補(bǔ)腎活血中藥復(fù)方對(duì)去卵巢大鼠骨密度和骨組織神經(jīng)肽Y的影響

補(bǔ)腎活血中藥復(fù)方對(duì)去卵巢大鼠骨密度和骨組織神經(jīng)肽Y的影響

朱曉峰王廷春1楊麗2王攀攀張榮華2

(暨南大學(xué)附屬第一醫(yī)院，廣東廣州510630)

摘要〔〕目的探討補(bǔ)腎活血中藥復(fù)方對(duì)去卵巢大鼠骨密度及血漿和骨組織神經(jīng)肽Y(NPY)的影響及對(duì)防治骨質(zhì)疏松的作用機(jī)制。方法選擇6月齡SD雌性大鼠32只，隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組、補(bǔ)腎活血中藥復(fù)方低劑量組和高劑量組。模型組、復(fù)方低劑量組與高劑量組均行雙側(cè)去卵巢手術(shù)，手術(shù)1 w后中藥復(fù)方低、高劑量組用灌胃法1.16 g/100 g和10.44 g/100 g給服中藥，模型組灌服生理鹽水，12w后觀察各組大鼠骨密度的改變，采用實(shí)時(shí)熒光定量(RT-PCR)檢測(cè)骨組織NPY mRNA的表達(dá)美聯(lián)免疫吸附(ELISA)法檢測(cè)各組大鼠血漿和骨組織NPY含量，Western印跡檢測(cè)骨組織NPY的表達(dá)。結(jié)果與假手術(shù)組比較，模型組骨密度明顯降低(P<0.01)，骨組織中NPY蛋白和mRNA的表達(dá)量明顯升高(P<0.01)，血清和骨組織中NPY的含量也明顯升高(P<0.01)。中藥復(fù)方低劑量和高劑量組骨密度明顯高于模型組(P<0.01)，血漿和骨組織中NPY 蛋白和mRNA的表達(dá)量明顯降低 (P<0.01或0.05)，但仍高于假手術(shù)組(P<0.01)。結(jié)論補(bǔ)腎活血中藥復(fù)方能夠調(diào)節(jié)血漿和骨組織的NPY，這可能是其抗骨質(zhì)疏松的作用機(jī)理之一。

關(guān)鍵詞〔〕補(bǔ)腎活血中藥復(fù)方；骨質(zhì)疏松；神經(jīng)肽Y

中圖分類號(hào)〔〕R285〔文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼〕A〔

基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金(81173619，81473509)；廣東省自然科學(xué)基金(S2012040007531)

通訊作者：張榮華(1964-)，男，博士，教授，博士生導(dǎo)師，主要從事老年病研究。

Effects of Nourishing Kidney and Activating Blood Recipe on bone mineral density and NPY in plasma and bone tissue in ovariectomized rats

ZHU Xiao-Feng,WANG Ting-Chun,YANG Li,etal.

Traditional Chinese Medicine Department,the First Affiliated Hospital,Jinan University,Guangzhou 510630，Guangdong,China

Abstract【】ObjectiveTo investigate the effects of Nourishing Kidney and Activating Blood Recipe (NKABR) on bone mineral density and the levels of neuropeptide Y (NPY) of plasma and bone tissue in ovariectomized rats. Methods32 SD rats were randomly divided into sham-operated,model,NKABR low-dose and high-dose groups. After ovariectomy 1 w，NKABR groups were given intragastric administration with different doses of NKABR,model group was given normal physiological saline. After 12 w,the changes of bone mineral density was observed,the levels of NPY mRNA or protein in plasma and bone tissue were measured by real-time RT-PCR,ELISA or Western blot. ResultsCompared with that of sham-operated group,BMD of model group was decreased significantly (P<0.01),the levels of NPY mRNA and protein of serum or bone tissue were increased significantly(P<0.01).The bone mineral density of NKABR low dose and high dose group were significantly higher than those of model group(P<0.01),the levels of NPY mRNA and protein of plasma or bone tissue were significantly lower than those of model group (P<0.01 or 0.05),but still higher than those of sham-operated group(P<0.01). ConclusionsNKABR could regulate level of NPY,which might be one of anti-osteoporosis mechanisms.

【Key words】Nourishing Kidney and Activating Blood Recipe; Bone mineral density; Neuropeptide Y

1天津中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合博士后流動(dòng)站

2暨南大學(xué)藥學(xué)院中藥學(xué)教研室

第一作者：朱曉峰(1975-)，男，博士，副主任醫(yī)師，主要從事老年病的研究。

研究發(fā)現(xiàn)一些神經(jīng)肽類物質(zhì)如降鈣素基因相關(guān)肽(CGRP)、P物質(zhì)(SP)、神經(jīng)肽Y(NPY)和血管活性腸肽(VIP)等介導(dǎo)神經(jīng)骨骼信號(hào)在骨代謝中發(fā)揮著重要作用，它們通過調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞活性及骨組織微循環(huán)參與骨代謝〔1,2〕。研究發(fā)現(xiàn)對(duì)骨質(zhì)疏松有明確療效的補(bǔ)腎活血中藥復(fù)方(益骨膠囊)可緩解骨痛，調(diào)節(jié)性激素水平，影響骨組織內(nèi)的相關(guān)神經(jīng)遞質(zhì)，并可以調(diào)節(jié)血漿和骨組織中的CGRP和SP〔3,4〕。NPY在骨代謝和脂質(zhì)代謝中也起著關(guān)鍵作用〔5〕，本研究通過探討補(bǔ)腎活血復(fù)方對(duì)去卵巢SD骨質(zhì)疏松大鼠血漿和骨組織中NPY的影響，進(jìn)一步闡述其調(diào)節(jié)神經(jīng)骨骼信號(hào)防治骨質(zhì)疏松的作用機(jī)制。

1材料和方法

1.1實(shí)驗(yàn)藥物補(bǔ)腎活血中藥復(fù)方(益骨膠囊)藥物由淫羊藿、杜仲、當(dāng)歸等8味藥組成。灌胃藥物參照既往制備工藝〔6〕。

1.1.1主要試劑戊巴比妥鈉(上海化學(xué)試劑廠)；注射用青霉素鈉(華北制藥股份有限公司)；NPY ELISA檢測(cè)試劑盒(Abnova)；ECL 發(fā)光試劑盒(Pierce)；β-tubulin兔抗大鼠Ⅰ抗、NPY兔抗大鼠Ⅰ抗、羊抗兔Ⅱ抗(Santa Cruz)。SDS、丙烯酰胺、甲叉雙丙烯酰胺、考馬斯亮藍(lán)G250(AMRESCO)；PVDF膜(Axygen)。

1.1.2主要儀器Prodigy型雙能X線骨密度儀(Lunar)；2-16K型高速冷凍離心機(jī)(Sigma)；PTC-200型梯度PCR儀、垂直電泳槽、轉(zhuǎn)移電泳槽、Model680型酶標(biāo)儀(Bio-Rad)；BT2202s型電子分析天平(Sartorious)。

1.1.3實(shí)驗(yàn)動(dòng)物6月齡SD雌性大鼠，體重(280±20)g，購于廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào)；SCXK(粵)2008-0002。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1分組與模型制備將32只6月齡SD雌性大鼠隨機(jī)分假手術(shù)組、模型組、補(bǔ)腎活血中藥復(fù)方低劑量組和高劑量組，每組8只。進(jìn)行雙側(cè)卵巢切除術(shù)〔4〕：各組動(dòng)物均以2%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉，將大鼠取仰臥位，固定四肢、頭部于動(dòng)物手術(shù)臺(tái)上，術(shù)區(qū)剃毛，消毒，鋪手術(shù)孔巾，取大鼠下腹部正中，沿腹白線縱行切口2～3 cm，切開皮膚及皮下組織，鈍性分離肌肉，打開腹腔，找到雙側(cè)卵巢，提起卵巢，用手術(shù)線將其周圍相連血管及輸卵管結(jié)扎，后切除，切口縫合，消毒，假手術(shù)組做同樣切口，找到卵巢后不切除直接縫合，術(shù)后均予青霉素10萬單腹腔注射3 d預(yù)防感染。

1.2.2給藥方法手術(shù)1 w后開始給藥，大鼠灌胃給藥，參考既往研究文獻(xiàn)〔4〕，低劑量按人日用臨床劑量，經(jīng)人-大鼠體表面積比值折算，1.16 g/100 g給藥，高劑量組予低劑量的6倍(10.44 g/100 g)，空白組予以同等體積的生理鹽水，1次/d。

1.2.3骨密度檢測(cè)灌胃12 w后，2%戊巴比妥鈉腹腔內(nèi)注射麻醉，四肢展開平置于Prodigy型雙能X線骨密度儀平臺(tái)上檢測(cè)骨密度。

1.2.4血漿和骨組織NPY含量的檢測(cè)檢測(cè)骨密度后進(jìn)行心臟采血，將心液注入含7.5%乙二胺四乙酸(EDTA)30 μl和抑肽酶40 μl的預(yù)冷試管(4℃)內(nèi)，3000 r/min 4℃離心10 min，取上清注入預(yù)冷的試管(4℃)內(nèi)，存于-80℃冰箱待測(cè)。酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)法測(cè)定血漿NPY含量，均按說明書進(jìn)行。

大鼠處死后置于冰上，迅速取出雙側(cè)股骨頭，用濾紙吸干表面液體，將股骨頭用電子天平稱重后，置于盛有液氮的研缽內(nèi)用手術(shù)剪剪碎，移入勻漿器內(nèi)，每100 mg組織加入1 ml生理鹽水，冷凍勻漿，將勻漿后液體分裝入離心管內(nèi)，3 000 r/min 4℃離心10 min，取上清液置于-80℃的冰箱中保存待測(cè)。檢測(cè)方法同血漿中NPY的檢測(cè)。

1.2.5骨組織NPY mRNA檢測(cè)采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法，取大鼠股骨頭大鼠處死后取出雙側(cè)股骨頭，電子天平稱重后，置于盛有液氮的研缽內(nèi)用手術(shù)剪剪碎，移入勻漿器內(nèi)，每100 mg組織加入1 ml生理鹽水，冷凍勻漿用TRIzol法提取總RNA，紫外分光光度計(jì)在UV260/280下測(cè)定純度并定量。步驟包括逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)；PCR反應(yīng)；染料法(SYBR Green I)相對(duì)定量分析，實(shí)驗(yàn)按照△△Ct解析法設(shè)計(jì)。擴(kuò)增條件：95℃預(yù)變性10 min，(95℃變性10 s,60℃退火30 s,72℃延伸15 s)×40個(gè)循環(huán)。以GAPDH為內(nèi)參照做平型管，根據(jù)GenBank網(wǎng)站中大鼠的NPY的基因序列(NM_012614)和內(nèi)參GAPDH的基因序列(NM_017008)，采用Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)引物。NPY引物序列：正義：5′-GTG TTT GGG CAT TCT GGC TG-3′，反義：5′- AGT GTC TCA GGG CTG GAT CT-3′，擴(kuò)增產(chǎn)物長度為159 bp；GAPDH引物序列：正義：5′- ACA TGC CGC CTG GAG AAA CCT -3′，反義：5′- GCC CAG GAT GCC CTT TAG TGG -3′，擴(kuò)增產(chǎn)物長度為90 bp。反應(yīng)結(jié)束后根據(jù)Ct值進(jìn)行計(jì)算和統(tǒng)計(jì)。

1.2.6骨組織NPY蛋白表達(dá)的檢測(cè)勻漿，用Western印跡檢測(cè)NPY蛋白的表達(dá)。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理使用SPSS16.0軟件，組間比較采用單因素方差分析，方差齊同的采用LSD檢驗(yàn)，方差不齊的采用Tamhane's方法。

2結(jié)果

2.1各組大鼠骨密度比較與假手術(shù)組〔(0.439±0.032)g/cm2〕比較，模型組大鼠骨密度〔(0.227±0.030)g/cm2〕明顯降低(P<0.01)，補(bǔ)腎活血中藥復(fù)方低、高劑量組骨密度〔(0.311±0.016)、(0.395±0.022)g/cm2〕均高于模型組(P<0.01)，但仍低于假手術(shù)組(均P<0.01)。

2.2各組大鼠血漿、骨組織NPY含量的變化與假手術(shù)組相比，模型組大鼠血漿和骨組織中NPY含量顯著升高(P<0.01)，用藥各組血漿和骨組織中NPY含量均顯著低于模型組，但仍高于假手術(shù)組(P<0.01)，見表1。

表1　各組大鼠血漿和骨組織中NPY含量

與假手術(shù)組比較:1)P<0.01；與模型組比較:2)P<0.01

1～4：假手術(shù)組、模型組、補(bǔ)腎活血復(fù)方低劑量組、補(bǔ)腎活血復(fù)方高劑量組 圖1　各組骨組織NPY蛋白的表達(dá)

2.3各組大鼠骨組織中NPY mRNA和蛋白相對(duì)表達(dá)的變化圖1，表2可見，與假手術(shù)組相比，模型組大鼠骨組織中NPY mRNA和蛋白的相對(duì)表達(dá)量顯著升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，用藥各組骨組織中NPY mRNA和蛋白的相對(duì)表達(dá)量均顯著低于模型組，但仍高于假手術(shù)組，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01或0.05)。

表2　各組大鼠骨組織NPY mRNA和蛋白相對(duì)

與假手術(shù)組比較:1)P<0.01；與模型組比較:2)P<0.01，3)P<0.05

3討論

近年來，神經(jīng)信號(hào)在調(diào)節(jié)骨量的作用上不取得突破，其中一個(gè)重要的介質(zhì)是NPY系統(tǒng)，NPY是一個(gè)由36個(gè)氨基酸組成的多肽，在中樞和周圍神經(jīng)系統(tǒng)中廣泛表達(dá)，通過G蛋白耦聯(lián)的受體在骨骼和能量代謝等許多生理過程中起著重要作用，其受體根據(jù)克隆的時(shí)間先后分別稱為Y1、Y2、Y4、Y5、Y6受體〔7,8〕。研究證實(shí)，NPY在骨和脂肪的形成中起著重要作用，側(cè)腦室注射NPY后野生型小鼠松質(zhì)骨體積明顯減少，NPY在下丘腦中過表達(dá)可以使成骨細(xì)胞活性下降7倍，尤其在皮質(zhì)骨以及松質(zhì)骨的表面情況更為明顯；NPY也存在于成骨細(xì)胞、骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞中，外周NPY在骨細(xì)胞中能通過旁分泌和自分泌起作用；NPY還能抑制骨髓基質(zhì)細(xì)胞向成骨樣細(xì)胞分化，研究顯示，NPY可以使顱骨的成骨細(xì)胞數(shù)量減少，但不能減少NPY1受體敲除小鼠成骨細(xì)胞的數(shù)量，在對(duì)成骨細(xì)胞活性的影響上，NPY可以減少成骨細(xì)胞骨鈣素和DMP-1基因的表達(dá)，減少礦化結(jié)節(jié)的形成〔9,10〕。NPY與雌激素也有密切的關(guān)系，研究發(fā)現(xiàn)雌激素可以通過影響NPY的表達(dá)從而影響體內(nèi)能量平衡〔11〕；NPY和雌激素可以共同調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞和脂肪細(xì)胞的形成，決定骨形成的方向〔12〕。

補(bǔ)腎活血復(fù)方由淫養(yǎng)藿、熟地、枸杞、牛膝等藥組成，具有補(bǔ)腎壯骨、活血止痛的功效，方中淫羊藿補(bǔ)腎壯骨為君藥，枸杞子滋陰柔肝補(bǔ)腎為臣藥，當(dāng)歸養(yǎng)血補(bǔ)血，又能活血止痛，補(bǔ)中有通，行中有補(bǔ)，再配合牛膝既補(bǔ)肝腎又引藥歸經(jīng)，對(duì)因虛而致瘀者可發(fā)揮治標(biāo)之用。研究顯示本方還可以提高骨組織Ⅰ型膠原mRNA和成骨細(xì)胞分化因子cbfα-1mRNA在去卵巢骨質(zhì)疏松大鼠骨組織的表達(dá)〔13,14〕，調(diào)節(jié)神經(jīng)骨骼信號(hào)中的CGRP和SP〔4〕，提高體外培養(yǎng)成骨細(xì)胞中骨形態(tài)發(fā)生蛋白2(bmp-2)和骨保護(hù)素(OPG)的表達(dá)〔15〕。

本研究說明了NPY升高可能是去卵巢大鼠雌激素降低后骨質(zhì)疏松的一個(gè)發(fā)病機(jī)制。另外降低NPY的表達(dá)可能是其抗骨質(zhì)疏松的作用機(jī)理之一。但是在本項(xiàng)研究中僅探討了NPY在骨組織和血漿中的變化，需進(jìn)一步研究NPY及其受體在骨質(zhì)疏松模型中中樞和周圍神經(jīng)系統(tǒng)及骨組織中的分布與變化，全面闡述NPY在骨質(zhì)疏松發(fā)病中的作用以及與雌激素之間的關(guān)系，進(jìn)一步探討細(xì)胞內(nèi)的分子信號(hào)傳導(dǎo)機(jī)制及的調(diào)節(jié)方式，為中醫(yī)學(xué)“腎主骨生髓，髓通腦”理論提供科學(xué)的闡釋。

4參考文獻(xiàn)

1Elefteriou F.Regulation of bone remodeling by the central and peripheral nervous system〔J〕.Arch Biochem Biophys,2008;473(2):231-6.

2Ma W,Zhang X,Shi S,etal.Neuropeptides stimulate human osteoblast activity and promote gap junctional intercellular communication〔J〕.Neuropeptides,2013;47(3):179-86.

3Zhang RH,Chen KJ,Lu DX,etal.A clinical study of yigu capsule in treating postmenopausal osteoporosis〔J〕.Chinese J Integr Med,2005;11(2)：97-103.

4朱曉峰，王廷春，張榮華，等.益骨膠囊對(duì)去卵巢大鼠骨密度及血漿和骨組織CGRP和SP含量的影響〔J〕.時(shí)珍國醫(yī)國藥，2012;23(5):1054-6.

5Wong IP,Nguyen AD,Khor EC,etal.Neuropeptide Y is a critical modulator of leptin's regulation of cortical bone〔J〕.J Bone Miner Res,2013;28(4):886-98.

6張榮華，彭柯萍，朱曉峰，等.益骨膠囊含藥血清對(duì)大鼠成骨細(xì)胞ERmRNA及其蛋白表達(dá)的影響〔J〕.中國中西醫(yī)結(jié)合雜志，2005;25(4):333-7.

7Shi YC,Baldock PA.Central and peripheral mechanisms of the NPY system in the regulation of bone and adipose tissue〔J〕.Bone,2012;50(2):430-6..

8Lee NJ,Herzog H.NPY regulation of bone remodelling〔J〕.Neuropeptides,2009;43(6):457-63.

9Lee NJ,Doyle KL,Sainsbury A,etal.Critical role for Y1 receptors in mesenchymal progenitor cell differentiation and osteoblast activity〔J〕.J Bone Miner Res,2010;25(8):1736-47..

10Khor EC,Baldock P.The NPY system and its neural and neuroendocrine regulation of bone〔J〕.Curr Osteoporos Rep,2012;10(2):160-8.

11Dufourny L,Warembourg M.Estrogen modulation of neuropeptides:somatostatin,neurotensin and substance P,in the ventrolateral andarcuate nuclei of the female guinea pig〔J〕.Neurosci Res,1999;33(3):223-8.

12Byerly MS,Al Salayta M,Swanson RD,etal.Estrogen-related receptor β deletion modulates whole-body energy balance via estrogen-related receptor γ andattenuates neuropeptide Y gene expression〔J〕.Eur J Neurosci,2013;37(7):1033-47.

13張榮華,彭勇,楊麗,等.益骨膠囊對(duì)去卵巢骨質(zhì)疏松大鼠骨組織Ⅰ型膠原mRNA表達(dá)的影響〔J〕.時(shí)珍國醫(yī)國藥，2005;16(10):941-3.

14黎波,張榮華.益骨膠囊對(duì)去卵巢骨質(zhì)疏松大鼠骨組織cbfα-1mNRA表達(dá)的影響〔J〕.中國病理生理雜志，2008;24(4):759-62.

15朱曉峰,王廷春,張榮華，等.益骨膠囊含藥血清對(duì)晚期糖基化終末產(chǎn)物作用下成骨細(xì)胞分化及BMP-2和OPG的影響〔J〕.中國中西醫(yī)結(jié)合雜志，2012;32(4):525-9.

〔2014-08-29修回〕

(編輯郭菁)