缺素對土沉香幼苗生長和葉片解剖結(jié)構(gòu)的影響

賈曉紅，周再知，梁坤南，余雪標，張金浩

(1.中國林業(yè)科學研究院熱帶林業(yè)研究所，廣東廣州510520;2.海南大學農(nóng)學院，海南海口570228;3.海南大學環(huán)境與植物保護學院，海南?？?70228)

土沉香(Aquilariasinensis(Lour.)Gilg)(別名白木香、女兒香、牙香樹、莞香、六麻樹，為瑞香科(Thymelaeaceae)沉香屬(Aquilaria spp.)常綠喬木，樹皮灰褐色至灰黑色，平滑或有縱皺紋[1－3]，是我國特有的珍貴藥用植物[4－5].主要分布于廣東省從化、東莞、惠州、高州，海南省安定、保亭、昌江和儋州等地以及云南、廣西、福建、臺灣等省區(qū).土沉香樹脂(沉香)具有較高的藥用價值[4，6－7]，隨其市場價格的不斷攀升[8]，其天然林的亂砍濫伐現(xiàn)象日趨嚴重.生境的不斷破壞和病蟲害的發(fā)生，加之天然更新能力弱[9]，導致土沉香野生資源不斷減少，發(fā)展培育土沉香人工林勢在必行.近年來，對土沉香研究的力度逐漸加大.楊曉清等[10]以土沉香3個種源的幼苗為供試材料，研究了氮素營養(yǎng)與水分脅迫對土沉香不同種源幼苗相關生理生化指標的耦合影響.萬文生等[11－12]通過測定土沉香幼苗在鹽分脅迫下的生長與生理特征，探討其耐鹽性.原慧芳等[13]以不同光強適應生長1 a后的4個土沉香種源幼苗為研究對象，對干季和雨季時幼苗葉片進行多項生理生化指標的測定.而在礦質(zhì)營養(yǎng)診斷和葉片解剖結(jié)構(gòu)的生理響應研究上，尚未見報道.本文采用溫室水培法，觀測土沉香幼苗在不同缺素情況下(即缺乏氮、磷、鉀、鈣、鎂、鐵、錳、硼、鋅)的生長指標和葉片解剖結(jié)構(gòu)，探討其生理適應機制，為土沉香缺素癥狀的快速診斷和合理施肥提供依據(jù).

1 材料與方法

1.1 供試材料

采用長勢良好、大小均一(平均高度9.2 cm，地徑2.1 mm)的海南澄邁土沉香實生苗幼苗，用去離子水洗凈根部，置于圓形黑色容器(19 cm×20 cm，容積5 L)內(nèi)，用海綿固定幼苗，在中國林業(yè)科學研究院熱帶林業(yè)研究所溫室內(nèi)進行懸浮培養(yǎng).

1.2 方法

1.2.1 試驗設計 試驗采用隨機區(qū)組設計，重復3次，每個處理3株苗.9個處理分別表示如下.處理1:缺氮處理.處理2:缺磷處理.處理3:缺鉀處理.處理4:缺鈣處理.處理5:缺鎂處理.處理6:缺鐵處理.處理7:缺錳處理.處理8:缺硼處理.處理9:缺鋅處理.對照為全素營養(yǎng)液處理.

移苗后用1/2濃度的全營養(yǎng)液[14]培養(yǎng)1周;從第2周起，分成9個處理組，采用全濃度方法培養(yǎng).容器內(nèi)營養(yǎng)液以淹沒土沉香幼苗根系為宜，培養(yǎng)期間每天充氧氣1次，持續(xù)45 min，每隔1周換1次營養(yǎng)液，并及時清理水箱內(nèi)的青苔.定期用NaOH或HCl溶液調(diào)整箱內(nèi)pH值至6.5，減少光照溫度等外因的干擾，并保持溫室內(nèi)衛(wèi)生清潔、通氣良好.試驗期間，溫室不使用人工光源，白天平均溫度應保持在23－38℃，平均濕度保持在54% －78%.試驗時間為2012年9月至2013年6月，持續(xù)9個月，觀測不同缺素處理幼苗的表型特征.收獲時測定幼苗的苗高、地徑、生物量，以及植株葉片的解剖結(jié)構(gòu).

1.2.2 取樣調(diào)查與指標測定 分別在移苗初期和試驗結(jié)束時，測量全部幼苗的苗高、地徑，計算苗高、地徑的增量.

試驗結(jié)束，測定根、莖、葉及整個植株的鮮重，在70℃烘箱中烘至恒重，分別測定根、莖、葉以及整個植株的干重.根據(jù)下列公式計算生物量分配參數(shù):根生物量比(root mass ratio，RMR)=根重/植株總重;莖生物量比(stem mass ratio，SMR)=莖重/植株總重;葉生物量比(leaf mass ratio，LMR)=葉重/植株總重[15].

葉片結(jié)構(gòu)的觀察:用石蠟切片法對不同缺素的葉片制作土沉香葉片切片，并用QLYMPUS-BX41型號顯微鏡進行觀察，采用MShot Digital Imaging System進行葉片解剖結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)標定.

1.2.3 數(shù)據(jù)處理 用Excel 2007軟件對數(shù)據(jù)進行整理、統(tǒng)計，用SPSS 18.0進行方差分析和Duncan多重比較.

2 結(jié)果與分析

2.1 不同缺素處理下土沉香幼苗的癥狀表現(xiàn)

不同缺素處理下土沉香幼苗的癥狀表現(xiàn)各異.缺氮癥狀出現(xiàn)最快，培養(yǎng)3個月左右老葉失綠，新葉發(fā)黃;4.5個月后開始出現(xiàn)新葉，呈淡黃色，葉脈突出，老葉也發(fā)黃，而且老葉葉尖干枯，繼而枯萎脫落.相對于其他缺素處理植株生長緩慢，偏矮小(圖1A).缺磷癥狀出現(xiàn)相對較快，4個月左右出現(xiàn)新葉失綠泛黃，老葉葉片發(fā)黃，葉脈突出;5.5個月左右老葉葉尖枯萎卷曲，呈褐色(圖1B).缺鉀癥狀出現(xiàn)相對較快，4.5個月左右新葉泛黃，老葉葉脈間失綠，葉脈明顯;5.5個月左右老葉出現(xiàn)葉邊緣向內(nèi)逐漸失綠現(xiàn)象，有的老葉葉片上出現(xiàn)黃褐色斑點(圖1C).缺鈣癥狀出現(xiàn)相對較快，5個月左右植株老葉葉片開始出現(xiàn)黃色銹斑，新葉失綠變黃;6個月左右，老葉葉片邊緣逐漸向內(nèi)枯萎，新葉呈淡黃色，而且根部開始出現(xiàn)腐爛現(xiàn)象(圖1D).缺鎂癥狀出現(xiàn)相對緩慢，6個月左右出現(xiàn)新葉泛黃，老葉葉脈突出;7個月左右老葉葉尖干枯且葉片向內(nèi)卷曲，新葉葉片缺綠泛黃(圖1E).缺鐵癥狀出現(xiàn)相對較快，4.5個月左右出現(xiàn)新葉泛黃發(fā)白，呈半透明狀，老葉失綠;5.5個月左右，老葉葉片上有壞死斑點，葉尖干枯，葉片邊緣向內(nèi)凹卷，與其他缺素處理植株相比，植株矮小(圖1F).缺錳癥狀表現(xiàn)相對緩慢，6.5個月左右出現(xiàn)新葉泛黃，老葉葉脈突出且葉脈間失綠，葉片邊緣干枯，葉片有褐色銹斑且向內(nèi)卷曲(圖1G).缺硼癥狀表現(xiàn)緩慢，6.5個月左右老葉上有褐色斑點且葉片自邊緣向內(nèi)逐漸變黃，葉脈突出，葉脈間失綠，葉間節(jié)縮短(圖1H).缺鋅癥狀出現(xiàn)相對緩慢，7個月左右出現(xiàn)新葉泛黃，老葉泛黃且葉片上有銹斑，葉脈突出，葉脈間失綠(圖1I).

圖1 缺素處理表現(xiàn)癥狀Fig.1 The symptoms of the treatments of mineral element deficiency

2.2 不同缺素處理對土沉香幼苗生長的影響

從表1可知，缺素處理對土沉香幼苗的苗高、地徑以及地上、地下部分生物量和總生物量均有顯著影響(P＜0.05).各個缺素處理中除處理9外，其他缺素處理的苗高增量均顯著低于對照，其中處理6的苗高增量最小，為2.50 cm，比對照下降了79.8%;處理1和處理7分別比對照下降了77.7%和74.4%.9個缺素處理之間，處理9的苗高增量與其他處理的差異顯著，是處理6的4.97倍，僅比對照下降了1.0%.

對照的地徑增量顯著高于各個缺素處理，9個缺素處理中處理6的地徑增量最小，僅為0.93 mm，比對照下降57.9%，處理1和處理7分別比對照下降46.6%和45.7%.9個缺素處理之間的地徑增量差異顯著，處理9地徑增量最大，是處理6(地徑增量最小)的1.94倍，僅比對照下降18.6%.

從表1可以看出，全素處理的地上部分生物量、地下部分生物量和總生物量均顯著高于各缺素處理(P ＜0.05)，其值分別為各部分生物量最小值的5.04 倍(處理1)、3.53 倍(處理3 和處理4)、4.07 倍(處理1和處理2).總之，9個缺素處理中，對地上部分、地下部分生物量和總生物量影響較大的分別是處理1、處理2、處理3和處理4;各缺素處理之間地上部分生物量與總生物量差異顯著，且其最大值(處理7)為最小值(處理1)的4.61倍和3.62倍;而地下部分生物量差異不顯著.

2.3 不同缺素處理對土沉香幼苗生物量分配的影響

由圖2可知，缺素處理顯著影響土沉香幼苗生物量的器官分配比例(P＜0.05).各缺素處理的根、莖、葉生物量比與對照相比，分別下降 0.06 －0.44 g·g－1、0.02 －0.08 g·g－1、0.05 －0.48 g·g－1.其中處理 9的根生物量比最小，為0.20 g·g－1，約占對照的1/3左右;處理2的根生物量比最大，是對照的1.19倍，與處理1相比差異不顯著，但與其他處理差異顯著.處理2的莖生物量比最小，約占對照的4/5左右;處理5的莖生物量比最大，是對照的1.36倍，與處理1、處理2、處理8的差異顯著.處理2的葉生物量比最小，為0.03 g·g－1，僅為對照的1/18左右;處理9的葉生物量比最大，是對照的1.10倍，與其他8個缺素處理的差異顯著.

表1 不同缺素處理對土沉香幼苗生長指標的影響1)Table 1 Effects of nutrient deficiency treatments on the growth of A.sinensis seedlings

圖2 不同缺素處理對土沉香幼苗生物量分配的影響Fig.2 Effects of different nutrient deficiency on biomass allocation of A.sinensis seedlings

2.4 不同缺素處理對土沉香幼苗葉片解剖結(jié)構(gòu)表皮細胞的影響

通過觀察對照葉片解剖結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)，土沉香幼苗葉片具有典型的雙子葉植物葉片的組織結(jié)構(gòu).葉片上表皮和下表皮均由單行大小不等、形狀不規(guī)則的細胞組成;在葉片上表皮內(nèi)整齊緊密地排列著由1層柱狀細胞構(gòu)成的柵欄組織;海綿組織位于柵欄組織與下表皮之間，由大小不等、形狀多為橢圓的細胞疏松排列而成.土沉香幼苗經(jīng)過缺素處理后，其葉片內(nèi)部組織結(jié)構(gòu)的排列順序未發(fā)生變化，但是其葉片解剖結(jié)構(gòu)的細胞發(fā)生了變異.葉片解剖結(jié)構(gòu)顯示，缺素處理可使土沉香葉片的表皮細胞發(fā)生變異.從表2可以看出，構(gòu)成各組織的細胞厚度變異較大，各個處理的上表皮細胞厚度大小排列順序為:對照＞處理7＞處理6＞處理5＞處理9＞處理2＞處理3＞處理4＞處理1＞處理8，處理8的厚度比對照減小了33.3%.各個處理中土沉香幼苗葉片的下表皮細胞厚度大小排列順序為:處理9＞處理2＞處理5＞處理7＞對照＞處理6＞處理1＞處理4＞處理8＞處理3，其中處理9的下表皮細胞厚度最厚，達到22.67 μm，比對照大0.18倍;處理8的下表皮細胞厚度最薄，僅為14.79 μm，大約是對照的4/5左右.

2.5 缺素處理對葉片解剖結(jié)構(gòu)柵欄組織的影響

缺素處理下，土沉香葉片的柵欄組織細胞排列疏松，有的細胞形狀變異為錐形.而且各個處理中柵欄組織細胞厚度差異較大(表2)，其排列順序為:處理4＞處理7＞對照＞處理2＞處理5＞處理3＞處理1＞處理6＞處理9＞處理8.其中，處理4的柵欄組織細胞厚度最大，為35.16 μm，比對照增大10.6%;處理8的柵欄組織細胞厚度最小，為21.48 μm，比對照減小31.6%.

表2 缺素處理對土沉香幼苗葉片解剖結(jié)構(gòu)的影響Table 2 Effects of different nutrient deficiency on leaf anatomiacal structure of A.sinensis seedlings μm

2.6 缺素處理對葉片解剖結(jié)構(gòu)海綿組織的影響

各個處理中土沉香幼苗葉片的海綿組織細胞變異較大，其中處理5的海綿組織細胞形狀多為長柱形，處理6的海綿組織細胞較少，處理8的海綿組織多由2個細胞粘連在一起.各個處理的海綿組織細胞厚度小大排列順序為:處理6＞處理5＞處理2＞處理3＞處理1＞對照＞處理9＞處理7＞處理4＞處理8，其中處理6海綿組織細胞最厚，厚度為21.48 μm，比對照增大14.0%，處理4海綿組織細胞最薄，厚度為15.03 μm，比對照減小 18.7%(表 2).

3 討論

3.1 缺素處理對土沉香生長的影響

植物生長發(fā)育需要各種礦質(zhì)元素來維持正常的生理活動[16]，缺乏不同的礦質(zhì)元素對植株的生長發(fā)育會有一定的影響.本試驗結(jié)果表明，土沉香幼苗在缺乏不同營養(yǎng)元素的情況下，其表型和生長生理指標存在差異，其中影響最為顯著的是處理1和處理6.缺氮時，蛋白質(zhì)、核酸、磷脂等物質(zhì)的合成受阻，葉綠素的合成也會受到一定影響，致使植株生長矮小、枝葉發(fā)黃、葉片早衰干枯，這與檀香(Santalum album)苗木缺氮出現(xiàn)的表型癥狀[17]一致.鐵元素是葉綠素合成所必需的營養(yǎng)元素，直接影響植株葉綠體的構(gòu)造，因此缺乏鐵元素容易造成土沉香苗木葉片“黃葉病”的發(fā)生，這與柚木(Tectona grandis)苗木缺鐵表型癥狀[18]吻合.王金花等[19]在人工氣候室條件下，采用溶液培養(yǎng)法對缺鋅條件下的2種蘋果砧木幼苗進行研究，發(fā)現(xiàn)其均出現(xiàn)不同程度的植株矮小、新生葉片黃化且簇生、節(jié)間縮短、根尖膨大等缺鋅癥狀.缺鋅使灰楊(Populus×canescens)的根、葉、莖、皮鮮重顯著降低，莖直徑和葉片數(shù)顯著下降[20].本研究結(jié)果顯示，處理9的土沉香幼苗的苗高增量和葉片厚度等指標與對照沒有顯著差異，說明鋅元素對土沉香幼苗的生理生長影響較小，這與上述研究有所差異，可能是試驗樹種差異或者土沉香幼苗對于鋅元素營養(yǎng)缺乏反應遲鈍、養(yǎng)分吸收效率差等造成的.

3.2 缺素處理對土沉香生物量分配的影響

植物生長在缺素環(huán)境下，通常是通過生理生化作用進行自身調(diào)節(jié)的，進而在生物量分配方面得到體現(xiàn).因此，植物生物量分配可以作為反映植物受到缺素影響程度的重要指標，在一定程度上反映了其在不同生境條件下自身的生長發(fā)育狀況[15，21].本試驗結(jié)果表明，缺磷處理使土沉香幼苗通過調(diào)節(jié)其各部分生物量比值來適應缺素環(huán)境，這是由于缺磷時蛋白質(zhì)合成受阻，影響細胞分裂，因此地上部分生物量比減小.土沉香不同部位生物量分配差異的內(nèi)在原因尚不十分清楚，有待于進一步研究.

3.3 缺素處理對土沉香葉片解剖結(jié)構(gòu)的影響

吳月娥等[22]觀察了枇杷幼苗缺磷、鉀、鈣時的外部癥狀和內(nèi)部組織解剖結(jié)構(gòu)，結(jié)果表明缺素致使葉片柵欄組織、海綿組織發(fā)生變化.本研究結(jié)果表明，缺素環(huán)境下土沉香幼苗葉片組織解剖結(jié)構(gòu)的細胞發(fā)生了很大變異，導致其葉片的厚度有差異.而植物的葉片厚度反映葉肉細胞的數(shù)量，從而影響其他生長生理指標.其中影響最為明顯的是硼元素，它能參與植物糖的運轉(zhuǎn)與代謝，促進蔗糖的形成，而且還能抑制有毒酚類化合物的形成.在缺硼的環(huán)境下，土沉香幼苗葉片內(nèi)可能出現(xiàn)糖合成受阻、有毒酚類化合物含量增高等現(xiàn)象，從而葉片組織細胞結(jié)構(gòu)發(fā)生變異，其葉片組織排列疏松，葉片厚度大幅減小，從而導致其生理功能受到影響.

本試驗僅采用水培法對土沉香無性系幼苗進行缺素培養(yǎng)，其缺素表現(xiàn)癥狀出現(xiàn)緩慢，培養(yǎng)時間較長，主要原因可能是土沉香葉革質(zhì)耐貧瘠，對缺素培養(yǎng)的反應不靈敏.

[1]江蘇新醫(yī)學院.中藥大辭典[M].上海:人民出版社，1977.

[2]裘樹平，劉仲荃.中國保護植物[M].上海:上海科技教育出版社，1994.

[3]黃智慧.西盟縣土沉香人工培育技術(shù)[J].林業(yè)調(diào)查規(guī)劃，2006，131(6):81－84.

[4]傅立國，陳潭清，郎楷永，等.中國高等植物(七)[M].青島:青島出版社，2001:514－515.

[5]中國科學院北京植物研究所.中國高等植物圖鑒(第二冊)[M].北京:科學出版社，1972.

[6]馬華明，梁坤南，周再知，等.沉香形成機理研究探討[J].天然產(chǎn)物研究與開發(fā)，2010(22):280－282.

[7]李林海，壽海洋，馬清溫.土沉香(瑞香科)的地理分布研究[J].安徽農(nóng)業(yè)科學，2012，40(17):9254－9256.

[8]CHAKRABARTY K，KUMAR A，MENON V.Trade in agarwood[J].New Delhi Traffic India，1994，1:59.

[9]陸輝.淺議云南白木香的開發(fā)利用[J].林業(yè)調(diào)查規(guī)劃，2005，30(5):90－93.

[10]楊曉清，周再知，梁坤南，等.氮素對模擬脅迫下土沉香幼苗抗旱生理的影響[J].熱帶作物學報，2013，34(6):1121－1127.

[11]萬文生，秦武明，陳衛(wèi)國，等.鹽分脅迫對土沉香苗木生長和生理指標的影響[J].福建林業(yè)科技，2012，39(1):100－103.

[12]萬文生，覃靜，陳衛(wèi)國，等.Cd脅迫對土沉香幼苗生長及生理特性的影響[J].林業(yè)科技，2012，37(1):1－3.

[13]原慧芳，田耀華，岳海，等.不同遮蔭度下土沉香幼苗的生理特性響應[J].熱帶作物學報，2013，34(2):314－320.

[14]陳琳.西南樺苗期營養(yǎng)診斷與氮素施肥[D].北京:中國林業(yè)科學研究院，2010.

[15]趙則海.攀緣角度對五爪金龍形態(tài)、生物量分配及相對生長速率的影響[J].生態(tài)環(huán)境，2008，17(2):758－762.

[16]潘瑞熾.植物生理學[M].北京:高等教育出版社，2006:29－33.

[17]BARRETT D R，F(xiàn)OX J E D.Santalum album:kernel composition，morphological and nutrient characteristics of preparasitic seedling under various nutrient regimes[J].Annals of Botany，1997，79(1):59 －66.

[18]GOPIKUMAR K，VARGHESE V.Sand culture studies of teak(Tectona grandis)in relation to nutritional deficiency symptoms，growth and vigour[J].Journal of Tropical Forest Science，2004，16(1):46 － 61.

[19]王金花.缺鋅脅迫下蘋果砧木幼苗的形態(tài)與生理響應及IAA對其根系生長的調(diào)控[D].泰安:山東農(nóng)業(yè)大學，2012.

[20]張瑩.鋅脅迫對灰楊生理生化特性的影響[D].咸陽:西北農(nóng)林科技大學，2011.

[21]王俊峰，馮玉龍.光強對兩種入侵植物生物量分配、葉片形態(tài)和相對生長速率的影響[J].植物生態(tài)學報，2004，28(6):782－786.

[22]吳月娥，謝深喜.P、K、Ca缺失對枇杷幼苗生長發(fā)育及生理特性的影響[J].果樹學報，2006，23(1):55－58.