LIM結(jié)構(gòu)域蛋白FHL1C與GNB2不存在相互作用

劉 娟，趙俊龍，王媛媛，韓 驊，秦鴻雁，張丙芳(第四軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院老年病科，西安 7003;第四軍醫(yī)大學(xué)醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)與發(fā)育生物學(xué)教研室腫瘤生物學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室;通訊作者，E-mail:fanpen@fmmu．edu．cn)

LIM結(jié)構(gòu)域是一類富含半胱氨酸的蛋白基序，可介導(dǎo)蛋白與蛋白間相互作用，并在基因表達(dá)調(diào)控、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和細(xì)胞骨架形成中發(fā)揮作用［1－4］。這種特點(diǎn)使其在細(xì)胞組織結(jié)構(gòu)的維持、信號(hào)通路的傳遞等過程中發(fā)揮重要作用。隸屬于LIM蛋白FHL1分子亞家族的KyoT2分子(人FHL1C在小鼠中的同源物)，由日本學(xué)者Taniguchi等［5］首先發(fā)現(xiàn)，并在哺乳動(dòng)物細(xì)胞體系中驗(yàn)證了LIM結(jié)構(gòu)域蛋白KyoT2可以與調(diào)控發(fā)育的 Notch信號(hào)途徑關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子RBP-Jk相互作用形成復(fù)合物，進(jìn)而競爭性抑制RBP-Jk介導(dǎo)的Notch信號(hào)下游基因的轉(zhuǎn)錄，抑制Notch信號(hào)的活化。同時(shí)，我們課題組的前期研究發(fā)現(xiàn)，KyoT2蛋白N端的LIM結(jié)構(gòu)域作為介導(dǎo)蛋白相互作用的重要結(jié)構(gòu)，可通過募集PcG蛋白家族(polycomb group protein，PcG)RING1和HPC2共同參與轉(zhuǎn)錄調(diào)控［6，7］。KyoT2的人源同源蛋白 FHL1C同樣已被發(fā)現(xiàn)可以通過特異性地阻斷Notch信號(hào)，進(jìn)而促進(jìn)急性T細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞的凋亡，發(fā)揮可能的治療效果［8］。然而，F(xiàn)HL1C/KyoT2分子都不含有核定位信號(hào)，因此該蛋白的入核很有可能通過不同方式的修飾，或者與其他核蛋白的相互作用實(shí)現(xiàn)。此外，F(xiàn)HL1C/KyoT2的生理功能尚未明確，KyoT2基因敲除小鼠并未發(fā)現(xiàn)發(fā)育異常。因此對(duì)于FHL1C相互作用分子的研究，將有助于進(jìn)一步理解其特異性抑制Notch信號(hào)的分子機(jī)制。本實(shí)驗(yàn)室前期的蛋白質(zhì)譜數(shù)據(jù)顯示，F(xiàn)HL1C作為介導(dǎo)蛋白相互作用的分子，可與多種蛋白結(jié)合形成復(fù)合物，如GNB2等［9］。本研究旨在驗(yàn)證由此發(fā)現(xiàn)的鳥嘌呤核苷酸結(jié)合蛋白β亞基中的GNB2蛋白與FHL1C蛋白之間的相互作用，為進(jìn)一步研究FHL1C/KyoT2抑制Notch信號(hào)途徑的生物功能提供重要理論依據(jù)。

1 材料和方法

1．1 質(zhì)粒、細(xì)胞株及主要試劑

真核表達(dá)載體 pCMX-VP16、pCMV-Flag、pCMVGAL4-DBD-FHL1C、pCMV-myc-FHL1C及含報(bào)告基因的質(zhì)粒 TK MH100×4Luc、pRL-TK均為本室保存。HeLa細(xì)胞及其cDNA為本室保存。細(xì)菌培養(yǎng)用酵母提取物和蛋白胨、瓊脂粉購自O(shè)xoid公司;感受態(tài)XL-10由本室保存;細(xì)胞培養(yǎng)用DMEM購自GIBCO公司;胎牛血清、Lysis Buffer購自杭州四季青生物工華舜生物工程有限公司;抗myc標(biāo)簽抗體購自CHEMICON，辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的羊抗鼠、羊抗兔IgG均購自博士德公司。限制性內(nèi)切酶、DNA Ligation Kit、質(zhì)粒抽提以及膠回收試劑盒均購自TaKaRa生物制品公司，LARⅡ和SG buffer雙報(bào)告基因試劑、Lipofectamine2000購自Invitrogen公司;rTaq mix購自 Promega公司。DNA Marker DL2000購于華美公司，PVDF膜購于Amersham公司;測(cè)序及引物合成由北京奧科鼎盛生物科技有限公司完成。

1．2 真核表達(dá)載體pCMV-VP16-GNB2的構(gòu)建

以HeLa細(xì)胞系cDNA為模板，上游引物:5'－GCGAATCATGAGTGAGCTGGAGCAACTGAGA－3';下游引物:5'－GGGTCGACTTAGTTCCAGATCTTGAGGAAGGAG－3';按以下條件擴(kuò)增GNB2基因的開放讀框序列片段:cDNA 1 μl，rTaq mix 10 μl，上游引物(10 nm)0．5 μl，下游引物(10 nm)0．5 μl，最后用去離子水補(bǔ)足20 μl。PCR反應(yīng)條件:94℃ 5 min;94℃ 30 s，58℃ 30 s，72℃1 min共35個(gè)循環(huán);72℃延伸 5 min。取5 μl進(jìn)行2%凝膠電泳。將純化回收的目的片段與pCMX-VP16載體分別進(jìn)行EcoRⅠ和SalⅠ雙酶切反應(yīng)后，進(jìn)行連接，構(gòu)建pCMV-VP16-GNB2真核表達(dá)質(zhì)粒。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌XL-10，37℃孵育12h后挑取單克隆菌落培養(yǎng)，并按照TaKaRa質(zhì)粒小提說明書進(jìn)行質(zhì)粒提取操作。所有質(zhì)粒經(jīng)過EcoRⅠ和SalⅠ酶切及DNA測(cè)序鑒定。

1．3 真核表達(dá)載體pCMV-FLAG-GNB2的構(gòu)建

以已經(jīng)構(gòu)建成功的質(zhì)粒pCMV-VP16-GNB2為模板，上游引物:5'－GCGAATTCCATGAGTGAGCTGGAGCAACTGAGA－3'，下游引物:5'－GGGTCGACTTAGTTCCAGATCTTGAGGAAGGAG－3';按同上條件擴(kuò)增GNB2基因的開放讀框序列片段并連接入pCMV-Flag載體，構(gòu)建融合Flag標(biāo)簽的真核表達(dá)質(zhì)粒pCMV-Flag-GNB2，所有質(zhì)粒經(jīng)過EcoRⅠ和SalⅠ酶切及DNA測(cè)序鑒定。

1．4 哺乳動(dòng)物雙雜交

轉(zhuǎn)染前12－16 h將HeLa細(xì)胞按5×104/ml均勻接種于在24孔板中，置于37℃恒溫孵箱中培養(yǎng)過夜。待細(xì)胞融合至80%－90%時(shí)，吸去上清替換為無血清培養(yǎng)液，按照 Lipofectamine2000∶DNA=2．5 μl∶1 μg 比例將 pCMX-GAL4-DBD-FHL1C 質(zhì)粒和不同劑量的pCMV-VP16-GNB2質(zhì)粒及報(bào)告基因質(zhì)粒TK和MH100×4Luc共轉(zhuǎn)染入HeLa細(xì)胞內(nèi)(組合策略見結(jié)果)，同時(shí)把 pCMX-GAL4-DBDFHL1C及 pCMV-VP16-RBP-J共轉(zhuǎn)染作為陽性對(duì)照。4－6 h后將無血清培養(yǎng)液換為完全培養(yǎng)液，培養(yǎng)48 h后收集細(xì)胞，加入裂解液冰上裂解20 min，吸出上清液4 μl，先加入 10 μl LARⅡ，上機(jī)檢測(cè)內(nèi)參海腎基因熒光信號(hào);再加入10 μl SG Buffer，上機(jī)檢測(cè)熒光素酶熒光信號(hào);將兩次所得熒光信號(hào)比值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，每組實(shí)驗(yàn)設(shè)置三個(gè)副孔并重復(fù)實(shí)驗(yàn)三次。

1．5 免疫共沉淀

按同上轉(zhuǎn)染方法，將結(jié)果中描述的不同組合質(zhì)粒用脂質(zhì)體法瞬時(shí)共轉(zhuǎn)染接種好的HeLa細(xì)胞。轉(zhuǎn)染后60 h，用預(yù)冷的PBS將細(xì)胞洗一遍，收集細(xì)胞加入1 ml含1%PMSF的IP專用RIPA裂解液，4℃孵育30 min后置于冰上待用。4℃充分混勻磁珠，分別吸取30 μl于新管中，置于磁體架上使磁珠和溶液分離，將上清吸出，并用PBS沖洗一遍磁珠。用PBST將Myc抗體稀釋100倍，每份樣本加入200 μl PBST抗體稀釋液重懸并充分混勻，以20 r/min轉(zhuǎn)速4℃低溫旋轉(zhuǎn)2 h。將EP管放置于磁體上吸出上清，加入已制備好于冰上保存的蛋白樣品，4℃旋轉(zhuǎn)孵育過夜，同時(shí)每管留取少量樣品作為Input對(duì)照組。次日用PBS沖洗磁珠－抗體－抗原復(fù)合物后，每管加入50 mmol/L甘氨酸溶液使靶抗原復(fù)合物洗脫，并加入含有β－巰基乙醇的蛋白緩沖液在沸水中煮沸5 min后，用抗Flag和抗Myc標(biāo)簽的單克隆抗體分別對(duì)不同組別的Input樣品和Co-IP樣品進(jìn)行Western blot檢測(cè)。

1．6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

數(shù)據(jù)分析采用SPSS11．5統(tǒng)計(jì)分析軟件，采用方差分析和t檢驗(yàn)，以P＜0．05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2．1 pCMV-VP16-GNB2 載體構(gòu)建

以HeLa細(xì)胞為模板擴(kuò)增GNB2基因開放讀框片段結(jié)果(圖1A)。GNB2基因開放讀框大小為1 023 bp。如圖A可見，以56℃為退火溫度未擴(kuò)增出相應(yīng)條帶，以58℃為退火溫度可擴(kuò)增出與GNB2一致的1 023 bp條帶。重組質(zhì)粒pCMV-VP16-GNB2經(jīng)EcoRⅠ和SalⅠ酶切后可擴(kuò)增出1 023 bp大小條帶，與預(yù)期的一致(圖1B)。DNA測(cè)序結(jié)果與GNB2編碼區(qū)序列一致(圖2)。

圖1 pCMV-VP16-GNB2載體構(gòu)建及鑒定Figure 1 The construction and identification of recombinant plasmid pCMV-VP16-GNB2

圖2 pCMV-VP16-GNB2部分測(cè)序圖Figure 2 Partial sequencing map of pCMV-VP16-GNB2

2．2 pCMV-Flag-GNB2 載體構(gòu)建

以pCMV-VP16-GNB2質(zhì)粒為模板可擴(kuò)增出與GNB2一致的1 023 bp大小條帶(見圖3A)，重組質(zhì)粒pCMV-Flag-GNB2經(jīng)EcoRⅠ和SalⅠ酶切可擴(kuò)增出1 023 bp大小條帶，與預(yù)期的一致(見圖3B)，GNB2基因開放讀框大小為1 023 bp。DNA測(cè)序結(jié)果與GNB2編碼區(qū)序列一致(見圖4)。

圖3 pCMV-Flag-GNB2載體構(gòu)建及鑒定Figure 3 The construction and identification of recombinant plasmid pCMV-Flag-GNB2

圖4 pCMV-Flag-GNB2基因全長部分測(cè)序圖Figure 4 Partial sequencing map of pCMV-Flag-GNB2

2．3 哺乳動(dòng)物雙雜交實(shí)驗(yàn)結(jié)果

質(zhì)粒構(gòu)建正確后，在HeLa細(xì)胞中通過哺乳動(dòng)物雙雜交實(shí)驗(yàn)對(duì)FHL1C和GNB2在體內(nèi)的相互作用關(guān)系進(jìn)行了驗(yàn)證(圖5)，通過實(shí)驗(yàn)組和陽性對(duì)照組的結(jié)果進(jìn)行對(duì)比并統(tǒng)計(jì)分析得出，相對(duì)于陽性對(duì)照組，在體外環(huán)境中，F(xiàn)HL1C和GNB2之間不能通過相互結(jié)合而激活下游報(bào)告基因Luciferase的表達(dá)。提示FHL1C和GNB2在體外可能不存在相互作用。

圖5 哺乳動(dòng)物雙雜交實(shí)驗(yàn)中報(bào)告基因結(jié)果Figure 5 The report gene assay results of mammalian twohybrid experiments

2．4 免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)結(jié)果

為了進(jìn)一步驗(yàn)證FHL1C與GNB2之間是否存在體內(nèi)的相互作用，我們將Flag標(biāo)簽標(biāo)記的GNB2與Myc標(biāo)簽標(biāo)記的FHL1C質(zhì)粒在HeLa細(xì)胞中共轉(zhuǎn)染，pCMV-Flag空載體作為陰性對(duì)照。細(xì)胞裂解后的共沉淀蛋白復(fù)合物用Myc標(biāo)簽抗體捕獲，并分別用Myc、Flag抗體進(jìn)行Western blot檢測(cè)。結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組和Input組均可檢測(cè)出FHL1C條帶，而實(shí)驗(yàn)組免疫沉淀復(fù)合物中未能發(fā)現(xiàn)GNB2與FHL1C形成共沉淀(見圖6)。提示FHL1C和GNB2在體內(nèi)可能不存在生理上的相互作用。

3 討論

圖6 免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)中ECL發(fā)光結(jié)果Figure 6 The ECL results of co-immunoprecipitation experiments

當(dāng)今，人們對(duì)蛋白質(zhì)藥物越來越關(guān)注。已有人預(yù)測(cè)過，2014年銷售額前100位的處方藥中幾乎有近一半為蛋白質(zhì)藥物［10］。蛋白與蛋白間的相互作用通過介導(dǎo)不同的信號(hào)通路，在細(xì)胞增殖、定向分化等細(xì)胞行為的調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用［11］。Notch信號(hào)通路通過其胞內(nèi)段NICD與轉(zhuǎn)錄因子RBP-k相結(jié)合而激活下游基因的轉(zhuǎn)錄［11，12］。γ－分泌酶抑制劑能有效地抑制Notch信號(hào)途徑，但因?yàn)槠洳⒎翘禺愋缘腘otch信號(hào)途徑抑制劑［13］，而且具有顯著的腸毒性［14］，使其在臨床中的應(yīng)用受到了限制。因此，設(shè)計(jì)及優(yōu)化Notch信號(hào)通路的新型抑制劑尤為重要。以往文獻(xiàn)表明，LIM結(jié)構(gòu)域蛋白 FHL1C(鼠源KyoT2)可通過競爭性結(jié)合RBP-J而抑制Notch信號(hào)轉(zhuǎn)錄激活作用［15］。FHL1C在睪丸、骨骼肌和心臟中高表達(dá)，并通過同其他蛋白的相互作用從而發(fā)揮轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用［15］。因此對(duì)于FHL1C功能的研究，特別是相互作用蛋白的研究，將有助于我們進(jìn)一步理解其特異性抑制Notch信號(hào)的分子機(jī)制，并為尋找可能的抑制Notch信號(hào)的新的阻斷劑奠定基礎(chǔ)。GNB2為調(diào)節(jié)蛋白鳥嘌呤核苷酸結(jié)合蛋白G蛋白β亞基中的一個(gè)亞型。目前，有關(guān)其生物學(xué)功能的報(bào)道比較少。一般認(rèn)為，GNB2主要依賴其包含的7個(gè)重復(fù)的WD40區(qū)［16］招募和固定激活因子與效應(yīng)蛋白，并使它們結(jié)合成多種蛋白復(fù)合物。Jung等［17］發(fā)現(xiàn)，GNB2可以通過激活A(yù)xin并啟動(dòng)泛素介導(dǎo)的蛋白降解途徑將Dishevelled降解掉，從而負(fù)反饋調(diào)節(jié)t/Frizzled→Gβγ→PLC→Ca2+/PKC信號(hào)通路。本實(shí)驗(yàn)通過一系列的分子相互作用的實(shí)驗(yàn)證實(shí)了經(jīng)質(zhì)譜分析獲得的FHL1C的候選分子GNB2與FHL1C之間不存在細(xì)胞內(nèi)的相互作用，從而排除FHL1C可能通過與小G蛋白家族分子相互作用調(diào)控Notch信號(hào)的機(jī)制，提示FHL1C可能通過與其他相互作用候選分子調(diào)控Notch信號(hào)途徑。我們推測(cè)，質(zhì)譜實(shí)驗(yàn)中顯示的FHL1C與GNB2之間的相互作用可能為假陽性。其可能的原因是，F(xiàn)HL1C是富含LIM結(jié)構(gòu)域的蛋白，LIM結(jié)構(gòu)域是蛋白－蛋白之間相互作用的界面，而GNB2的功能也是募集和固定各種相互作用的分子。因而，當(dāng)GNB2在體外過表達(dá)后，其過量招募相互作用蛋白，尤其是可與FHL1C形成蛋白復(fù)合物的蛋白組分，從而可能改變了蛋白復(fù)合物的空間構(gòu)向，通過占位效果使得FHL1C蛋白復(fù)合物的定位或結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，從而無法觀察檢測(cè)到FHL1C與GNB2的相互作用。然而，其在生理狀態(tài)下，是否能夠相互作用，以及其可能的功能和作用，仍需進(jìn)一步的探討。同時(shí)，為進(jìn)一步研究KyoT2的生理功能，其與其他相互作用候選分子的關(guān)系仍需進(jìn)一步研究和確認(rèn)。

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