補(bǔ)充葡萄糖或低聚糖對動(dòng)情周期抑制大鼠瘦素水平的影響

李 合 ，王人衛(wèi) ，趙 璨 ，王超宇 ，劉曉麗 ，洪潤肖

運(yùn)動(dòng)性月經(jīng)周期紊亂是女性特殊的醫(yī)學(xué)問題，對女性的身心健康均有不利影響。調(diào)查研究發(fā)現(xiàn)，優(yōu)秀長跑運(yùn)動(dòng)員的運(yùn)動(dòng)性閉經(jīng)的發(fā)病率高達(dá)40%～50%[1]，大學(xué)生運(yùn)動(dòng)員運(yùn)動(dòng)性閉經(jīng)的發(fā)病率也高達(dá)31%[2]，參與休閑體育活動(dòng)的女性月經(jīng)周期紊亂發(fā)生率也普遍偏高，而普通女性月經(jīng)周期紊亂發(fā)生率僅為2%～5%[3]。運(yùn)動(dòng)性月經(jīng)周期紊亂起始于下丘腦功能紊亂，其促性腺激素釋放激素（GnRH）脈沖性釋放的情況直接關(guān)系到性腺軸調(diào)節(jié)的正常與否。研究發(fā)現(xiàn)，下丘腦GnRH脈沖性釋放與瘦素（leptin）密切相關(guān)，下丘腦GnRH脈沖的釋放需葡萄糖氧化供能，葡萄糖進(jìn)入下丘腦是依賴于leptin的介導(dǎo)[4-6]，當(dāng)leptin水平較低時(shí)，下丘腦就因無足夠的葡萄糖供能而引起GnRH釋放失調(diào)。大負(fù)荷運(yùn)動(dòng)的女性和能量攝入受到限制或不足的女性，血液中l(wèi)eptin的濃度均降低。

近年越來越多的動(dòng)物和人類模型的研究資料都支持能量攝入不足而導(dǎo)致慢性能量負(fù)平衡[7]。但是，有關(guān)增加外源性可利用能量對leptin水平影響的研究卻鮮有報(bào)道。因此，本研究在不改變大鼠運(yùn)動(dòng)負(fù)荷、不使用藥物干預(yù)的情況下，參照王人衛(wèi)等建立動(dòng)情周期 （又名發(fā)情周期，是雌性哺乳類動(dòng)物擁有的一種生理性變化，類似人類月經(jīng)周期）抑制模型的方法[8]，即表現(xiàn)為陰道脫落細(xì)胞中、底層有核上皮細(xì)胞增多。通過6周的遞增負(fù)荷訓(xùn)練建立動(dòng)情周期抑制模型后，再進(jìn)行3周恒定負(fù)荷訓(xùn)練（以維持動(dòng)情周期抑制狀態(tài)），同時(shí)采取不同的干預(yù)措施。觀察在僅以補(bǔ)糖方式提供外源性可利用能量的情況下，動(dòng)情周期抑制大鼠的動(dòng)情周期恢復(fù)和血清leptin水平的改變情況，探討能否通過補(bǔ)充外源性能量改善leptin水平，進(jìn)而促進(jìn)動(dòng)情周期抑制的緩解，并進(jìn)一步分析哪種補(bǔ)糖效果較好。

1 研究對象與方法

1.1 研究對象

選取健康成熟2月齡雌性SD大鼠45只，由上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物資源中心西普爾—必凱實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供，生產(chǎn)許可證號(hào)是SCXK（滬）2008-0016，利用符合國家飼料衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)的嚙齒類動(dòng)物飼料 （由上海仕林生物科技有限公司提供，產(chǎn)品標(biāo)準(zhǔn)編號(hào)：Q/TJCX 1-2007），作為基礎(chǔ)標(biāo)準(zhǔn)飼料（1337KJ/100g）。干預(yù)所用的葡萄糖和低聚糖由河北華辰淀粉糖有限公司提供，生產(chǎn)許可證號(hào)是QS130123010057，質(zhì)量管理體系認(rèn)證證書編號(hào)為：00109Q23299R0M/1300。大鼠隨機(jī)分籠，每籠3只，自由飲食和飲水。室溫20～25℃，相對濕度55%～60%，每天光照12 h，從上午9:00至晚上21:00。本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)通過上海市營養(yǎng)學(xué)會(huì)醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)的鑒定并接受其監(jiān)督 （上海市營養(yǎng)學(xué)會(huì)醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì) [倫審]2013-002）。

1.2 研究方法

1.2.1 分組方法

45只2月齡SD雌性大鼠在適應(yīng)運(yùn)動(dòng)兩周后，隨機(jī)分為5組，每組9只。分為對照組C組，該組不進(jìn)行運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練；模型中組M組，該組進(jìn)行9周運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練，前6周為遞增負(fù)荷訓(xùn)練，后3周為恒定負(fù)荷訓(xùn)練。實(shí)驗(yàn)干預(yù)組分為3組，前6周為遞增負(fù)荷訓(xùn)練，后3周采取不同的干預(yù)方式，其中后3周安靜休息的為R組；繼續(xù)進(jìn)行3周恒定負(fù)荷訓(xùn)練，并進(jìn)行葡萄糖補(bǔ)充的為G組；繼續(xù)進(jìn)行3周恒定負(fù)荷訓(xùn)練，并進(jìn)行低聚糖補(bǔ)充的為O組（見圖1）。實(shí)驗(yàn)組的運(yùn)動(dòng)負(fù)荷方案同陽性對照組M組一致，后3周的恒定負(fù)荷采用的是第6周遞增負(fù)荷訓(xùn)練的方案。

圖1 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)Figure1 Experiment Design

1.2.2 干預(yù)方法

本實(shí)驗(yàn)?zāi)M田徑運(yùn)動(dòng)中周期性耐力跑的形式，參照Bedford動(dòng)物運(yùn)動(dòng)負(fù)荷標(biāo)準(zhǔn)[9]。每周訓(xùn)練6 d，休息 1 d，每天訓(xùn)練兩次，上下午各訓(xùn)練一次，第9周最后一天晚上再加訓(xùn)一次。在大鼠處死前安靜休息36 h，以消除運(yùn)動(dòng)應(yīng)激產(chǎn)生的影響，并禁食12 h。

對照組和實(shí)驗(yàn)組前6周均采用普食喂養(yǎng)，且均飲用純凈水；后3周實(shí)驗(yàn)組的G組和O組在普食喂養(yǎng)的基礎(chǔ)上，每天稱取 24 g葡萄糖（17.2 kJ/g）或低聚糖(17.2 kJ/g)，溶于200 ml溫水中，攪拌溶解后，供大鼠飲用，其余組仍飲用純凈水和普食喂養(yǎng)。

1.2.3 取材

大鼠稱重后，按40 mg/kg大鼠體重計(jì)算麻醉劑 （濃度10%水合氯醛）量，5min大鼠麻醉后，測量大鼠體長。將大鼠四肢固定在手術(shù)臺(tái)上，迅速打開腹腔，剝離下腔靜脈，用一次性負(fù)壓真空管采血5～8 ml后，取出腹壁、腎周圍及生殖器周圍脂肪等內(nèi)臟器官處的白色脂肪組織，并利用FA-2004型電子天平稱重并進(jìn)行記錄。血液樣本在低溫離心（3000r/min）15 min后，取上清液測定雌激素、孕酮和瘦素。

1.2.4 指標(biāo)檢測

雌二醇（E2）的測定使用免疫化學(xué)發(fā)光法，采用Beckman Coulter公司生產(chǎn)的 Access 2 immunoassay system （全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光免疫測定系統(tǒng)）測定，試劑盒由Beckman Coulter公司提供。孕酮（P）的測定使用雙抗體放射免疫分析法，γ記數(shù)儀采用中科院上海原子能所日環(huán)儀器廠所生產(chǎn)的（型號(hào)為SN695B型智能型）；孵育箱采用的是青島海爾公司生產(chǎn)的；移液器采用法國吉爾森Gilson公司生產(chǎn)的。瘦素（Leptin）的測定采用雙抗體兩步夾心酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA），采用 Thermo生產(chǎn)的酶標(biāo)儀測定（型號(hào)為MK3），試劑盒由美國R&D公司提供。

1.2.5 數(shù)據(jù)處理

采用spss20.0數(shù)據(jù)軟件包對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析處理，所得結(jié)果均以均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。組間差異采用單因變量方差分析進(jìn)行分析，兩兩比較采用Tukey法分析。P<0.05，具有顯著性差異。

2 研究結(jié)果

2.1 體重及內(nèi)臟脂肪含量的變化

由表1可見，各組大鼠體重在6周遞增運(yùn)動(dòng)負(fù)荷未采取恢復(fù)措施前，體重變化基本同C組一致，但自第七周開始，不同組別體重的變化趨勢開始不同，R組體重自第七周開始迅速增長，M組體重基本不再變化，而O、G組也呈增長趨勢，但無R組明顯。

各組大鼠實(shí)驗(yàn)前體重?zé)o顯著性差異（表2），但經(jīng)過運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練和不同干預(yù)措施后，實(shí)驗(yàn)結(jié)束后體重有顯著性差異。干預(yù)組中，除R組顯著高于C組外，G組和O組均顯著低于C組；而干預(yù)組各組均顯著高于M組。干預(yù)組各組間比較發(fā)現(xiàn)，R組均顯著高G組和O組，而G組和O組間無顯著性差異。

將大鼠體長、體重作為隨機(jī)變量，利用協(xié)方差統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)（表3），M組的內(nèi)臟脂肪含量顯著低于陰性對照組C組。而經(jīng)過3周的干預(yù)，實(shí)驗(yàn)干預(yù)組各組的內(nèi)臟脂肪含量均顯著高于M組，且R組的內(nèi)臟脂肪含量同C組相比較，無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；G組的內(nèi)臟脂肪含量同O組也無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2.2 血清leptin濃度的變化

表4為大鼠血清leptin濃度的變化，由表可見，M組的血清leptin濃度顯著低于其余4組。O組的血清leptin濃度顯著低于C組，而R組和G組的血清leptin濃度同C組無顯著性差異。O組、R組和G組之間血清leptin濃度無顯著性差異。

表4 各組大鼠血清leptin濃度的變化情況 (單位：μg/L)Table Ⅳ Serum Leptin Concentration Changes of the Different Group Rats(ug/L)

2.3 雌激素和孕激素的變化

由表5可見，各組大鼠血清E2存在顯著性差異。同C組相比較，只有M組大鼠血清E2濃度顯著低于C組,而其余組與C組相比，均無顯著性差異。R組和O組大鼠血清E2濃度顯著高于M組，而G組血清E2濃度與M組相比無顯著性差異。R組、O組及G組之間大鼠血清E2濃度無顯著性差異。

表5 各組大鼠血清E2濃度的變化情況 (單位：pg/ml)Table Ⅴ Serum E2Concentration Changes of the Different Group Rats(pg/ml)

由表6可見，各組大鼠血清P濃度存在顯著性差異。M組的血清P濃度顯著低于其余4組，而其余4組之間并無顯著性差異。

表6 各組大鼠血清P濃度的變化情況（單位：pg/ml）Table Ⅵ Serum P Concentration Changes of the Different Group Rats(pg/ml)

3 討論與分析

內(nèi)臟脂肪具有緩沖震蕩、保護(hù)內(nèi)臟器官，又具有提供能量、維持機(jī)體生命需要的作用。在外源性能量不足以維持運(yùn)動(dòng)和基本生理消耗時(shí)，內(nèi)臟脂肪則成為主要的供能物質(zhì)。研究發(fā)現(xiàn)，運(yùn)動(dòng)性月經(jīng)周期紊亂發(fā)生的主要原因在于機(jī)體可利用能量的不足[10]，作為機(jī)體能量的存儲(chǔ)器，內(nèi)臟脂肪對維持月經(jīng)周期正常具有重要作用。研究報(bào)道，普通大學(xué)生內(nèi)臟脂肪含量高于體育專業(yè)女生含量，而體育專業(yè)女生月經(jīng)失調(diào)的比例遠(yuǎn)高于普通大學(xué)生[11]。女性運(yùn)動(dòng)員在長期可利用能量不足的情況下，機(jī)體動(dòng)員內(nèi)臟脂肪分解，導(dǎo)致內(nèi)臟脂肪含量下降，運(yùn)動(dòng)性月經(jīng)周期紊亂發(fā)生比例升高。由本研究可見，通過安靜休息、補(bǔ)充低聚糖或葡萄糖，均減少了內(nèi)臟脂肪的消耗。

近年研究發(fā)現(xiàn)，內(nèi)臟脂肪除上述功能外，還能夠以自分泌、旁分泌、遠(yuǎn)距分泌的方式產(chǎn)生生物活性因子，具有免疫、調(diào)節(jié)機(jī)體能量平衡、影響生殖功能等作用。因此，內(nèi)臟脂肪不僅具有儲(chǔ)存能量作用，也有“內(nèi)分泌器官”的分泌功能。leptin是由脂肪細(xì)胞分泌的一種多肽類激素，與其受體結(jié)合后，具有抑制食欲、減少能量攝入、增加能量消耗等多種生物學(xué)效應(yīng)。研究發(fā)現(xiàn)，對小鼠腦室注射leptin后減少了食物的攝取，導(dǎo)致體重的下降，表明leptin能直接作用于中樞神經(jīng)系統(tǒng)的leptin受體，傳達(dá)給中樞神經(jīng)系統(tǒng)機(jī)體能量儲(chǔ)存信號(hào)[12-14]。人在進(jìn)入青春期后，血清中l(wèi)eptin的水平顯著升高，并且女性的leptin水平通常是男生的2～3倍[15]。離體的實(shí)驗(yàn)研究表明，leptin能夠直接作用于下丘腦和腦垂體，刺激GnRH和LH的釋放[16]。循環(huán)血液中l(wèi)eptin水平通常與體內(nèi)儲(chǔ)存的脂肪量保持在一定比例，一定量的leptin進(jìn)入大腦，通過與下丘腦內(nèi)的leptin受體結(jié)合控制食物的攝取和能量的消耗[4]。循環(huán)血清中的leptin水平反映了脂肪儲(chǔ)存的能量以及在能量攝入時(shí)的急劇變化[16]，進(jìn)行劇烈運(yùn)動(dòng)的大鼠和能量攝入受到限制或不足的女性，循環(huán)血液中的leptin水平減少并伴有內(nèi)分泌異常，對性腺軸和甲狀腺軸有較大的影響。下丘腦GnRH脈沖性釋放與leptin密切相關(guān)，研究發(fā)現(xiàn)下丘腦GnRH脈沖的釋放需葡萄糖氧化供能，葡萄糖進(jìn)入下丘腦是依賴于leptin的介導(dǎo)[4]，所以當(dāng)leptin水平較低時(shí)，下丘腦因無足夠的葡糖糖供能而引起GnRH釋放的紊亂。因此，當(dāng)內(nèi)臟脂肪過度消耗時(shí)，leptin的分泌受到影響，直接影響哺乳動(dòng)物的生殖功能[17]，導(dǎo)致閉經(jīng)的發(fā)生。

本研究發(fā)現(xiàn)，模型組的leptin水平顯著低于對照組。采用安靜休息、補(bǔ)充低聚糖和葡萄糖等干預(yù)措施組的lep tin水平均較模型組顯著升高，表明通過安靜休息或補(bǔ)糖干預(yù)，能有效減緩leptin水平下降。同時(shí)，伴隨血清leptin濃度的升高，安靜休息組、補(bǔ)充低聚糖組和補(bǔ)充葡萄糖組大鼠的血清E2、P濃度也升高，表明大鼠動(dòng)情周期抑制逐步緩解。

4 結(jié)論

通過對動(dòng)情周期抑制大鼠補(bǔ)充葡萄糖或低聚糖，增加了內(nèi)臟脂肪含量，促進(jìn)了瘦素的分泌和雌激素、孕激素的合成，有效緩解大鼠的動(dòng)情周期抑制。補(bǔ)充兩種糖之間的效果無顯著性差異。

[1] Gibbs JC,Williams NI,Desouza MJ.(2013).Prevalence of in dividual and combined components of the female athlete triad[J].Medicine and science in sports and exercise,45(5):985-96.

[2] Beals KA,Manore MM.(2002).Disorders of the female athlete triad among collegiate athletes[J].Int J Sport Nutr Exerc Metab,12(3):281-293.

[3] Warren MP,Perlroth NE.(2001).The effects of intense exercise on the Female reproductive system[J].Journal of Endocrinology,170(1):3-11.

[4] Roubos EW,Dahmen M,et al.Leptin and the hypothalamo-pituitary-adrenal stress axis[J].Gen Comp Endocrinol.2012,177(1):28-36.

[5] Von Schnurbein J,Moss A,Nagel SA,Muehleder H,et al.(2012).Leptin substitution results in the induction of menstrual cycles in an adolescent with leptin deficiencyand hypogonadotropic hypogonadism[J].Horm Res Paediatr,77(2):127-33.

[6] Chou SH,Chamberland JP,Liu X,et al.(2011).Leptin is an effective treatment for hypothalamic amenorrhea[J].Proc Natl Acad Sci USA,108(16):6885-90.

[7] Can Zhao,Xiao-Li Liu,Run-Xiao Hong,et al.(2014).Effects of carbohydrate supplements on exercise-induced menstrual dysfunction and ovarian subcellular structural changes in rats[J].Journal of Sport and Health Science,3(3):189-195.

[8] 王人衛(wèi),陸愛云,陳佩杰,等.遞增負(fù)荷的運(yùn)動(dòng)性閉經(jīng)模型的建立[J].中國運(yùn)動(dòng)醫(yī)學(xué)雜志,2000,19(3):293-296.

[9] Bedford TG,Tipton CM,Wilson NC,et al.(1979).Maximum oxygen consumption of rats and its changes with various experimental procedures[J].J Appl Physiol Respir Environ Exerc Physiol,47(6):1278-83.

[10]Nattiv A,Loucks AB,Manore MM,et al.(2007).American College of Sports Medicine position stand:The female athlete triad[J].Medicine and science in sports and exercise,39(10):1867-82.

[11]趙文艷,魏亞茹,常鳳,等.高水平大學(xué)生運(yùn)動(dòng)員身體成分的調(diào)查[J].吉林體育學(xué)院學(xué)報(bào),2011,27(1):92-94.

[12]Roubos EW,Dahmen M,Kozicz T,et al.(2012).Leptin and the hypothalamo-pituitary-adrenal stress axis[J].Gen Comp Endocrinol.177(1):28-36.

[13]Campfield LA,Smith FJ,Guisez Y,et al.(1995).Recombinant mouse ob protein–evidence for a peripheral signal linking adiposity and central neural networks[J].Science,269(5223):546-549.

[14]Cottrell EC,Mercer JG.(2012).Leptin receptors[J].Handb Exp Pharmacol,(209):3-21.

[15]Mary JS,Nancy W.(2004).Physiological aspects and clinical sequelae of energy deficiency and hypoestrogenism in exercising women[J].Human Reproduction Update,5:433-448.

[16]Mcneil J,Doucet魪.(2012).Possible factors for altered energy balance across the menstrual cycle:a closer look at the severity of PMS,reward driven behaviors and leptin variations[J].Eur J Obstet Gynecol Reprod Biol,163(1):5-10.

[17]Watanobe H.(2002).Leptin directly acts within the hypothalamus to stimulate gonadotropin-releasing hormone secretion in vivo in rats[J].J Physiol.545:255-68.