高碘酸氧化法制備端氨基聚乙二醇的研究

陳陽(yáng)建，許麗麗，張新波，彭富君，宋瀟達(dá)

(1.浙江醫(yī)藥高等專科學(xué)校 生物與制藥學(xué)院，浙江 寧波 315100;2.中國(guó)藥科大學(xué) 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，江蘇 南京 210009)

聚乙二醇(PEG)是一種用途極廣的高分子化合物，在生物醫(yī)藥中，PEG 因具有兩親性和良好的安全性、生物相容性，且無(wú)活性、也無(wú)毒副作用，故作為輔料被廣泛應(yīng)用于藥物制劑以及藥物的緩釋、靶向研究［1-2］，還可以通過(guò)共價(jià)連接于蛋白質(zhì)或多肽以改善蛋白、多肽類藥物的生物化學(xué)特性和藥動(dòng)學(xué)性質(zhì)［3-4］，甚至用于小分子藥物的修飾［5］。由于PEG的末端羥基反應(yīng)活性很小，難以參與下一步的化學(xué)反應(yīng)，直接應(yīng)用受到局限，通常需要將末端羥基轉(zhuǎn)變?yōu)榛钚愿叩幕鶊F(tuán)，如氨基、羧基、醛基等活性基團(tuán)［6］，其中，端氨基聚乙二醇是一種用途廣泛的醫(yī)藥化工原料，也是制備其他活性末端PEG 衍生物的重要中間體之一。其制備方法主要有:高壓反應(yīng)釜氨化法、蓋布瑞爾合成法、疊氮化鈉/催化加氫還原法、Mitsunobu-Staudinger 法等［7-9］。這些合成方法往往反應(yīng)條件苛刻，需要用到高壓反應(yīng)釜等設(shè)備，或者需使用一些毒性較大且危險(xiǎn)的試劑(如水合肼、疊氮化鈉等)，并且反應(yīng)步驟繁瑣。

本文選用單甲氧基聚乙二醇5000(mPEG5000)為原料，與對(duì)甲苯磺酰氯(p-TsCl)反應(yīng)，獲得mPEG5000-OTs，然后與乙醇胺通過(guò)親核取代反應(yīng)獲得中間體，再用高碘酸鈉氧化，獲得單甲氧基聚乙二醇氨基(mPEG5000-NH2)。該方法原料易得、操作簡(jiǎn)便，具有較高的應(yīng)用價(jià)值。目前尚未見文獻(xiàn)報(bào)道。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑與儀器

單甲氧基聚乙二醇5000(mPEG5000);對(duì)甲苯磺酰氯(p-TsCl)、高碘酸鈉均為化學(xué)純;乙醇胺、三乙胺、二氯甲烷、N，N'-二甲基甲酰胺(DMF)、乙二醇、無(wú)水乙醚等均為分析純。

Bruker-ACF-500 MHz 型核磁共振儀(TMS 為內(nèi)標(biāo)，CDCl3為溶劑);Nicolet Impact 410 型紅外光譜儀(KBr 壓片);DF-101S 集熱式恒溫加熱磁力攪拌器;R-201 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器;SHB-III-A 循環(huán)水式多用真空泵。

1.2 合成方法

mPEG5000-NH2的合成方法如下:

1. 2. 1 mPEG5000-OTs (2)的 合 成 10. 0 g mPEG5000(1. 0 mmol)溶于20 mL 無(wú)水二氯甲烷中，加入20 mL 三乙胺(143.2 mmol)，邊攪拌，邊滴加2.0 g 對(duì)甲苯磺酰氯(10.5 mmol)的無(wú)水二氯甲烷溶液(20 mL)，1 h 滴完，于室溫反應(yīng)過(guò)夜。用1 mol/L 的鹽酸洗滌有機(jī)相(25 mL ×3)，再分別用蒸餾水(25 mL)、飽和碳酸氫鈉溶液(25 mL)、飽和食鹽水(25 mL)各洗1 次，用無(wú)水硫酸鈉干燥。過(guò)濾，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至約15 mL，滴入150 mL 冷卻無(wú)水乙醚中，得沉淀，抽濾，真空干燥，無(wú)水乙醇重結(jié)晶，得白色固體粉末9.16 g，收率91.6%。

1.2.2 mPEG5000-NH2(4)的合成 取4.0 g 化合物(2)0. 8 mmol 溶于20 mL 無(wú)水DMF 中，加入2.0 mL 乙醇胺(33. 3 mmol)和4. 0 mL 三 乙 胺(28.6 mmol)，于80 ℃反應(yīng)24 h。加入30 mL 水，用二氯甲烷萃取(15 mL×3)，有機(jī)相合并后蒸干溶劑，殘留物溶于20 mL 水中，加入0.85 g 高碘酸鈉(3.97 mmol)，于室溫?cái)嚢? h。加入1.0 mL 乙二醇，攪拌片刻后，用二氯甲烷萃取(10 mL ×3)，有機(jī)相合并，用飽和食鹽水洗滌(10 mL ×3)，無(wú)水硫酸鈉干燥，過(guò)濾、濃縮后，滴入冷卻無(wú)水乙醚中沉淀，抽濾后真空干燥，得白色固體粉末3. 28 g，收率82.0%。

2 結(jié)果與討論

2.1 mPEG5000-OTs 的合成

制備PEG-OTs 的方法較多，一般都是在堿的催化下，用PEG 與過(guò)量的對(duì)甲苯磺酰氯反應(yīng)，用到的催化劑有吡啶、三乙胺、氫化鈉、丁基鋰以及有色的烷基金屬等堿性催化劑［10-12］，其中最常用的是吡啶和三乙胺。本文考察了不同催化劑及溶劑體系對(duì)產(chǎn)物收率及純度的影響，結(jié)果見表1，其中，mPEG5000-OTs 的端基轉(zhuǎn)化率相當(dāng)于化合物的純度(根據(jù)其1H NMR δ 2.46 和δ 3.39 兩處化學(xué)位移的峰面積比計(jì)算而得)。

表1 不同反應(yīng)體系制備mPEG5000-OTs 的結(jié)果Table 1 Results of mPEG5000-OTs prepared in different reaction systems

由表1 可知，①選用氫化鈉、萘鈉和金屬鈉作為催化劑時(shí)，實(shí)際上是先將mPEG5000 轉(zhuǎn)變?yōu)榇尖c(mPEG5000-ONa)，即將其末端羥基通過(guò)強(qiáng)堿作用獲得末端氧負(fù)離子，增強(qiáng)其反應(yīng)活性，再與對(duì)甲苯磺酰氯反應(yīng)，但是這種方法所得產(chǎn)物的收率偏低，端基轉(zhuǎn)化率最高也只有90.5%;以吡啶作為催化劑時(shí)，所得產(chǎn)物的端基轉(zhuǎn)化率為147.8%，說(shuō)明在反應(yīng)過(guò)程中PEG 有斷鏈產(chǎn)生，且吡啶成本較高、毒性較大;用三乙胺為催化劑，產(chǎn)物收率達(dá)91.6%，端基轉(zhuǎn)化率高達(dá)98.9%;②以三乙胺作為催化劑時(shí)，用丙酮、二氯甲烷和DMF 作為反應(yīng)溶劑，均能較好地得到中間產(chǎn)物，但以二氯甲烷為溶劑時(shí)，能得到更高的收率和端基轉(zhuǎn)化率，以丙酮為溶劑，反應(yīng)液的顏色較深?？紤]到三者與水的互溶性以及后處理的難易程度，選擇二氯甲烷作為反應(yīng)溶劑。

mPEG5000-OTs 的紅外圖譜見圖1。

圖1 mPEG5000-OTs(A)和mPEG5000-NH2(B)的紅外圖譜Fig.1 IR spectra of mPEG5000-OTs(A)and mPEG5000-NH2(B)

由圖1 可知，2 887，1 468，843 cm－1為聚乙二醇主鏈亞甲基C─H 的特征吸收峰;1 113 cm－1為主鏈C─O─C 的不對(duì)稱伸縮振動(dòng)峰;778 cm－1為苯環(huán)的特征吸收峰;1 598，664 cm－1處為磺酸酯基團(tuán)的特征吸收峰。

mPEG5000-OTs 的1H NMR 圖譜見圖2。

圖2 mPEG5000-OTs 的1H NMR 圖譜Fig.2 1H NMR spectrum of mPEG5000-OTs

由圖2 可知，δ 4.17 為連接對(duì)甲苯磺酸酯的亞甲基氫的化學(xué)位移，7.81 和7.35 為苯環(huán)上氫的化學(xué)位移，而3.39 和2.46 分別對(duì)應(yīng)端甲氧基和對(duì)甲苯磺酸酯中甲基氫的化學(xué)位移，二者的峰面積比顯示，mPEG5000 的端羥基已經(jīng)全部轉(zhuǎn)變?yōu)閷?duì)甲苯磺酸酯基團(tuán)。

2.2 mPEG5000-NH2 的合成

反應(yīng)條件對(duì)mPEG5000-NH2的影響見表2，其中，純度通過(guò)1H NMR 和TLC(展開劑為二氯甲烷∶甲醇=72 ∶8，Rf=0.39)進(jìn)行檢測(cè)。由表2 可知:①以DMF 和乙腈作為溶劑，能夠獲得較純的產(chǎn)物，而四氫呋喃的效果較差，可能是由于四氫呋喃的極性不如DMF 和乙腈的極性強(qiáng);②由于乙醇胺的堿性較弱，若無(wú)催化劑，該反應(yīng)難以進(jìn)行，在催化劑的選擇上，有機(jī)堿(如三乙胺)比無(wú)機(jī)堿(如碳酸鉀)的催化效果更好，可能是三乙胺的溶解性更好的原因。

反應(yīng)結(jié)束后，將反應(yīng)溶劑減壓蒸干，獲得化合物(3)的粗品，然后直接投入到下一步的反應(yīng)中，這樣既可以避免繁瑣的后處理操作，又可避免后處理過(guò)程中產(chǎn)物的損失。但需要注意的是，乙醇胺能被高碘酸氧化，且乙醇胺的沸點(diǎn)較高(170.5 ℃)，很難旋蒸除盡，如果殘留過(guò)多，會(huì)消耗大量的高碘酸鈉。因此，為了避免對(duì)最后一步反應(yīng)的影響，第二步反應(yīng)結(jié)束后，先萃取，后蒸干溶劑，獲得中間產(chǎn)物，這樣操作方便簡(jiǎn)單，且能更好地除去小分子雜質(zhì)。

表2 不同反應(yīng)條件對(duì)制備mPEG5000-NH2 的影響Table 2 Influences of mPEG5000-NH2 prepared in different reaction conditions

這些具有β-氨基醇、α-羥基酮、α-羥基酸、α-二酮等類似結(jié)構(gòu)特征的化合物可以選用高碘酸鹽或者四乙酸鉛氧化，對(duì)于能溶于水的化合物以高碘酸鹽為宜，對(duì)于能溶于有機(jī)溶劑的化合物則以四乙酸鉛為宜［13］。而PEG 是一種兩親性的分子，既可以溶于水，又可以溶于有機(jī)溶劑，考慮到成本和環(huán)境的問題，本文選擇高碘酸鹽。反應(yīng)機(jī)理見圖3。

圖3 高碘酸氧化法制備mPEG5000-NH2 的反應(yīng)機(jī)理Fig.3 Reaction mechanism of mPEG5000-NH2 prepared by periodate oxidation

由圖3 可知，mPEG 鏈末端的β-氨基醇結(jié)構(gòu)中的C─C 鍵被高碘酸鈉氧化斷裂，進(jìn)而形成含碳氮雙鍵結(jié)構(gòu)的亞胺類中間體，后者快速水解獲得目標(biāo)產(chǎn)物。該反應(yīng)條件比較溫和，以水為溶劑，室溫即可快速完成，由于高碘酸鹽氧化作用的高效專一性，該反應(yīng)一般能定量完成，因此，該反應(yīng)具有較高的收率和轉(zhuǎn)化率。反應(yīng)完成后，加入過(guò)量的乙二醇是為了消除多余的高碘酸鈉，以免在后處理過(guò)程中產(chǎn)生不期望的副反應(yīng)。

mPEG5000-NH2的紅外圖譜見圖1B。

由圖1B 可知，3 450 cm－1附近出現(xiàn)一個(gè)很寬的弱吸收帶為伯胺基的N─H 伸縮振動(dòng)峰;1 648 cm－1為N─H 彎曲振動(dòng)峰;而相應(yīng)的磺酸酯的特征吸收峰均消失。

mPEG5000-NH2的1H NMR 圖譜見圖4。

圖4 mPEG5000-NH2 的1H NMR 圖譜Fig.4 1H NMR spectrum of mPEG5000-NH2

由圖4 可知，δ 3.55 ～3.78 為聚乙二醇主鏈上亞甲基氫的化學(xué)位移，2.18 為氨基氫的化學(xué)位移，而3.17 和3.51 分別為與氨基相連的α 位亞甲基和β 位亞甲基氫的化學(xué)位移，說(shuō)明在mPEG5000 的末端成功引入了氨基。

3 結(jié)論

以mPEG5000 和對(duì)甲苯磺酰氯為原料，以三乙胺為催化劑，二氯甲烷為溶劑，在室溫條件下制備了純度高達(dá)98. 9%的mPEG5000-OTs，收率91. 6%。mPEG5000-OTs 與乙醇胺在DMF 中，以三乙胺為催化劑，通過(guò)親核取代反應(yīng)獲得末端具有β-氨基醇結(jié)構(gòu)的聚乙二醇中間體，經(jīng)高碘酸氧化，即可獲得單甲氧基聚乙二醇氨基(mPEG5000-NH2)，總收率高達(dá)75.1%。產(chǎn)物結(jié)構(gòu)通過(guò)IR 和1H NMR 表征。該方法原料易得、步驟簡(jiǎn)單、操作方便。

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