黃曲霉漆酶基因HIGS載體的構建及對花生的轉化

孫全喜　王云云　王秀貞　唐月異　吳琪　張青云　曹廣英　王傳堂

摘要：黃曲霉毒素污染嚴重影響著花生食品安全。通過常規(guī)育種的方式培育抗黃曲霉花生新品種進展緩慢，效果也難如人意。HTGS（Host-Induoed Gene Silencing，寄主誘導的轉基因沉默）技術是一種新興的RNA干擾技術，為培育抗病植物提供了可能。但該技術在花生上的應用尚未見報道。為創(chuàng)造抗黃曲霉花生新品系，本研究利用該技術構建了兩個黃曲霉漆酶基因（Lac1和Lac2）的HIGS載體，并試圖將其轉化到易感黃曲霉的花生品種粵油20中，獲得了轉Lac1基因的PCR陽性種子。根據HIGS的原理，黃曲霉侵染后，轉基因花生中產生的dsRNA將抑制黃曲霉漆酶基因表達，從而使轉基因花生對黃曲霉產生抗性?；谠撛?，下一步將對轉基因種子是否抗黃曲霉侵染進行鑒定。本研究為利用HTGS技術探索黃曲霉漆酶基因與黃曲霉致病性的關系奠定了基礎，為培育抗黃曲霉花生品種提供了一條新思路。

關鍵詞：花生；黃曲霉；漆酶基因；寄主誘導的轉基因沉默（HIGS）；遺傳轉化

中圖分類號：S565.203.53

文獻標識號：A

文章編號：1001-4942（2015）10-0008-05

花生是世界重要的油料作物和經濟作物，特別在廣大發(fā)展中國家，是重要的食用蛋白源和食用植物油源。我國是世界花生生產和消費大國，也是花生貿易大國。然而，花生易受黃曲霉菌侵染而產生黃曲霉毒素，嚴重影響著花生的食品安全。

黃曲霉侵染花生時，會誘導花生產生抗病反應，釋放植保素（Phytoalexins）?；ㄉ煌贩N中植保素的積累被認為與抗病性有關?；ㄉ械闹脖Ｋ刂饕擒晤惢衔铮⊿tilbenoids），此類化合物大部分具有抗真菌活性。而黃曲霉漆酶（Laccase）能夠降解芪類化合物，漆酶活性高低與黃曲霉致病性強弱有直接關系。

漆酶是一種含銅多酚氧化酶，廣泛存在于植物、高等真菌和一些細菌分泌物中。在高等植物中，漆酶主要與木質素降解有關。另外一些研究認為漆酶還與病原真菌的致病性相關。單寧酸（Tannic acid）是一種植保素，Kim等認為，在板栗疫病菌（Cryphonectria parasitica）侵染過程中，漆酶的存在可以使致病菌對單寧酸的抗性提高，從而增強對該病原的易感性。此外，還有漆酶參與人類病原真菌致病性的研究報道。

RNA沉默（RNAi）是植物抵御病毒入侵的一種自然防御機制。植物RNAi信號不但可以在相鄰細胞間傳遞，而且可以通過維管束進行遠距離傳播，并且能夠跨越物種界限，由寄主傳遞給寄生的植物、線蟲、細菌、真菌或取食植物的昆蟲。通過在植物（寄主）中異源表達病原物或昆蟲（寄生物）目標基因的dsRNA，可誘發(fā)RNAi特異沉默病原或昆蟲中目標基因的表達。這種寄主誘導的轉基因沉默（Host-In-duced Gene Silencing，HIGS）為作物抗病育種提供了新思路。

為研究HIGS技術在花生抗黃曲霉中的應用效果，培育出抗黃曲霉花生新品種，本研究以黃曲霉漆酶基因作為HIGS靶標，構建其RNAi載體，對感黃曲霉花生品種粵油20進行轉化，獲得了推斷轉化體。

1材料與方法

1.1試劑及材料

本研究所用花生材料為易感黃曲霉品種粵油20。大腸桿菌DH5α感受態(tài)、DNA分子量標記、PCR Mix等購自北京全式金生物有限公司；限制性內切酶均購自Fermentas公司；T4 DNA連接酶購自寶生物工程（大連）有限公司；質粒小提試劑盒和膠回收試劑盒購自天根生化科技（北京）有限公司；農桿菌菌株EHA105以及RNAi載體pF-GC5941為本實驗室保存。

1.2DNA和氨基酸序列分析、DNA合成

DNA測序和DNA合成均由上海桑尼生物科技有限公司完成?；蜷_放閱讀框（ORF）由ORF Finder（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/gorf/）獲得。氨基酸序列比對由DNAMAN序列分析軟件（LynnonBiosoft）完成。

1.3農桿菌介導的遺傳轉化

2014年7月在萊西試驗站專門的轉基因試驗區(qū)按本項目組專利技術（專利號：ZL2011 10058531.2）對粵油20進行農桿菌注射。10月收獲種子，晾干，保存。

1.4轉基因花生的PCR檢測

在花生種子遠離胚芽的一端切下薄薄的一層子葉組織，利用該部分組織提取DNA，提取方法參照國家發(fā)明專利“花生健康組織和病組織簡便快速DNA提取方法”（專利號：ZL 2009 10255786.0）。經上述處理的花生種子可以進行正常種植。用基因特異引物（見表1）進行PCR擴增，篩選PCR陽性花生種子。PCR程序如下：94℃預變性5min；94℃變性30s，58℃退火30s，72℃延伸30s，35個循環(huán)；72℃延伸10min。

2結果與分析

2.1黃曲霉漆酶基因片段的獲得

在NCBI上搜索到兩個可能的漆酶基因（XM_002373291和XM_002382249），長度分別為1764bp和1797bp，分別標記為Lac1和Lac2。經NCBI Blast分析，發(fā)現兩者都具有3個保守的銅原子結合位點。將Lac1和Lac2編碼的氨基酸與GenBank中登錄的蛋白序列進行比對后發(fā)現：這兩個基因與其它真菌漆酶基因編碼的氨基酸序列具有較高的同源性（圖1）。

分別選取Lac1（139-448）和Lac2（20-329）各310bp的序列（圖2），每個片段的5′端添加限制性內切酶Xba I-Asc I識別序列，3′端添加Swa I-BamH I識別序列，以方便構建RNAi載體。由上海桑尼生物科技有限公司進行全基因合成。片段合成后，亞克隆到克隆載體pUC57中，得到的載體分別命名為pUC57-Lac1和pUC57-Lac2。經M13F引物測序，序列完全正確。endprint

2.2黃曲霉漆酶基因RNAi載體的構建

用限制性內切酶Asc I和Swa I將Lac1和Lac2片段分別從pUC57-Lac1（圖3B，以Lac1為例，下同）和pUC57-Lac2切下，連接到同樣經過Asc I和Swa I酶切的植物RNAi載體pFGC5941（圖3A，載體信息見http：//www.snapgene.com/resources/plasmid_files/plant_vectors/pFGC5941/）。經特異引物（見表1）篩選，得到含目的片段的質粒pF-GC5941-Lac1-1（圖4A）和pFGC5941-Lac2-1。

質粒pUC57-Lac1和pUC57-Lac2經BamH I和Xba I酶切（圖3D），得到的片段連接到經BamH I和Xba I酶切的pFGC5941-Lac1-1（圖3C）和pFGC5941-Lac2-1中，經PCR篩選，得到帶有第二個片段的質粒pFGC5941-Lac1-2（圖4B）和pFGC5941-Lac2-2。此時，載體中均包含一個正向目的片段和反向目的片段及中間由ChsA intron間隔的結構。

2.3轉基因花生T₀代種子的PCR檢測

將構建好的質粒pFGC5941-Lac1-2轉化到農桿菌菌株EHA105中，利用本課題組發(fā)明的農桿菌轉化法對易感黃曲霉品種粵油20進行遺傳轉化，收獲了轉Lac1基因的花生種子29粒；提取DNA后，利用Lac1特異引物（見表1）進行PCR篩選。結果篩選到轉Lac1的PCR陽性花生種子11粒，轉化率達38%。圖5僅顯示部分結果，其中2～5號和7號樣品有目的條帶，N為陰性對照，P為陽性對照。目前，這些PCR陽性花生種子已種于轉基因隔離區(qū)，所結種子將用于黃曲霉抗性鑒定。

3討論與結論

國內外長期以來通過常規(guī)手段培育抗黃曲霉花生品種，周期長、進展緩慢且效果不甚理想。基因工程技術有望解決花生黃曲霉毒素污染問題。寄主誘導的轉基因沉默（HIGS）技術是一種研究病原物（真菌等）基因功能以及控制病原物造成其寄主病害的全新技術。該技術將構建的含病原物目的基因片段發(fā)夾結構的載體轉化到寄主中，從而導致病原物特定基因序列雙鏈RNA（dsRNA）表達；當病原物侵染表達了dsRNA的寄主時，dsRNA由寄主傳遞給病原物，對病原菌內源特定基因的表達進行RNA干擾，從而引起病原菌特定基因表達的下調。該技術為花生抗黃曲霉育種提供了新思路，但目前尚未見有利用HIGS技術增強花生對黃曲霉抗性的研究報道。

黃曲霉漆酶活性高低被認為與黃曲霉致病性強弱有直接關系。為了抑制黃曲霉漆酶基因Lac1和Lac2的表達，本研究以黃曲霉兩個漆酶基因為HIGS的靶標，構建其RNAi載體，并對感黃曲霉花生品種粵油20進行農桿菌轉化，初步獲得了轉Lac1的PCR陽性花生種子。從圖5中可以看出，PCR陽性樣品目的條帶較弱，可能與提取的DNA質量較差有關?；ㄉN子中油分含量較高，DNA較難提取，其提取質量與操作者的不熟練程度密切相關。

為進一步研究轉黃曲霉漆酶基因的花生是否抗黃曲霉，本課題組已將PCR陽性轉Lac1花生推斷轉化體種子種植于轉基因試驗區(qū)，待收獲種子后將進行黃曲霉侵染鑒定，檢測其是否獲得了黃曲霉抗性。同時，將繼續(xù)用含Lac2的RNAi載體對粵油20進行遺傳轉化，以期獲得抑制Lac2表達的轉基因花生。

本研究為利用HIGS技術探討黃曲霉漆酶基因與黃曲霉致病性的關系奠定了基礎，為培育抗黃曲霉花生新品種提供了一條新的思路。endprint