姐妹胚胎體外形成囊胚的時間、數(shù)量與D3胚胎移植結局關系的研究

尹太郎，丁錦麗，張怡，徐望明，龍文，楊菁

（武漢大學人民醫(yī)院生殖醫(yī)學中心，武漢 430060）

影響IVF-ET 臨床結局的因素較多，胚胎質量是一個重要因素［1］。有研究表明，將鮮胚移植后剩余的所有胚胎行囊胚培養(yǎng)，IVF-ET 后妊娠患者的剩余胚胎更容易形成囊胚，同周期中姐妹胚胎體外形成囊胚的潛能可以預測D3 移植胚胎的臨床結局［2-3］。但關于姐妹胚胎繼續(xù)培養(yǎng)形成囊胚的速度與胚胎移植結局的關系鮮有報道。本研究回顧性分析本中心2013年1月至2014年5月卵裂期胚胎移植后剩余的姐妹胚胎繼續(xù)囊胚培養(yǎng)的患者數(shù)據(jù)，研究姐妹胚胎體外形成囊胚的速度與D3胚胎移植后臨床結局的相關性，探索其對移植胚胎的臨床結局的預測作用。

資料與方法

一、研究對象

收集2013年1月至2014年5月在我院生殖醫(yī)學中心于D3行優(yōu)質新鮮胚胎移植、剩余姐妹胚胎繼續(xù)培養(yǎng)并形成囊胚的363 例患者的資料，納入134例鮮胚移植后剩余姐妹胚胎繼續(xù)培養(yǎng)無囊胚形成的患者作為對照。女方年齡20～42歲，不孕年限1～15年。不孕原因包括：子宮內(nèi)膜異位癥、盆腔輸卵管因素、排卵障礙；男方少、弱、畸精子癥及不明原因不孕。

二、治療方法回顧

1.促排卵及受精：采用我中心常規(guī)使用的方案促排卵，包括短方案、長方案及超長方案［4］。陰道B超發(fā)現(xiàn)3個以上直徑≥18mm 的卵泡時，肌注5 000～10 000U HCG（雪蘭諾，瑞士），36h后在陰道B 超下采卵。根據(jù)男方精子質量決定自然受精或卵胞漿內(nèi)單精子注射授精。

2.胚胎移植：所有患者均根據(jù)其年齡、內(nèi)膜準備情況等決定移植卵裂期胚胎數(shù)，移植2～3枚優(yōu)質胚胎。在移植后肌注黃體酮行黃體支持，具體參考本中心用藥方案［5］。

3.囊胚培養(yǎng)及凍存：將第3天移植后剩余的非優(yōu)質胚胎置入Quinn’s囊胚培養(yǎng)液（SAGE，美國）繼續(xù)囊胚培養(yǎng)。D5／D6評估形成囊胚的情況，將形成的囊胚冷凍。

4.胚胎質量評估：根胚胎形態(tài)學對D3胚胎進行評估，即評估時包含6個以上均勻一致的卵裂球且細胞碎片小于20%的胚胎定義為優(yōu)質胚胎，其余為非優(yōu)質胚胎［5］。按Gardner囊胚分級法［6］對D5／D6胚胎進行評分。

三、分析指標

本項研究收集了納入研究的女性的年齡、不孕年限、體重指數(shù)（BMI）、移植優(yōu)胚數(shù)、胚胎種植數(shù)、臨床妊娠例數(shù)以及剩余胚胎囊胚培養(yǎng)情況等資料。

胚胎移植后14d檢測血β-HCG＞10U／L，2周后B 超下見孕囊確定為臨床妊娠，孕28 周前妊娠丟失為早期流產(chǎn)。胚胎種植率定義為超聲掃描可見孕囊數(shù)／移植胚胎數(shù)；臨床妊娠率定義為臨床妊娠例數(shù)／總周期數(shù)；流產(chǎn)率為流產(chǎn)例數(shù)／臨床妊娠例數(shù)；多胎率為多胎例數(shù)／臨床妊娠例數(shù)（本研究中均為雙胎）；囊胚形成率為D5或／和D6形成的囊胚數(shù)／行囊胚培養(yǎng)的姐妹胚胎數(shù)。

四、統(tǒng)計學分析

應用SPSS 19.0統(tǒng)計學軟件進行分析。計量資料結果以均數(shù)±標準差表示，計數(shù)資料以率表示。定量資料比較采用t檢驗，定性資料的比較采用χ2檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

一、基本資料

共納入497個周期的患者資料，按姐妹胚胎培養(yǎng)后是否有囊胚形成分組，再根據(jù)觀察囊胚形成的時間分為D5組和D6組。若D5和／或D6有囊胚形成，則為囊胚形成組，反之為對照組；僅D5有囊胚形成為D5組，僅D6有囊胚形成為D6組，D5、D6均有囊胚形成為D5＋D6組。本研究中囊胚形成組363例，其中D5組107例，D6組144例，D5＋D6組112例。

囊胚形成組與對照組及D5、D6、D5＋D6 三個亞組與對照組組間女方年齡、不孕年限、不孕類型均無統(tǒng)計學差異（P＞0.05）；囊胚形成組的優(yōu)質胚胎數(shù)（5.00±2.78）顯著高于對照組（4.25±2.67）（P＜0.01），D5、D5＋D6 兩個亞組的優(yōu)質胚胎數(shù)（分別為5.08±2.92，5.40±2.83）也顯著高于對照組（4.25±2.67）（P＜0.05），D5＋D6組的優(yōu)質胚胎數(shù)還顯著高于D6組（P＜0.05），而D5組的優(yōu)質胚胎數(shù)（5.08±2.92）雖高于D6組（4.64±2.59），但差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）（表1）。

二、姐妹胚胎形成囊胚的情況與D3 胚胎移植結局的關系

囊胚形成組與對照組及D5、D6、D5＋D6 三個亞組與對照組組間移植的胚胎數(shù)無統(tǒng)計學差異（P＞0.05）。囊胚形成組與對照組的種植率（31.34% vs.19.41%）及 臨 床 妊 娠 率（50.14%vs.32.84%）均有統(tǒng)計學差異（P＜0.01）；D5、D6及D5＋D6 三 個 亞 組 種 植 率（分 別 為34.42%、29.01%、31.42%）及臨床妊娠率（分別為53.27%、47.92%、50.00%）均 顯 著 高 于 對 照 組（分 別 為19.41%、32.84%）（P＜0.01和P＜0.05）；囊胚形成組與對照組及D5、D6、D5＋D6三個亞組與對照組的組間流產(chǎn)率均無統(tǒng)計學差異（P＞0.05）（表2）。

三、姐妹胚胎囊胚形成個數(shù)與D3 胚胎移植結局的相關性

在363個有囊胚形成的周期中，形成囊胚的個數(shù)為1～10個。

線性回歸分析結果顯示，在形成0～7個囊胚的周期患者中，形成囊胚的個數(shù)與鮮胚種植率及臨床妊娠率呈顯著正相關（r＝0.749，P ＜0.05；r＝0.752，P＜0.05）（表3）。

形成8個囊胚者有2例，9個囊胚者1例，10個囊胚者1 例。該4 個周期共植入胚胎8 枚，著床3枚（種植率37.50%），臨床妊娠3例（臨床妊娠率75.00%）。由于例數(shù)較少，故未列入相關性分析。

四、非優(yōu)質胚胎數(shù)≥5的周期姐妹胚胎形成囊胚的情況與移植結局的關系

由于患者繼續(xù)囊胚培養(yǎng)的非優(yōu)質胚胎數(shù)量存在差別，少者僅有1個，多者有20個，為了避免繼續(xù)囊胚培養(yǎng)的非優(yōu)質胚胎基數(shù)不同為研究結果帶來的干擾，我們進一步選擇至少有5個非優(yōu)質胚胎行繼續(xù)培養(yǎng)的共382例患者作為研究對象，按照囊胚形成率進行分組：囊胚形成率≥40%為A 組，囊胚形成率20%～40%為B組，囊胚形成率＜20%為C組。

表1 患者基本資料［（±s），n（%）］

表1 患者基本資料［（±s），n（%）］

注：與對照組比較，＊P＜0.01，＊＊P＜0.05；與D5＋D6組比較，＃P＜0.05

組 別 周期數(shù) 年齡（歲） 不孕時間（年） 優(yōu)質胚胎（枚）原發(fā)不孕對照組 134 30.81±4.46 4.32±2.93 4.25±2.67 78（58.21）囊胚形成組 363 30.36±4.22 4.64±3.40 5.00±2.78＊ 178（49.04） D5組 107 30.57±4.37 4.24±3.41 5.08±2.92＊＊ 51（47.66） D6組 144 30.44±4.11 4.89±3.21 4.64±2.59＃ 76（52.78） D5＋D6組 112 30.06±4.24 4.70±3.61 5.40±2.83＊ 51（45.56）

A、B及C 組組間女方年齡及移植胚胎數(shù)均無統(tǒng)計學差異（P＞0.05）。A 組的種植率及臨床妊娠率均顯著高于B 組和C 組（P＜0.05）；B 組的種植率及臨床妊娠率較C 組有增高趨勢，但無統(tǒng)計學差異（P＞0.05）；A、B 及C 組組間的流產(chǎn)率及多胎率均無統(tǒng)計學差異（P＞0.05）（表4）。

表2 姐妹胚胎形成囊胚情況與D3移植結局（±s）

表2 姐妹胚胎形成囊胚情況與D3移植結局（±s）

注：與對照組比較，＊P＜0.01，＊＊P＜0.05

組 別 周期數(shù) 移植胚胎數(shù) 種植率（%） 臨床妊娠率（%） 流產(chǎn)率（%）對照組 134 2.02±0.19 19.41（53／273） 32.84（44／134） 13.63（6／44）囊胚形成組 363 2.02±0.15 31.34（230／734）＊ 50.14（182／363）＊ 15.38（28／182） D5組 107 2.00±0.10 34.42（74／215）＊ 53.27（57／107）＊ 10.52（6／57） D6組 144 2.04±0.18 29.01（85／293）＊ 47.92（69／144）＊＊ 14.49（10／69） D5＋D6組 112 2.02±0.13 31.42（71／226）＊ 50.00（56／112）＊ 10.71（6／56）

表3 D3胚胎移植結局與姐妹胚胎囊胚形成個數(shù)的關系（%）

表4 非優(yōu)質胚胎數(shù)≥5的周期姐妹胚胎形成囊胚情況與D3移植結局（±s，%）

表4 非優(yōu)質胚胎數(shù)≥5的周期姐妹胚胎形成囊胚情況與D3移植結局（±s，%）

注：與A 組比較，＊P＜0.05，＃P＜0.01

組 別 周期數(shù) 年齡（歲） 移植數(shù)（枚）種植率 臨床妊娠率 流產(chǎn)率 多胎率A 組 46 29.35±4.19 2.02±0.15 43.01（40／93） 67.39（31／46） 22.58（7／31） 29.03（9／31）B組 139 30.35±3.75 2.03±0.17 29.43（83／282）＊ 47.48（66／139）＊ 16.67（11／66） 24.76（17／66）C組 197 30.69±4.49 2.02±0.14 23.12（92／398）＃ 38.58（76／197）＃ 10.53（8／76） 21.05（16／76）

討 論

隨著不孕夫婦對人類輔助生育技術需求的增加，如何在提高臨床妊娠率的同時也減低多胎妊娠的風險是生殖醫(yī)學普遍關注的問題。囊胚移植較D3胚胎移植有更好的臨床結局，但周期取消的風險較大，所以部分中心選擇在D3 移植優(yōu)質胚胎后將剩余的胚胎繼續(xù)培養(yǎng)成囊胚后凍存，等待凍胚移植。對于姐妹胚胎體外培養(yǎng)的囊胚形成率及囊胚形成個數(shù)是否可以預測移植胚胎的發(fā)育、種植潛能尚無統(tǒng)一結論。

多項研究表明，姐妹胚胎體外培養(yǎng)的囊胚形成率及囊胚形成個數(shù)可以用于預測D3胚胎移植的臨床結局［3，7-8］。本研究回顧性分析了2013年1月至2014年5月在本中心行D3優(yōu)質胚胎移植，且剩余胚胎繼續(xù)培養(yǎng)的497個周期的數(shù)據(jù)，在不孕時間、女方年齡、不孕類型、移植胚胎數(shù)等基礎資料無顯著差異的情況下，姐妹胚胎繼續(xù)培養(yǎng)有囊胚形成組患者的種植率和臨床妊娠率均顯著高于對照組，其中D5、D6有囊胚形成的患者其D3移植周期的種植率及臨床妊娠率也顯著高于對照組。從趨勢上看，D5組鮮胚移植后的種植率及臨床妊娠率均高于D6組和D5＋D6組，且D5＋D6組的種植率及臨床妊娠率較D6組也有增高趨勢。D3 移植胚胎的種植率及臨床妊娠率均與姐妹胚胎培養(yǎng)形成囊胚的個數(shù)呈正相關。我們推測，囊胚形成組及亞組的種植率及妊娠率較無囊胚形成組高，可能的原因之一是有囊胚形成的患者其胚胎質量較好，正如本文表1所示，囊胚形成組及各亞組較無囊胚形成組獲得的優(yōu)質胚胎數(shù)更多。為了進一步探索姐妹胚胎的囊胚形成率與D3移植結局的相關性，我們將研究對象（囊胚培養(yǎng)的非優(yōu)質胚胎數(shù)≥5）按囊胚形成率分為3組（≥40%為A 組，介于20%～40%為B 組，＜20%為C組），統(tǒng)計結果顯示，A 組的D3 胚胎移植周期種植率及臨床妊娠率顯著高于B組及C 組，B組較C 組也有升高趨勢，表明姐妹胚胎囊胚形成率高的患者，D3移植后有較好的臨床結局，與早先的報道［9-10］結論一致。

發(fā)育速度較快的胚胎其存活能力更高，胚胎的發(fā)育速度可能用于預測其種植潛能［11-13］，在一定程度上可能是由于發(fā)育較慢的胚胎非整倍體的發(fā)生率更高［14］。結合本項研究結果，我們推測，姐妹胚胎的發(fā)育速度也可能用于預測D3胚胎移植后的臨床結局。胚胎在體外培養(yǎng)時間的延長可能選擇出更有發(fā)育潛能的胚胎。有文獻報道，發(fā)育潛能較差的胚胎可能停滯在基因組激活的卵裂期階段，體外繼續(xù)培養(yǎng)后能夠形成囊胚的胚胎，其染色體異常的比例更低［15］。胚胎質量、卵母細胞質量及培養(yǎng)環(huán)境等均可影響囊胚形成，其中以卵裂期胚胎的質量尤為重要，它不僅影響形成的囊胚的質量，也影響囊胚的形成率［16］。

卵裂期胚胎內(nèi)在質量可能直接決定其發(fā)育潛能［17］，從而影響胚胎移植后的臨床結局。一般而言，D3 移植的胚胎都是同期獲得的胚胎中質量較好、形態(tài)學評分較高的胚胎，因此，剩余姐妹胚胎體外培養(yǎng)成囊胚的能力就可能間接反映D3移植胚胎在體內(nèi)發(fā)育的潛能及其臨床結局［9］。在我們的研究中，姐妹胚胎有囊胚形成組較無囊胚形成的對照組D3移植后有較好的胚胎種植率及臨床妊娠率，因此，我們認為，姐妹胚胎體外培養(yǎng)形成囊胚的能力也可以間接反應D3移植胚胎在體內(nèi)發(fā)育的潛能及其臨床結局，這與國內(nèi)外多項研究結果一致［3，8-10］。關于剩余胚胎形成囊胚的能力對臨床妊娠的預測作用，國外數(shù)據(jù)研究表明，其陰性預測率為82%，陽性預測率為60%［18-19］。

囊胚的發(fā)育速度可以預測胚胎的著床潛能，發(fā)育速度越慢，妊娠率則越低［20］。Alfarawati等［14］活檢滋養(yǎng)層細胞對囊胚進行染色體分析后發(fā)現(xiàn)，發(fā)育遲緩的囊胚，其非整倍體的發(fā)生率更高。本研究結果提示，囊胚形成各亞組（D5 組、D6 組及D5＋D6組）患者的胚胎種植率及臨床妊娠率均顯著高于對照組，各亞組間的種植率及臨床妊娠率雖無統(tǒng)計學差異，但D5 組較D6 組及D5＋D6 組均有升高趨勢，且D5＋D6組較D6組也有增高趨勢，我們認為姐妹胚胎培養(yǎng)形成囊胚的速度也能預測D3移植后的臨床結局。

姐妹胚胎繼續(xù)培養(yǎng)形成囊胚的個數(shù)也與D3移植胚胎的種植率及臨床妊娠率相關。有研究表明，單囊胚移植后剩余胚胎繼續(xù)培養(yǎng)后冷凍，冷凍的囊胚個數(shù)與種植率及活嬰出生率顯著相關，且種植率及活嬰出生率隨著冷凍囊胚個數(shù)的增加而增加［8，10］。在本研究中，姐妹胚胎繼續(xù)培養(yǎng)形成囊胚的個數(shù)在1～10個之間，由于囊胚數(shù)＞7個的周期只有4個，故未納入進行相關性分析。我們的結果顯示，姐妹胚胎形成囊胚的個數(shù)與D3 移植胚胎的種植率及臨床妊娠率顯著正相關。這與Hill等［8］提出的“形成囊胚的個數(shù)也與胚胎種植率和臨床妊娠率呈顯著正相關”結論一致。本研究中，囊胚個數(shù)為6時，種植率及臨床妊娠率均達到了最大值，分別為71.43%和100.00%。囊胚數(shù)＞7 的4 個周期中，種植率及臨床妊娠率有所下降，但本研究納入的囊胚數(shù)＞7的周期數(shù)較少，可能不能反映姐妹胚胎形成囊胚的個數(shù)與D3 移植胚胎的臨床結局的相關性。

這項研究還存在一定的局限性。因為用于繼續(xù)培養(yǎng)的非優(yōu)質胚胎數(shù)量可能存在差異，而這些差異可能影響囊胚形成的比例。因此，我們進一步對非優(yōu)質胚胎數(shù)≥5的患者進行了研究，但是，針對姐妹胚胎體外形成囊胚的數(shù)量與D3胚胎移植結局的相關性分析還需要更大樣本量的研究。

總之，本研究結果表明，姐妹胚胎繼續(xù)培養(yǎng)后形成囊胚的能力、個數(shù)與速度與D3 移植胚胎的種植潛能和發(fā)育潛能有關，同周期姐妹胚胎體外形成囊胚的能力個數(shù)與速度成為除卵裂期胚胎形態(tài)學評估以外的又一預測D3移植胚胎的臨床結局的有效預測因子。對于D3移植失敗但姐妹胚胎培養(yǎng)成為囊胚的患者，可能更需要關注體內(nèi)激素環(huán)境、黃體功能支持及子宮內(nèi)膜容受性等胚胎以外的原因［21］，以期獲得妊娠。

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