熒光共振能量轉移技術陽性參照質粒的構建及應用

金艷燕，鄧 君，金良韻，肖忠新，徐志卿，張進祿，趙君朋，薛 冰(首都醫(yī)科大學醫(yī)學實驗與測試中心激光掃描共聚焦顯微鏡室，北京 00069;首都醫(yī)科大學神經(jīng)生物學系;通訊作者，E-mail:xuebing_bj@6．com)

熒光共振能量轉移(fluorescence resonance energy transfer，F(xiàn)RET)技術是目前用于研究生物大分子相互作用的一項較新的技術。在國內(nèi)被廣泛的用于研究細胞內(nèi)生物大分子相互作用、酶的活性測定、核酸檢測、離子濃度和細胞膜電位測定等方面［1-4］。隨著生命科學研究的深入和細化，越來越多的研究認為蛋白質-蛋白質間的相互作用是生命現(xiàn)象發(fā)生機制的關鍵因素。一些傳統(tǒng)的研究方法存在缺陷:如酵母雙雜交、磷酸化抗體、免疫熒光、放射性標記等方法應用的前提都是要破碎細胞或對細胞造成損傷，無法做到在活細胞生理條件下實時的對細胞內(nèi)蛋白質-蛋白質間相互作用進行動態(tài)研究［5］。而FRET則更適用于活細胞和固定細胞的各類分子，靈敏度和分辨率高，并能清晰成像，最直觀地提供蛋白質相互作用的定位和定量信息［6］。隨著綠色熒光蛋白(GFP)應用技術的發(fā)展，GFP近年來發(fā)展出了多種突變體，通過引入各種點突變使發(fā)光基團的激發(fā)光譜和發(fā)射光譜均發(fā)生變化而發(fā)出不同顏色的熒光，有藍色熒光蛋白(BFP)、黃色熒光蛋白(YFP)、青色熒光蛋白(CFP)等。這些突變體使GFP應用于FRET成為可能，為FRET技術用于活體檢測蛋白質相互作用提供了良好的支持［5，6］。利用基因工程的方法，用不同顏色的熒光標記目的蛋白，通過熒光蛋白發(fā)生FRET現(xiàn)象，從而間接地觀察目的蛋白間是否發(fā)生相互作用，這種相互作用研究是在無損細胞的狀態(tài)下完成，并且可以實時動態(tài)地觀察，更加符合細胞正常的生理狀態(tài)。正因為FRET研究在生命科學研究中的優(yōu)勢，所以建立穩(wěn)定的FRET技術應用平臺、深入探索FRET技術應用的條件和應用范圍很必要的。本研究擬利用已有的兩種黃色熒光蛋白(YFP)和青色熒光蛋白(CFP)真核表達載體，通過基因工程的方法，將兩種基因相連，通過細胞轉染使其表達青色熒光蛋白和黃色熒光蛋白相連的融合蛋白，并進行了FRET效率的測定實驗，進一步觀察融合蛋白是否符合FRET現(xiàn)象發(fā)生的條件，能否用于FRET研究并作為陽性參照物。

1 材料與方法

1．1 主要試劑

E．coli DH5α感受態(tài)細胞(中國天根公司);RNA提取試劑盒和轉染試劑盒(德國Qiagen公司);膠回收及純化試劑盒和質粒提取及純化試劑盒(美國Omega公司);pAmCyan1-N1載體、pZsYellow1-N1(美國Clonetech公司);載體限制性內(nèi)切酶、DNA聚合酶(日本 Takara公司);T4 DNA連接酶、2-Log DNA Ladder(美國NEB公司);高糖DMEM無血清培養(yǎng)基、胎牛血清(美國GIBICO公司)。

1．2 細胞系及培養(yǎng)方法

HEK293細胞(American Type Culture Collection，ATCC)。培養(yǎng)條件:90%高糖DMEM培養(yǎng)基加入10%胎牛血清。在37℃、飽和濕度、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1．3 AmCyan1基因的克隆

根據(jù)pAmCyan1-N1(以下簡稱pCFP)真核表達載體中AmCyan1基因序列設計引物:上游引物含有HindⅢ酶切位點，序列為5'-CCCAAGCTTATGGCCCTGTCC-3';下游引物含有SacⅡ酶切位點，序列為 5'-ATACCGCGGGAAGGGCACCAC-3'。以pAmCyan1-N1為模板PCR擴增。

1．4 真核表達質粒pAmCyan1-ZsYellow1的構建

將擴增產(chǎn)物進行1%瓊脂糖凝膠電泳，回收和純化700 bp的PCR產(chǎn)物，產(chǎn)物和pZsYellow1-N1(以下簡稱pYFP)載體進行HindⅢ/SacⅡ雙酶切，進一步膠回收純化產(chǎn)物，室溫連接。重組質粒經(jīng)過酶切鑒定和基因測序，利用NCBI在線Nucleotide BLAST比對工具Basic Local Alignment Search Tool對pAm-Cyan1-ZsYellow1(以下簡稱pCFP-YFP)測序結果與已知AmCyan1基因序列進行分析比對。

1．5 真核表達質粒pCFP-YFP在HKE293細胞的表達

HEK293細胞轉染前24 h傳代于35 mm培養(yǎng)皿中，常規(guī)培養(yǎng)。轉染當天，加入0．4 μg質粒。轉染后24-36 h，傳代于共聚焦專用皿中，在激光共聚焦顯微鏡Leica TCS-SP5系統(tǒng)下觀察AmCyan1-ZsYellow1蛋白(以下簡稱CFP-YFP)的表達情況。

1．6 FRET 研究

根據(jù)FRET實驗要求，共需要四組對照分別是:①陰性對照組(CFP+YFP)，HEK293細胞中共轉染pCFP和pYFP;②陽性對照組(CFP-YFP)，HEK293細胞中轉染pCFP-YFP陽性對照質粒;③pCFP單轉染組，HEK293細胞中僅轉染pCFP質粒;④pCFP單轉染組，HEK293細胞中僅轉染pYFP質粒。

質粒轉染方法及細胞表達方法同1．5。

圖像采集由Leica SP5激光共聚焦顯微鏡系統(tǒng)完成，氬粒子激光器提供激光光源。CFP(供體)的激發(fā)波長在458 nm，探測器(PMT)檢測波長設在462-510 nm之間，YFP(受體)的激發(fā)波長在514 nm，PMT檢測波長設在518-580 nm之間。樣品觀察采用63×物鏡，數(shù)值孔徑(NA)為1．40，圖像采集在原有放大倍數(shù)上進行電子放大3倍(Zoom=3)。

FRET圖像采集及FRET效率計算由LAS AF Version1．8．2 build 1465 軟件完成。

1．7 統(tǒng)計學分析

CFP+YFP組和CFP-YFP組為分別隨機采集5個細胞圖像，并在每個細胞中隨機分析3個興趣區(qū)域(ROI)，每組的樣本數(shù)為15，進行FRET轉移效率(EFRET)計算和統(tǒng)計。數(shù)據(jù)以±s表示，采用t檢驗對陰性對照組和陽性對照組間EFRET差異進行比較，P＜0．05認為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2．1 pAmCyan1基因插入到pZsYellow1-N1載體的多克隆位點(MCS)

如圖1所示，以pAmCyan1-N1為模板，設計引物，上游引物5'端帶有HindⅢ酶切位點，下游引物5'端帶有SacⅡ酶切位點。通過PCR反應，擴增AmCyan1基因片段。通過雙酶切體系，將AmCyan1基因插入到pZsYellow1-N1載體的多克隆位點HindⅢ和SacⅡ酶之間，下游的ZsYellow1基因序列無讀碼框的移位。同時AmCyan1基因序列下游引物5'端去除了終止密碼子TGA，確保插入到載體中的序列能夠往3'端方向繼續(xù)轉錄和翻譯，不影響ZsYellow1基因正確翻譯為黃色熒光蛋白。AmCyan1基因序列位于ZsYellow1的上游，二者之間隔30個堿基，序列為CCG CGG GCC CGG GAT CCA CCG GTC GCC ACC，經(jīng)過翻譯，可表達為具有10個氨基酸殘基一小段肽段，分別是脯氨酸(P)，精氨酸(R)，丙氨酸(A)，精氨酸(R)，天冬氨酸(D)，脯氨酸(P)，脯氨酸(P)，纈氨酸(V)，丙氨酸(A)，蘇氨酸(T)。因為CFP蛋白在YFP蛋白的N端，所以融合蛋白命名為CFP-YFP。

圖1 pZsYellow1-N1載體圖譜及多克隆位點序列Figure 1 The macrorestriction map in multiple cloning site(MCS)of pZsYellow1-N1

2．2 真核表達質粒pAmCyan1-ZsYellow1的酶切鑒定及測序結果

對pAmCyan1-ZsYellow1質粒進行HindⅢ/SacⅡ雙酶切鑒定，然后1%瓊脂糖凝膠電泳，在700 bp位置可以看到特異的條帶(見圖2)。pAmCyan1基因序列共含有687個堿基(不包含終止密碼子)，所以在700 bp位置看到條帶說明PCR擴增的AmCyan1序列成功的插入到pZsYellow1-N1載體中。利用NCBI在線比對工具Basic Local Alignment Search Tool(Nucleotide BLAST)對pAmCyan1-ZsYellow1測序結果與已知AmCyan1進行比對，結果顯示堿基序列完全一致，不存在突變和缺失(見圖3)，說明pAmCyan1-ZsYellow1質粒構建成功。

2．3 利用Leica SP5激光共聚焦顯微鏡觀察CFPYFP融合蛋白

EFRET代表FRET轉移效率圖，圖片的顏色越偏向冷色調，說明FRET轉移的效率越低。圖4結果顯示，CFP-YFP陽性組的EFRET圖偏黃綠色，而CFP+YFP陰性組偏藍色，說明陽性組FRET轉移信號較陰性組強。融合蛋白CFP-YFP在細胞中主要在細胞質中表達，極少量進入到細胞核中，這與pCFP和pYFP共轉染的細胞中熒光蛋白的分布略有不同，后者在細胞胞質和細胞核中均有表達。我們認為CFP和YFP熒光蛋白的分子量大概在20 kD左右，在HEK293細胞共轉染時，二者分別是獨立的個體，并無緊密連接，可以自由進出細胞核，所以在細胞核內(nèi)可觀察到熒光。而構建成融合蛋白之后，分子量變?yōu)?0 kD，空間構象發(fā)生改變，影響了其進入細胞核，所以觀察到細胞核位置僅有少量的熒光。

圖2 真核表達質粒pZsYellow1-AmCyan1酶切鑒定結果Figure 2 Identification of pZsYellow1-AmCyan1 by restriction enzyme analysis

圖3 真核表達質粒pZsYellow1-AmCyan1基因測序在NCBI網(wǎng)站上比對鑒定結果Figure 3 Identification of pZsYellow1-AmCyan1 by nucleotide BLAST on line

2．4 CFP-YFP融合蛋白FRET轉移率的統(tǒng)計分析

圖4 陽性對照組和陰性對照組的FRET圖像Figure 4 The accumulation of FRET signal by Leica confocal system in positive control and negative control

pCFP和pYFP質粒單轉染組主要用于FRET轉移率計算步驟中的數(shù)據(jù)校正，所以在此未統(tǒng)計FRET的效率。pCFP和pYFP質粒共轉染組為陰性對照組，EFRET 為(12．70±5．48)%，pCFP-YFP 陽性對照組EFRET為(57．20 ±6．66)%。陰性對照組和陽性對照組之間的EFRET差值，經(jīng)過t檢驗，差異有統(tǒng)計學意義(t=19．99，P ＜0．05)，這表明 pCFP-YFP陽性質粒可以用于FRET研究。而陰性對照組中，pCFP和pYFP雖然共轉染到同一細胞中，但實際二者并無緊密連接，隨著熒光分子在細胞內(nèi)運動，某些分子在空間上可能發(fā)生距離足夠近時，可以發(fā)生極少的FRET現(xiàn)象，所以測得FRET轉移率很低，但不完全為0。

3 討論

隨著生命科學研究的深入，對實驗技術的需求不斷提高，新技術隨之誕生和迅速發(fā)展。在研究蛋白質分子之間相互作用的諸多方法中，利用熒光蛋白標記的FRET具有活細胞觀察的優(yōu)勢，能夠無創(chuàng)、實時觀察蛋白分子間的動態(tài)變化。

FRET是指能量從一種受激發(fā)的熒光基團(fluorophore)轉移到另一種熒光基團的物理現(xiàn)象［7，8］。前者稱為供體(donor)，后者稱為受體(acceptor)，當發(fā)生FRET時，激發(fā)態(tài)的供體以非輻射的方式將部分能量轉移到受體，使受體被激發(fā)發(fā)射熒光，而自身的熒光淬滅(quenching)［7］。

根據(jù)E的公式推理認為，CFP-YFP間隔的氨基酸殘基數(shù)量越少FRET發(fā)生的效率越高。在國內(nèi)的一項研究中，研究者利用分子生物學實驗方法，分別創(chuàng)建了間隔為15，24和37個氨基酸殘基的多種CFY-YFP融合蛋白，并進行了FRET轉移效率的比較，發(fā)現(xiàn)間隔15個氨基酸FRET效率最高［9］。在另一項研究中，采用的是相隔15個氨基酸殘基的陽性融合蛋白作為陽性參照［1］。而在本研究中，我們利用現(xiàn)有的質粒，并通過選擇合適的酶切位點，將CFP的片段插入到YFP的真核表達載體中，首次創(chuàng)建了相隔10個氨基酸殘基的CFY-YFP融合蛋白，使FRET的發(fā)生效率再次提高。

基于熒光強度的FRET方法，其效率的計算受很多因素影響，比如產(chǎn)生熒光光子的數(shù)量，熒光漂白以及分子的位置等［9］，而一些外在因素如樣品移動、激發(fā)光波動等也會影響FRET測定結果，所以在試驗中設置合理的陰性對照和陽性對照對于評價一個實驗技術是否穩(wěn)定，實驗方法是否合理是非常重要的。陽性對照物可以為研究者在采集圖像，參數(shù)校正等方面提供非常重要的參考，從而指導研究者獲得可靠的數(shù)據(jù)。不僅如此，本研究中構建的CFPYFP融合蛋白還能運用于其他研究中，如熒光壽命成像測定共振能量傳遞(FILM-FRET)和熒光相關光譜(FCS)中作為參照物。

本研究通過構建pYFP-CFP真核表達載體，建立了FRET技術的應用平臺，從構建質粒、細胞轉染到共聚焦圖像采集、FERE轉移率的數(shù)據(jù)分析等方面都有涉及，從而為進一步開發(fā)FRET技術提供更好的技術支持。

［1］鐘田雨，唐靖，陳登宇，等．利用熒光共振能量轉移技術研究活細胞TLR4與MD-2作用結構域［J］．生物化學與生物物理進展，2009，36(11):1451-1457．

［2］李俊青，江建明，馮瑞強，等．蛋白激酶C激活的熒光共振能量轉移分析［J］．南方醫(yī)科大學學報，2011，31(1):1867-1870．

［3］鄧楚蕓，李佳敏，馬萬云．DNA納米傳感器熒光成像技術［J］．光譜學與光譜分析，2010，30(1):220-224．

［4］劉波，邵帥，謝飛，等．熒光共振能量轉移技術在細胞離子研究中的應用［J］．北京生物醫(yī)學工程，2015，34(2):196-202．

［5］王進軍，陳小川，邢達．FRET技術及其在蛋白質-蛋白質分子相互作用研究中的應用［J］．生物化學與生物物理進展，2003，30(6):980-984．

［6］張志毅，周濤，鞏偉麗，等．熒光共振能量轉移技術在生命科學中的應用及研究進［J］．展電子顯微學報，2007，26(6):620-624．

［7］劉鐳，張英杰，汪獻旺．利用熒光共振能量轉移技術在活細胞內(nèi)研究順鉑誘導的凋亡信號通路［J］．生物化學與生物物理進展，2009，36(9):1172-1179．

［8］劉春春，杭海英．生物大分子相互作用檢測技術新進展:三色熒光級聯(lián)熒光共振能量轉移技術［J］．生物化學與生物物理進展，2006，33(3):292-296．

［9］Xia Z，Liu Y．Reliable and global measurement of fluorescence resonance energy transfer using fluorescence microscopes［J］．Biophys J，2001，81(4):2395-2402．