武漢地區(qū)結(jié)核分枝桿菌異煙肼耐藥性的基因分析

通信作者：余曉麗(1963-)，女，教授，E-mail：Liyan1181@126.com.

武漢地區(qū)結(jié)核分枝桿菌異煙肼耐藥性的基因分析

孫戰(zhàn)強(qiáng)1,2，陳高瞻1，余曉麗1

(1.武漢輕工大學(xué) 生物與制藥工程學(xué)院，湖北 武漢430023;2. 上海凱地生物科技有限公司，上海 20025)

摘要：探討武漢地區(qū)結(jié)核分枝桿菌臨床分離株異煙肼耐藥相關(guān)基因突變特征。通過PCR直接序列分析法對異煙肼耐藥相關(guān)基因katG基因及mabA-inhA啟動子進(jìn)行序列分析。20株異煙肼敏感株未檢測到突變，49株耐藥株中有40株(81.6%)存在突變，其中katG的S315突變率占主導(dǎo)優(yōu)勢，突變率為73.5%(36/49)，mabA-inhA啟動子區(qū)核苷酸置換率為8.2% (4/49)，其中一株同時(shí)檢測到了katG和mabA-inhA啟動子區(qū)的突變。此外，還檢測到了一種國內(nèi)尚未報(bào)道的katG突變類型P232S(CCG→TCG)。研究證實(shí)katG基因和mabA-inhA啟動子的突變與異煙肼耐藥相關(guān)，為進(jìn)一步研究結(jié)核分枝桿菌異煙肼耐藥性奠定了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：結(jié)核分枝桿菌；異煙肼；耐藥； katG基因； mabA-inhA啟動子

收稿日期：2015-06-05.

作者簡介：孫戰(zhàn)強(qiáng)(1971-)，男，主管檢驗(yàn)師，E-mail：sunzhanqiang12@126.com.

基金項(xiàng)目：上海市科委科技支撐項(xiàng)目(12441903300).

文章編號：2095-7386(2015)03-0037-04

DOI:10.3969/j.issn.2095-7386.2015.03.008

中圖分類號：R 378

Genotypic analysis of isoniazid-resistantMycobacterium

tuberculosisisolates recovered from Wuhan

SUNZhan-qiang1, 2,CHENGao-zhan1,YUXiao-li1

(1.School of Biology and Pharmaceutical Engineering,Wuhan Polytechnic University,Wuhan 430023,China;

2.Shanghai Kaidi Biological Technology Co., LTD, Shanghai 20025, China)

Abstract：To evaluate the characteristic of genes associated with isoniazid-resistant Mycobacterium tuberculosis clinical isolates collected from Wuhan, China. Methods The genotypes of katG and mabA-inhA promoter that associated with isoniazid-resistance were analyzed with PCR direct sequencing. Results Of the 49 isoniazid-resistant clinical isolates, 43 strains(81.6%) carried mutations in the target genes, and no mutations was found in the 20 isoniazid- sensitive strains. The mutations in katG gene at codon 315 was the most frequent mutations up to 73.5%(36/49)in all. The nucleotide replacement rate of mabA-inhA promoter was 8.2% (4/49).One isolate strain was detected mutations both in katG mabA-inhA promoter. Moreover, we found a new mutant type P232S(CCG→TCG). Conclusions This study confirmed that mutations in the katG and mabA-inhA promoter related with isoniazid-resistance, and provided clues to explore the mechanism of isoniazid -resistant Mycobacterium tuberculosis.

Key words：Mycobacteriumtuberculosis(MTB); isoniazid (INH); drug resietance;katGgene;mabA-inhApromoter

1引言

結(jié)核病是單一致病菌引起死亡最主要的原因，而耐藥及耐多藥結(jié)核分枝桿菌的出現(xiàn)，使結(jié)核病的治療更加困難。異煙肼( INH)是結(jié)核病治療中最主要的一線藥物，同利福平、吡嗪酰胺一樣是現(xiàn)代結(jié)核病控制策略(DOTS)短期化療的基礎(chǔ)藥物[1]。研究表明在所有結(jié)核分枝桿菌(Mycobacteriumtuberculosis, MTB)耐藥分離株中INH的耐受率最高，因此闡明INH的耐藥機(jī)制可以為MTB耐藥快速檢測和個(gè)體化治療提供關(guān)鍵理論基礎(chǔ)。INH耐藥機(jī)制十分復(fù)雜，受多個(gè)基因調(diào)控，國內(nèi)外研究表明，MTB中80%-90%的INH耐藥主要是由于katG基因和mabA-inhA啟動子區(qū)發(fā)生突變所致[2]。本研究旨在探討武漢地區(qū)結(jié)核分枝桿菌臨床分離株異煙肼耐藥相關(guān)基因突變特征，為進(jìn)一步深入地研究闡明結(jié)核分枝桿菌異煙肼的耐藥機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

2材料與方法

2.1材料

結(jié)核分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株H37Rv(ATCC 27294)購自中國藥品生物制品檢驗(yàn)所。69株臨床分離株依據(jù)《結(jié)核病診斷實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)規(guī)程》[3]在武漢醫(yī)療救治中心進(jìn)行分枝桿菌分離培養(yǎng)、菌種鑒定、絕對濃度法藥敏試驗(yàn)(異煙肼，利福平，鏈霉素，乙胺丁醇)，共收集到20株全敏感株，49株INH耐藥株。

2.2方法

2.2.1DNA提取

分離菌株接種在改良羅氏(L-J)培養(yǎng)基上，37 ℃培養(yǎng)至對數(shù)生長期，根據(jù)文獻(xiàn)[4]報(bào)道，采用酶解和傳統(tǒng)酚/ 氯仿抽提法提取各菌株DNA。運(yùn)用Thermo NANODROP 2000微量分光光度計(jì)測定DNA的濃度和純度，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2.2聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)及測序

參照文獻(xiàn)[5]報(bào)道，設(shè)計(jì)菌種鑒定引物INS-F(5’- CGTGAGGGCATCGAGGTGGC -3’)和INS-R(5’- GCGTAGGCGTCGGTGACAAA-3’)，該引物可以特異性地?cái)U(kuò)增結(jié)核分枝桿菌的IS6110的保守區(qū)域。根據(jù)結(jié)核分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)株H37Rv的katG基因和mabA-inhA啟動子區(qū)序列設(shè)計(jì)引物katG-F(5’- TCGGCGATGAGCGTTACAG-3’) 、katG-R(5’- CGTCCTTGGCGGTGTATTG-3’) ，產(chǎn)物長度為459 bp；mabA-inhA-F(5’-CGTCCTTGGCGGTGTATTG-3’) 及mabA-inhA-R(5’-ATCCCCCGGTTTCCTCCGGT-3’) ，產(chǎn)物長度為248 bp。PCR體系(50 μl)：10×PCR Buffer(5 μl)，四種dNTP 各0.2 mmol/L，上下游引物各0.5 μmol/L，Taq酶2.5 U，DNA模板2 μg；PCR擴(kuò)增條件：94 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，30個(gè)循環(huán)，72 ℃延伸10 min。PCR 產(chǎn)物經(jīng)1%的瓊脂糖凝膠電泳后，目的基因片段陽性產(chǎn)物經(jīng)Omega-PCR純化試劑盒純化后送上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司測序。

2.2.3DNA序列分析

測序數(shù)據(jù)通過Clustal W軟件并結(jié)合Blast數(shù)據(jù)庫(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?CMD=Web&PAGE_TYPE=BlastHome)進(jìn)行比對分析。

3結(jié)果

3.1PCR產(chǎn)物

以結(jié)核分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)株H37Rv為對照，應(yīng)用引物INS-F和INS-R引物擴(kuò)增結(jié)核分枝桿菌臨床分離株均得到245bp片段，進(jìn)一步確認(rèn)這些分離株為結(jié)核分枝桿菌。此外，其他耐藥基因也均擴(kuò)出相應(yīng)的DNA片段(見圖1)。

M：DNA Marker；1：標(biāo)準(zhǔn)株H37Rv；2～8：臨床分離株 圖1　katG基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖

3.2katG基因的突變檢測

20株INH敏感株未檢測到突變，49株耐藥株中有40株(81.6%)發(fā)生了突變(見表1)。katG S315突變占主導(dǎo)優(yōu)勢，突變率為73.5%(36/49)。S315最主要的突變類型為：S315T(AGC→ACC)見圖2，另外還包括S315N(AGC→AAC)突變。此外，本實(shí)驗(yàn)中還發(fā)現(xiàn)了katG基因232位點(diǎn)突變，類型為P232S( CCG→TCG)，未發(fā)現(xiàn)缺失突變。

A.結(jié)核分枝桿菌H37Rv標(biāo)準(zhǔn)株的katG基因片段序列； B.耐INH臨床分離株的katG基因點(diǎn)突變S315T(AGC→ACC) 圖2　臨床分離菌株katG基因315位點(diǎn)突變情況

表1INH耐藥株katG及mabA-inhA突變情況 (n=49)

基因基因突變特征位點(diǎn)核苷酸氨基酸突變菌株數(shù)目占比katG232CCG→TCGPro(P)→Ser(S)1/49315AGC→ACCSer(S)→Thr(T)35/49AGC→AACSer(S)→Asn(N)mabA-inhA啟動子-15C→T4/49

3.3mabA-inhA啟動子序列突變檢測

mabA-inhA啟動子區(qū)的序列分析結(jié)果：有4株(8.2%)檢測到了堿基替換，均為C-15T突變。其中一株與katG基因S315聯(lián)合突變。

4討論

Zhang[6]等最早研究MTB的耐藥的分子機(jī)制，提示是由于katG基因的完全缺失造成了過氧化氫-過氧化物酶的活性喪失從而導(dǎo)致MTB對INH的高耐藥。近年來，INH的耐藥機(jī)制引起了人們的廣泛關(guān)注，研究發(fā)現(xiàn)INH耐藥分子機(jī)制與某些基因突變有關(guān)。但是由于地理區(qū)域的不同，INH耐藥基因多態(tài)性及其突變頻率存在差異。研究報(bào)道稱，katG315的突變率范圍為：40%—93.6%，常見的katG315突變有AGC→ACC, AGC→AGG, AGC→AAC, AGC→GGC等[7-8]。本實(shí)驗(yàn)中來自武漢地區(qū)的49例INH耐藥株katG315(Ser→Thr)突變占主導(dǎo)優(yōu)勢，突變率為71.4%(35/49)，與國內(nèi)外絕大多數(shù)報(bào)道一致[9-10]；35株katG315突變中97.1%(34/35)的突變類型為AGC→ACC，僅一例為 AGC→AAC，上述結(jié)果表明katG315突變是武漢地區(qū)結(jié)核分枝桿菌INH耐藥的主要原因。

本次研究中在katG基因232位點(diǎn)發(fā)現(xiàn)突變類型是CCG→TCG(Pro→Ser)。Cardoso[11]等首次報(bào)道了該突變位點(diǎn)232位Pro→Arg，且和mabA-inhA啟動子聯(lián)合突變，表現(xiàn)為INH高耐藥；國內(nèi)陳楊[12]等報(bào)道了該位點(diǎn)的突變(CCG→CAG ，Pro→Gln)，且與inhA基因的 16位(CGT→GGT)聯(lián)合突變，表現(xiàn)為耐多藥。Ando[13]等新近研究發(fā)現(xiàn)katG基因232位點(diǎn)另一突變類型Pro→Ser，并稱其與INH低耐藥有關(guān)。而本實(shí)驗(yàn)中的232(CCG→TCG，Pro→Ser)突變并未與檢測中的其他幾個(gè)INH耐藥基因發(fā)生聯(lián)合突變。有研究表明，結(jié)核分枝桿菌katG基因的缺失與耐INH有關(guān)，且多為高耐藥，但該基因缺失的報(bào)道并不多見[14]。本研究未發(fā)現(xiàn)耐藥菌株中katG基因的缺失。

由inhA編碼的烯?；阴］d體蛋白(inhA)是INH的作用靶點(diǎn)之一，研究表明inhA上游啟動子區(qū)域mabA-inhA突變能引起inhA表達(dá)的增加，從而提高藥靶濃度并產(chǎn)生INH耐藥性[15]。多數(shù)研究發(fā)現(xiàn)INH耐藥株中mabA-inhA突變率為4.3%—34.4%[16]。本研究中耐藥株mabA-inhA突變率為8.1%(4/49)，且都為單獨(dú)的C-15T替換，可見在武漢地區(qū)mabA-inhA基因突變率相對較低，而且mabA-inhA和katG聯(lián)合突變率更小，可能只需要katG基因一個(gè)突變就足以滿足耐INH。

此外，本研究49株表型耐藥株中有6例在以上檢測基因中均未發(fā)生突變，這些菌株可能在這些基因的其他區(qū)段發(fā)生突變或者還存在其他耐藥機(jī)制目前正在進(jìn)一步研究之中。

本研究首次闡明了武漢地區(qū)結(jié)核分枝桿菌INH耐藥株的耐藥分子機(jī)制主要為katG基因發(fā)生點(diǎn)突變，為進(jìn)一步研究結(jié)核分枝桿菌INH的耐藥機(jī)制奠定了一定的基礎(chǔ)，為MTB耐藥分子診斷積累區(qū)域差異性數(shù)據(jù)。但是完全闡明武漢地區(qū)結(jié)核分枝桿菌INH耐藥的機(jī)制還需要大規(guī)模檢測樣本，并且進(jìn)行多基因的研究。

參考文獻(xiàn):

[1]WHO. Multidrug and extensively drug-resistant TB (M/XDR-TB): 2010 global report on surveillance and response[R]. Geneva:World Health Organization,2010.

[2]Wade M M, Zhang Y. Mechanisms of drug resistance in Mycobacterium tuberculosis[J]. Front Biosci,2004,9:975-994.

[3]中國防癆協(xié)會基礎(chǔ)專業(yè)委員會. 結(jié)核病診斷實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)規(guī)程[M]. 北京：中國教育文化出版社,2006:49-51.

[4]張舒林, 伍學(xué)強(qiáng), 祖燕, 等. 應(yīng)用PCR-SSCP檢測耐異煙肼結(jié)核分支桿菌KatG基因突變[J]. 中國衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志,2000,10:185-187.

[5]Zhang S L, Qi H, Qiu D L, et al. Genotypic analysis of multidrug-resistant Mycobacterium tuberculosis isolates recovered from central China[J]. Biochem Genet,2007,45:281-290.

[6]Zhang Y, Heym B, Allen B,et al. The catalase-peroxidase gene and isoniazid resistance of Mycobacterium tuberculosis[J]. Nature,1992,358:591-593.

[7]Mokrousov I, Narvskaya O, Otten T, et al. High prevalence of KatG Ser315Thr substitution among isoniazid-resistant Mycobacterium tuberculosis clinical isolates from northwestern Russia, 1996 to 2001[J]. Antimicrob Agents Chemother,2002,46:1417-1424.

[8]Boonaiam S, Chaiprasert A, Prammananan T, et al.Genotypic analysis of genes associated with isoniazid and ethionamide resistance in MDR-TB isolates from Thailand[J]. Clin Microbiol Infect,2010,16:396-399.

[9]樂軍, 張曼, 張紅梅, 等. 結(jié)核分枝桿菌臨床分離株異煙肼耐藥相關(guān)基因突變的分子特征[J]. 中華微生物學(xué)和免疫學(xué)雜志,2006,26:950-955.

[10]Yao C, Zhu T, Li Y, et al.Detection of rpoB, katG and inhA gene mutations in Mycobacterium tuberculosis clinical isolates from Chongqing as determined by microarray[J]. Clin Microbiol Infect,2010,16:1639-1643.

[11]Cardoso R F, Cooksey R C, Morlock G P, et al. Screening and characterization of mutations in isoniazid-resistant Mycobacterium tuberculosis isolates obtained in Brazil[J]. Antimicrob Agents Chemother,2004,48:3373-3381.

[12]陳楊, 陳玲, 張泓, 等. 耐異煙肼結(jié)核分枝桿菌及其katG與inhA基因突變的研究[J]. 中國抗生素雜志,2010,35:788-792.

[13]Ando H, Kondo Y, Suetake T, et al. Identification of katG mutations associated with high-level isoniazid resistance in Mycobacterium tuberculosis[J]. Antimicrob Agents Chemother,2010,54:1793-1799.

[14]Varela G, Gonzalez S, Gadea P, et al.Prevalence and dissemination of the Ser315Thr substitution within the KatG enzyme in isoniazid-resistant strains of Mycobacterium tuberculosis isolated in Uruguay[J]. J Med Microbiol,2008,57:1518-1522.

[15]Muller B, Streicher E M, Hoek K G, et al. inhA promoter mutations: a gateway to extensively drug-resistant tuberculosis in South Africa? [J].Int J Tuberc Lung Dis,2011,15:344-351.

[16]Yumin H, Sun Y J, Sinyew W,et al. Contribution of dfrA and inhA mutations to the detection of isoniazid-resistant Mycobacterium tuberculosis isolates[J]. Antimicrob Agents Chemother,2009,53:4010-4012. C, Zhu T, Li Y, et al.Detection of rpoB, katG and inhA gene mutations in Mycobacterium tuberculosis clinical isolates from Chongqing as determined by microarray[J]. Clin Microbiol Infect,2010,16:1639-1643.

[11]Cardoso R F, Cooksey R C, Morlock G P, et al. Screening and characterization of mutations in isoniazid-resistant Mycobacterium tuberculosis isolates obtained in Brazil[J]. Antimicrob Agents Chemother,2004,48:3373-3381.

[12]陳楊, 陳玲, 張泓, 等. 耐異煙肼結(jié)核分枝桿菌及其katG與inhA基因突變的研究[J]. 中國抗生素雜志,2010,35:788-792.

[13]Ando H, Kondo Y, Suetake T, et al. Identification of katG mutations associated with high-level isoniazid resistance in Mycobacterium tuberculosis[J]. Antimicrob Agents Chemother,2010,54:1793-1799.

[14]Varela G, Gonzalez S, Gadea P, et al.Prevalence and dissemination of the Ser315Thr substitution within the KatG enzyme in isoniazid-resistant strains of Mycobacterium tuberculosis isolated in Uruguay[J]. J Med Microbiol,2008,57:1518-1522.

[15]Muller B, Streicher E M, Hoek K G, et al. inhA promoter mutations: a gateway to extensively drug-resistant tuberculosis in South Africa? [J].Int J Tuberc Lung Dis,2011,15:344-351.

[16]Yumin H, Sun Y J, Sinyew W,et al. Contribution of dfrA and inhA mutations to the detection of isoniazid-resistant Mycobacterium tuberculosis isolates[J]. Antimicrob Agents Chemother,2009,53:4010-4012.