèn)靜、降壓、保護(hù)神經(jīng)、抗變態(tài)反應(yīng)和清除超聲陰離子等藥理作用［2］，是黃芩的主要活性成分之一，也是黃芩和黃芩制劑的主要質(zhì)量控制指標(biāo)成分。目前，市售的黃芩苷產(chǎn)品有 30%，50%，70%，75%，80%，85%，95%以及98%等不同規(guī)格，可用于獸藥、化妝品、養(yǎng)生膳食原料和藥品等不同領(lǐng)域。在藥用領(lǐng)域根據(jù)黃芩苷的含量又可把藥物制成不同劑型，黃芩苷含量大于70%可制成片劑，大于90%可制成膠囊，大于92%可制成沖劑，大于94%可制成口服液，大于96%可制成針劑［3，4］。因此根據(jù)不同劑型的要求，對(duì)不同規(guī)格的黃芩苷產(chǎn)品的制備工藝進(jìn)行研究很有現(xiàn)實(shí)意義。

目前，國(guó)內(nèi)對(duì)黃芩苷制備工藝的研究有較多報(bào)道，其提取方法主要有溫浸法、煎煮法、微波法、超濾法等［5－8］，常用的精制方法有沉淀分離、高速逆流分離、大孔樹脂分離等［9－10］，傳統(tǒng)方法在提取有效成分方面存在著損失大、周期長(zhǎng)、工序多、提取率不高、環(huán)境污染嚴(yán)重等缺點(diǎn)，因此，有必要探究一種工藝簡(jiǎn)單、生產(chǎn)周期短、環(huán)境友好的制備方法。本實(shí)驗(yàn)采用一步酸沉法，以產(chǎn)物中黃芩苷純度和產(chǎn)率為考察指標(biāo)，對(duì)影響黃芩苷制備的影響因素(提取方法、提取溶劑、提取溫度、料液比、提取次數(shù)、酸沉pH、酸沉保溫時(shí)間、靜置時(shí)間及洗酸次數(shù))進(jìn)行了全面探討，得出一步酸沉制備黃芩苷的優(yōu)化工藝條件，并首次對(duì)酸沉后的處理如洗酸次數(shù)等作了考察，且對(duì)優(yōu)選工藝的穩(wěn)定性進(jìn)行了考察，可為工業(yè)化大規(guī)模提取生產(chǎn)黃芩苷提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1．1 實(shí)驗(yàn)材料

1．1．1 實(shí)驗(yàn)藥品及試劑 黃芩藥材(購自山西陵川縣六泉中藥材合作社，經(jīng)山西大學(xué)中醫(yī)藥現(xiàn)代研究中心主任秦雪梅教授鑒定為唇形科植物黃芩Scutellaria baicalensis Georgi的干燥根);黃芩苷(批號(hào)為H0139－20140211，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%)，購自中國(guó)藥品生物制品檢定所;色譜甲醇(Fisher chemistry)，無水乙醇，磷酸等其他試劑均為分析純，水為去離子水。

1．1．2 儀器與設(shè)備 高效液相色譜儀Waters e2695;Thermo BDS Hypersil C18(5 μm，4．6 mm ×250 mm)高效液相色譜柱;BP211D賽多利斯電子天平;RE52－99旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠);超聲波清洗器HS2060A;中藥萬能粉碎機(jī)(天津市泰斯特儀器有限公司);電熱恒溫水浴鍋(上海洪紀(jì)儀器設(shè)備有限公司);SHB－ⅢS循環(huán)水式多用真空泵(鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司);烘箱(北京市永光明醫(yī)療儀器實(shí)驗(yàn)儀器廠);TDZ5型低速離心機(jī)(長(zhǎng)沙平凡有限公司)。

1．2 實(shí)驗(yàn)方法

1．2．1 提取方法 取黃芩藥材，粉碎，過40目篩，取10 g黃芩粉末，適量溶劑提取1－3次，濾過，合并濾液，定容至250 ml容量瓶，冷藏備用。

1．2．2 酸沉方法 取黃芩提取液，用鹽酸調(diào)節(jié)pH值至1．0－2．0，保溫，靜置，濾過，沉淀依次用適量水及不同濃度的乙醇洗至pH值至中性，揮發(fā)盡乙醇，60℃干燥后，即為黃芩苷產(chǎn)品。

1．2．3 分析方法 黃芩苷在紫外區(qū)280 nm處有穩(wěn)定的特征吸收峰，本文采用高效液相色譜法分析產(chǎn)品中黃芩苷的含量。①色譜條件。色譜柱:Thermo BDS Hypersil C18柱(5 μm，4．6 mm ×250 mm);流動(dòng)相:甲醇－水 －磷酸 (47∶53∶0．2);檢測(cè)波長(zhǎng)280 nm柱溫為室溫;流速 1 ml/min;進(jìn)樣量 10 μl。②標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制。準(zhǔn)確稱取黃芩苷對(duì)照品9．9 mg，置于25 ml容量瓶中，加入甲醇超聲溶解，定容。搖勻后準(zhǔn)確吸取1，2，3，5，6 ml分置于10 ml容量瓶中，加入甲醇稀釋至刻度，搖勻。在上述色譜條件下測(cè)量，以黃芩苷濃度對(duì)峰面積作標(biāo)準(zhǔn)曲線(見圖1)，并用最小二乘法線性擬合，求得線性回歸方程為:y=36 514x－215 079(R2=0．999 8)，表明黃芩苷在39．6－237．6 mg/ml濃度范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系。③黃芩苷含量的測(cè)定。準(zhǔn)確稱取黃芩苷粗粉約10 mg于25 ml容量瓶中，加入甲醇超聲溶解，定容。在上述色譜條件下分析，由回歸方程求得產(chǎn)物中黃芩苷含量。黃芩苷含量=產(chǎn)物中黃芩苷質(zhì)量/產(chǎn)物質(zhì)量×100%，提取物出膏率=提取物質(zhì)量/原料黃芩質(zhì)量×100%，黃芩苷收率=產(chǎn)物中黃芩苷質(zhì)量/原料黃芩質(zhì)量×100%。

圖1 黃芩苷的標(biāo)準(zhǔn)曲線Figure 1 The standard curve of baicalin

1．2．4 單因素試驗(yàn) 以提取液中黃芩苷含量及出膏率為指標(biāo)，在提取方法實(shí)驗(yàn)中分別考察不同提取方法、提取溶劑、提取溫度、料液比和提取次數(shù)對(duì)黃芩苷提取效果的影響;取上述黃芩提取液進(jìn)行酸沉試驗(yàn)，以產(chǎn)物中黃芩苷含量及收率為指標(biāo)，在酸沉方法實(shí)驗(yàn)中分別考察酸沉pH值、保溫時(shí)間、靜置時(shí)間和洗酸次數(shù)對(duì)黃芩苷純化工藝的影響，所得產(chǎn)物在60℃下烘干，稱重。按1．2．3所述方法測(cè)定產(chǎn)物中黃芩苷含量及收率。

2 結(jié)果

2．1 提取方法工藝研究

2．1．1 不同提取方法的提取效果 回流提取法、超聲提取法、微波提取法的出膏率差異不大，均保持在50%左右，其中回流提取法最高，且其黃芩苷含量也最高，超聲提取法的黃芩苷含量及出膏率均最低，微波提取法的提取效果略次于回流提取法(見圖2)。綜合考慮黃芩苷含量、出膏率及工業(yè)化應(yīng)用，選擇回流提取法作為后續(xù)研究方法。

圖2 提取方法對(duì)黃芩苷提取的影響Figure 2 Effect of extraction methods on extraction of baicalin

2．1．2 不同提取溶劑的提取效果 采用回流提取法，取10 g黃芩粉末，分別用10倍量水及60%乙醇提取2次，每次1．5 h，抽濾，合并兩次濾液，定容至250 ml容量瓶，測(cè)黃芩苷含量及出膏率，結(jié)果見圖3。由圖3可以看出，當(dāng)提取溶劑為乙醇時(shí)，黃芩苷含量與出膏率均略高于水作提取溶劑時(shí)的兩項(xiàng)指標(biāo)，但考慮到工業(yè)成本問題，選取水為提取溶劑。

圖3 提取溶劑對(duì)黃芩苷提取的影響Figure 3 Effect of extraction solvent on extraction of baicalin

2．1．3 不同提取溫度的提取效果 改變提取溫度，其他條件如2．1．2中方法，結(jié)果顯示，隨著提取溫度的升高，黃芩中有效成分溶出率逐漸增加，黃芩苷含量也隨之增加，但當(dāng)溫度超過80℃時(shí)，藥材中其他雜質(zhì)也隨之溶出，黃芩苷含量下降(見表1)，因此選取80℃為最佳提取溫度。

2．1．4 不同料液比的提取效果 固定黃芩質(zhì)量，改變兩次提取所用溶劑量，其他條件如2．1．2中方法，結(jié)果顯示，當(dāng)料液比為10倍時(shí)，黃芩苷含量及出膏率均最高，繼續(xù)增加料液比時(shí)，出膏率不再增加，黃芩苷含量由于雜質(zhì)的溶解稍有所下降(見表2)，故物料比為10倍較好，即兩次提取用10倍量水。

表1 提取溫度對(duì)黃芩苷提取的影響Table 1 Effect of extraction temperatureon on extraction of baicalin

表2 料液比對(duì)黃芩苷提取的影響Table 2 Effect of solid-liquid ratio on extraction of baicalin

2．1．5 不同提取次數(shù)的提取效果 改變提取次數(shù)，其他條件如2．1．2中方法，考查提取次數(shù)對(duì)提取效果的影響。結(jié)果顯示，隨著提取次數(shù)的增加，黃芩苷含量及出膏率均不斷增加，但提取3次相比于2次增加效果不再明顯(見表3)，綜合考慮出膏率和含量以及經(jīng)濟(jì)成本各方面因素，以選擇提取2次為宜。

表3 不同提取次數(shù)對(duì)黃芩苷提取的影響Table 3 Effect of extraction times on extraction of baicalin

綜上，確定最佳提取工藝為10倍量水回流提取2次，每次1．5 h，提取溫度為80℃。

2．2 酸沉方法工藝研究

2．2．1 不同酸沉pH值對(duì)酸沉效果的影響 取黃芩提取液，分別用鹽酸調(diào)節(jié) pH 值至 1．0，1．5，2．0，80℃保溫，保溫60 min，然后常溫靜置12 h，離心分離沉淀，沉淀依次用水及50%，95%乙醇洗至pH值為中性，揮盡乙醇，60℃烘箱干燥，即得。由表4可知，當(dāng)酸沉pH為1．0時(shí)，產(chǎn)品中黃芩苷含量最高，pH為1．5時(shí)，黃芩苷收率較高，但僅略高于pH為1．0時(shí)的收率，最終選擇在 pH值為1．0時(shí)進(jìn)行酸沉。

2．2．2 酸沉保溫時(shí)間對(duì)酸沉效果的影響 改變保溫時(shí)間，其他實(shí)驗(yàn)條件同 2．2．1，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表5。隨著保溫時(shí)間的延長(zhǎng)，產(chǎn)品中黃芩苷含量及收率均增加，保溫時(shí)間為60 min時(shí)，黃芩苷含量及收率均達(dá)到最高值，故本實(shí)驗(yàn)取酸沉保溫時(shí)間為60 min。

表4 不同pH值酸沉結(jié)果Table 4 Effect of different acid-precipitation pH on the contents of baicalin and yield rate

表5 不同保溫時(shí)間下酸沉結(jié)果Table 5 Effect of different incubation temperature on the contents of baicalin and yield rate

2．2．3 不同靜置時(shí)間對(duì)酸沉效果的影響 改變保溫酸沉后靜置時(shí)間，其他實(shí)驗(yàn)條件同2．2．1，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表6。隨著靜置時(shí)間增加，黃芩苷純度和收率均增加，當(dāng)靜置時(shí)間超過12 h時(shí)，純度開始下降。靜置時(shí)間繼續(xù)增加雖能增加一點(diǎn)收率，但產(chǎn)品的純度有所下降。故本實(shí)驗(yàn)取酸沉靜置時(shí)間為12 h。

表6 不同靜置時(shí)間下酸沉結(jié)果Table 6 Effect of different holding time on the contents of baicalin and yield rate

2．2．4 不同洗酸次數(shù)對(duì)酸沉效果的影響 改變酸沉后洗滌次數(shù)，其他實(shí)驗(yàn)條件同2．2．1，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表7。隨著洗滌次數(shù)的增加，產(chǎn)品中黃芩苷含量增加，收率稍有下降，洗滌5次和2次與洗滌1次酸沉效果并無明顯提高，綜合考慮相比酸沉效果及工業(yè)成本問題，選擇酸沉后洗滌1次作為后處理方式。

綜上，最終確定酸沉條件為水提液加6 mol/L鹽酸調(diào)節(jié)pH至1．0，80℃保溫60 min，然后常溫靜置12 h，離心，沉淀依次用水及50%，95%乙醇各洗滌1次，洗至pH值至中性，揮盡乙醇，60℃烘干，即得。

表7 不同洗酸次數(shù)下酸沉結(jié)果Table 7 Effect of different wash acid times on the contents of baicalin and yield rate

2．3 優(yōu)化工藝驗(yàn)證試驗(yàn)

由上述試驗(yàn)得到最優(yōu)工藝條件。為確定優(yōu)化工藝的穩(wěn)定性，即稱取黃芩藥材粉末10 g，用100 ml水在80℃下回流提取2次，濾過，合并兩次提取液，加6 mol/L鹽酸調(diào)節(jié) pH至1．0，80℃下保溫60 min，常溫靜置12 h，離心，沉淀依次用水及50%，95%乙醇各洗滌1次，洗至pH值為中性，揮盡乙醇，60℃烘干，平行進(jìn)行三次實(shí)驗(yàn)。結(jié)果顯示，優(yōu)選的水提酸沉法制備黃芩苷的工藝穩(wěn)定，重現(xiàn)性好，適用于工業(yè)生產(chǎn)(見表8)。

表8 優(yōu)化工藝驗(yàn)證實(shí)驗(yàn) (%)Table 8 Results of verification test for the optimal process(%)

3 討論

通過單因素試驗(yàn)，得到了提取精制黃芩苷的優(yōu)化工藝:10倍量水80℃回流提取2次，濾過，合并兩次提取液，加6 mol/L鹽酸調(diào)節(jié)pH至1．0，80℃下保溫60 min，常溫靜置12 h，離心，沉淀依次用水及50%，95%乙醇各洗滌1次，洗至pH值為中性，揮盡乙醇，60℃烘干，即得。與其他方法相比，本方法具有得率高，快速，操作成本低，并且對(duì)環(huán)境無危害等優(yōu)點(diǎn)。該工藝穩(wěn)定，重現(xiàn)性好，適用于工業(yè)生產(chǎn)。

黃芩苷分子結(jié)構(gòu)中C2上羧基常成鹽形式存在，加酸后黃芩苷分子就游離出來，但這種反應(yīng)必須在較高溫度較長(zhǎng)時(shí)間條件下方可使反應(yīng)完全，因而控制黃芩提取液在加酸后的溫度條件和反應(yīng)時(shí)間十分重要，黃芩苷在高溫下又極不穩(wěn)定，故酸沉保溫溫度不宜過高。酸沉后的沉淀物分別用水和不同濃度乙醇洗至中性，水洗的目的是洗出酸處理過程中產(chǎn)生的無機(jī)鹽及一些水溶性雜質(zhì)，繼用乙醇洗至pH為中性，醇洗可以洗去一部分醇溶性的雜質(zhì)。

該優(yōu)化工藝所得黃芩苷純度可達(dá)80%左右，有廣泛市場(chǎng)應(yīng)用，更高純度的黃芩苷產(chǎn)品有待結(jié)合其他純化手段進(jìn)一步純化，我們將在下一步繼續(xù)探索。

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