腦出血大鼠血腫周圍組織IL-17與NF-κBp65的表達及意義

腦出血大鼠血腫周圍組織 IL-17與NF-κBp65的表達及意義

畢勝李冬王李鳴趙巖巖關(guān)雪蓮侯麗淳田嘉瑩王增冕李曉濤李培育

(佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院，黑龍江佳木斯154002)

摘要〔〕目的探討腦出血大鼠血腫周圍組織中白細胞介素(IL)-17與核因子(NF)-κBp65的表達及其意義。方法90只大鼠隨機分成對照組，假手術(shù)組，出血組，每組30只。選取6、24 h，3、7、14 d五個時間點。RT-PCR法檢測大鼠血腫周圍組織中IL-17 mRNA，NF-κBp65 mRNA的表達。結(jié)果對照組與假手術(shù)組IL-17 mRNA 與 NF-κBp65 mRNA的表達在各時間點均無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)。在同一時間點，出血組IL-17 mRNA與NF-κBp65 mRNA的表達與對照組、假手術(shù)組均具有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)。在各時間點，出血組IL-17 mRNA、NF-κBp65 mRNA的表達均具有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)；出血組IL-17 mRNA 與 NF-κBp65 mRNA的表達在腦出血后7 d 高于其他時間點(P<0.05)。結(jié)論IL-17 mRNA 與 NF-κBp65 mRNA 的表達在腦出血后6 h 就開始增加，7 d高于6、24 h，3、14 d。IL-17 與 NF-κBp65 參與腦出血后的炎癥反應(yīng)。

關(guān)鍵詞〔〕腦出血；IL-17；NF-κBp65

中圖分類號〔〕R743.34〔文獻標識碼〕A〔

基金項目：黑龍江省自然科學(xué)

通訊作者：李培育(1980-)，男，碩士，主治醫(yī)師，主要從事腦血管病的發(fā)病機制研究。

第一作者：畢勝(1981-)，女，碩士，主治醫(yī)師，主要從事腦血管病的發(fā)病機制研究。

腦出血是一種常見的神經(jīng)系統(tǒng)危重癥之一。白細胞介素(IL)-17是一種重要的致炎因子，因其廣泛參與多種炎癥性疾病的發(fā)病而受到廣泛關(guān)注。核因子(NF)-κB廣泛表達于神經(jīng)元，少突膠質(zhì)細胞，星形膠質(zhì)細胞，小膠質(zhì)細胞等細胞內(nèi)。NF-κB是一種具有多向性的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，可以調(diào)控多種細胞因子的表達。大量研究證實，在多種細胞中NF-κB是IL-17A信號通路的下游靶基因〔1,2〕，本研究將通過檢測IL-17 mRNA，NF-κBp65 mRNA在腦出血血腫周圍組織中的表達，探討IL-17與NF-κBp65的相關(guān)性及其在腦出血發(fā)病中作用。

1材料與方法

1.1實驗動物與分組由吉林大學(xué)動物實驗中心提供的清潔級SD大鼠，雄性，平均年齡(12±2)周，共90只，體重220～260 g，采用多層層流架飼養(yǎng)，20～25℃ 恒溫飼養(yǎng)。隨機分成對照組，假手術(shù)組，出血組，每組30只。出血組模型的制備：參考Hua等〔3〕的方法。模型成功的判定：采用Longa法評分〔4〕，無神經(jīng)功能缺損為0分，出血后對側(cè)肢體不能伸直為1 分，出現(xiàn)轉(zhuǎn)圈為2 分，行走時身體向偏癱側(cè)傾倒為3 分，意識消失，完全不能行走為4 分，>2分認為模型成功。對照組模型建立方法同出血組，但只是完成刺入動作，不注入血液。假手術(shù)組模型建立方法同出血組，注入生理鹽水。分別設(shè)6、24 h，3、7、14 d五個時間點。

1.2血腫周圍組織IL-17 mRNA，NF-κBp65 mRNA表達模型建立后，規(guī)定時間點處死，在生理鹽水灌注后即斷頭取腦。取血腫周圍或針道周圍腦組織塊(3 mm×3 mm×3 mm)，用于RT-PCR法檢測。采用 Trizol 法提取腦組織中總RNA。將RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。內(nèi)參基因β-actin(PCR產(chǎn)物為218 bp)，上游引物:5′-TGCTGTCCCTGTATGCCTCT-3′，下游引物:5′-TGTCACGCACGATTTCCC-3′，退火溫度為58℃。IL-17(170 bp)：上游引物5′-CCTCAACTCCCTTAGCTCAAAAG-3′下游引物：5′-AACTTCCCCTCAGCGTTGACA-3′，退火溫度57℃。NF-κBp65(170 bp)引物序列：上游5′-ATCTGTTTCCCCTCATCTTTCC-3′，下游5′-TGGGTGCGTCTTAGTGGTATCT-3′，退火溫度為58℃。通過PCR將DNA片段擴增，反應(yīng)結(jié)束后，將PCR產(chǎn)物跑1.5%瓊脂糖凝膠電泳(120 V，20 min)，凝膠成像系統(tǒng)分析數(shù)據(jù)。

1.3統(tǒng)計學(xué)方法采用SPSS13.0軟件行單因素方差分析。

2結(jié)果

2.1血腫周圍組織中 IL-17 mRNA 的表達對照組與假手術(shù)組IL-17 mRNA的表達在各時間點均無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)。在同一時間點，出血組IL-17 mRNA的表達與對照組、假手術(shù)組均具有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)。在各時間點，出血組IL-17 mRNA的表達均具有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)；出血組IL-17 mRNA的表達在腦出血后7 d 高于其他時間點(P<0.05)。見表1。

2.2血腫周圍組織中NF-κBp65 mRNA的表達對照組與假手術(shù)組NF-κBp65 mRNA的表達在各時間點均無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)。在同一時間點，出血組NF-κBp65 mRNA的表達與對照組、假手術(shù)組均具有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)。在各時間點，出血組NF-κBp65 mRNA的表達均具有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)；出血組NF-κBp65 mRNA的表達在腦出血后7 d 高于其他時間點(P<0.05)。見表2。

表1　各組血腫周圍組織中 IL-17 mRNA/β-actin 的表達

與對照組比較：1)P<0.05；與假手術(shù)組比較：2)P<0.05；與6 h相比較：3)P<0.05；與24 h相比較：4)P<0.05；與3 d相比較：5)P<0.05；與7 d相比較：6)P<0.05；下表同

表2　各組血腫周圍組織中NF-κB mRNA/β-actin的表達

3討論

多種細胞因子參與腦出血后的病理過程。IL-17因其參與多種炎癥性疾病的發(fā)病而受到廣泛關(guān)注，Wang等〔5〕在對體外氧糖剝奪模型鼠的研究中發(fā)現(xiàn)，IL-17及其受體IL-17R的表達量與腦組織損傷具有明顯相關(guān)性。已有研究證實，IL-17與其受體結(jié)合后，通過NF-κB、MAPK、 JAKs/STATs這三種信號途徑傳導(dǎo)信號〔6〕。在對類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的研究中發(fā)現(xiàn)，IL-17可以間接通過多種相關(guān)細胞因子促進NF-κB的表達。而NF-κB與IL-17之間可以形成正反饋通路〔7〕。

本文發(fā)現(xiàn)IL-17 mRNA及NF-κBp65 mRNA的表達趨勢具有明顯的一致性。腦出血后炎癥反應(yīng)以3～7 d最為嚴重，IL-17 mRNA及NF-κBp65 mRNA的表達與腦出血后血腫周圍組織的炎癥反應(yīng)過程具有高度一致性。提示腦出血后，IL-17/NF-κB 通路參與腦出血后的病理過程?？梢酝ㄟ^調(diào)控 IL-17 的分泌達到減輕炎癥反應(yīng)，控制腦水腫，減少細胞凋亡的作用。

4參考文獻

1Doreau A,Belot A,Bastid J,etal.Interleukin 17 acts in synergy with B cell-activating factor to influence B cell biology and the pathophysiology of systemic lupus erythematosus 〔J〕.Nat Immunol,2009;10(7):778-85.

2Shalom-Barak T,Quach J,Lotz M.Interleukin-17-induced gene expression in articular chondrocytes is associated with activation of mitogen activated protein kinases and NF-kappaB 〔J〕.J Biol Chem,1998;273(42):27467-73.

3Hua Y,Schallert T,Keep RF,etal.Behavioral tests after intracerebral hemorrhage in the rat 〔J〕.Stroke,2002;33(10):2478-84.

4Longa EZ,Weinstein PR,Carlson S,etal.Reversible middle cerebral artery occlusion without craniotomy in rats 〔J〕.Stroke,1989;20(1):84-91.

5Wang DD,Zhao YF,Wang GY.IL-17 potentiates neuronal injury induced by oxygen-glucose deprivation and affects neuronal IL-17 receptor expression〔J〕.J Neuroimmunol,2009;212(1-2):17-25.

6孫創(chuàng)斌,胡晉紅.藥物作用新靶點:白細胞介素 17 及其受體〔J〕.國際藥學(xué)研究雜志,2008;35(3):169-72.

7Onishi RM,Park SJ,Hanel W,etal.SEF/IL/7R(SEFIR)is not enough:an extended SEFIR domain is required for i1-17RA-mediated signal transduction〔J〕.J Biol Chem,2010;285(43):32751-9.

〔2013-12-19修回〕

(編輯苑云杰)