DNA條形碼技術(shù)在深圳魚肉制品鑒定中的應(yīng)用

王 敏，劉 葒，黃 海，趙曉萌，石 瓊，何舜平,4，孫 穎,*

（1.深圳華大基因研究院，廣東 深圳 518083；2.深圳出入境檢驗(yàn)檢疫局動(dòng)植物檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心，廣東 深圳 518045；3.三亞市南繁科學(xué)技術(shù)研究院，海南 三亞 572000；4.中國(guó)科學(xué) 院水生生物研究所，湖北 武漢 430072）

DNA條形碼技術(shù)在深圳魚肉制品鑒定中的應(yīng)用

王 敏1，劉 葒2，黃 海3，趙曉萌1，石 瓊1，何舜平1,4，孫 穎1,*

（1.深圳華大基因研究院，廣東 深圳 518083；2.深圳出入境檢驗(yàn)檢疫局動(dòng)植物檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心，廣東 深圳 518045；3.三亞市南繁科學(xué)技術(shù)研究院，海南 三亞 572000；4.中國(guó)科學(xué) 院水生生物研究所，湖北 武漢 430072）

以線粒體細(xì)胞色素氧化酶亞基Ⅰ（COⅠ）基因?yàn)槟繕?biāo)基因，應(yīng)用DNA條形碼技術(shù)鑒別深圳批發(fā)市場(chǎng)和超市零 售魚肉制品的種類來(lái)源，判別其產(chǎn)品標(biāo)簽是否正確。本研究調(diào)查的77 份魚肉制品均能擴(kuò)增出特異性條帶，28 份樣品與產(chǎn)品標(biāo)簽標(biāo)示不符，“錯(cuò)貼”率高達(dá)36.36%，其中所有標(biāo)示“龍俐魚”的商品都是低價(jià)的“巴丁魚”（Pangasianodon hypophthalmus）。DNA條形碼技術(shù)可用于魚肉制品的來(lái)源物種鑒定。

DNA條形碼；COⅠ基因；物種鑒定；魚肉制品

我國(guó)是魚肉消費(fèi)大國(guó)，魚肉制品繁多，包括生魚片、冷凍加工品（魚片或魚段）、烤魚片和魚糜制品等。近年來(lái)，魚肉制品的摻假行為頻頻曝光，給人們的健康造成嚴(yán)重威脅[1-3]。魚肉制品錯(cuò)貼標(biāo)簽的現(xiàn)象并非中國(guó)獨(dú)有，一些歐洲國(guó)家的商販也以次充好，賺取更高利潤(rùn)。如，在抽檢的德國(guó)產(chǎn)鰈類魚中，1/4與標(biāo)注名稱不符；24%的西班牙產(chǎn)蝦肉樣品中存在欺詐行為；在奧地利，一些價(jià)格昂貴的比目魚、挪威三文魚也通常成為假冒的對(duì) 象[4]。

DNA條形碼的概念由加拿大生物學(xué)家Paul Hebert在2003年首次 提出[5-6]，是一種利用 線粒體細(xì)胞色素C氧化酶亞基Ⅰ（mitochondri al cytochrome C oxidase subunitⅠ，COⅠ）基因，一段長(zhǎng)度為648 bp的片段，對(duì)物種進(jìn)行準(zhǔn)確、快速鑒定的方法。在國(guó)外，DNA條形碼技術(shù)已用于魚肉制品的真假鑒別。Cawthom等[7]利用DNA條形碼技術(shù)研究南非市場(chǎng)的魚類，發(fā)現(xiàn)在批發(fā)商和零售商中貼錯(cuò)標(biāo)簽的比例差別巨大；Laura等[8]利用DNA條形碼技術(shù)對(duì)意大利市場(chǎng)上的69 份魚類樣品進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)有22 個(gè)樣本（32%）存在錯(cuò)貼標(biāo)簽現(xiàn)象；Wong等[9]利用DNA條形碼技術(shù)對(duì)市場(chǎng)上的91 個(gè)樣品進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)有25%的海產(chǎn)品的標(biāo)簽與實(shí)物不符；Holems等[10]研究了澳大利亞附近海域的221 份魚翅樣品，結(jié)果發(fā)現(xiàn)有許多鯊魚被列入世界自然保護(hù)聯(lián)盟紅色名錄，一種鯊魚為極度瀕危物種；美國(guó)海洋環(huán)境保護(hù)組織在2010—2012年期間通過(guò)DNA條形碼技術(shù)研究全美境內(nèi)1 247 份魚類制品，發(fā)現(xiàn)有1/3的商品存在錯(cuò)貼標(biāo)簽現(xiàn)象[11]。但在我國(guó)DNA條形碼技術(shù)主要集中在分類學(xué)和物種鑒定研究中[12-15]，而用于食品鑒定的文獻(xiàn)報(bào)道較少，在魚肉鑒定方面也是最近兩年才有少量報(bào)道[16-18]。

本研究參照Ward等[19]的方法，選用COⅠ基因的通用引物，對(duì)深圳市場(chǎng)冷凍魚、凍魚片進(jìn)行DNA提取、擴(kuò)增和測(cè)序，并對(duì)線粒體COⅠ基因序列進(jìn)行分析比對(duì)，旨在建立準(zhǔn)確、高效的魚肉制品的鑒定方法，為魚肉制品進(jìn)出口檢驗(yàn)監(jiān)管和市場(chǎng)安全監(jiān)管等方面的應(yīng)用提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

2013年3月從市場(chǎng)上隨機(jī)購(gòu)買77 份魚肉樣品。其中59 份整魚和凍魚塊在深圳梅林批發(fā)市場(chǎng)購(gòu)得，其余18份魚片和魚柳等在深圳各超市購(gòu)得。

無(wú)水乙醇、氯仿、異戊醇、異丙醇（ 均為分析純）、EB核酸染料 生工生物工程（上海）股份有限公司；Tris-飽和酚（pH 8.0） 北京索萊寶科技有限公司；Taq DNA聚合酶、dNTPs（2.5 mmol/L）、DNA Marker（DL100 bp） 廣州瑞真生物科技有限公司；蛋白酶K 德國(guó)Merck公司。

1.2 儀器與設(shè)備

高速離心機(jī) 德國(guó)Eppendorf公司；聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）儀 美國(guó)Life Technologies公司；水浴鍋 上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；超凈工作臺(tái) 深圳市優(yōu)之凈環(huán)境科技有限公司；電泳儀 北京六一儀器廠；凝膠成像系統(tǒng) 上海天能科技有限公司；微量核酸蛋白測(cè)定儀 德國(guó)Implen公司。

1.3 方法

1.3.1 樣本DNA提取

采用傳統(tǒng)的酚-氯仿法。取10 mg左右的組織于1.5 mL的離心管中，加入494 μL DNA裂解液和6 μL蛋白酶K（20 mg/mL）；將離心管于56 ℃恒溫水浴鍋中裂解3 h，水浴完后，加入等體積的酚-氯仿-異戊醇（25∶24∶1，V/V）溶液，搖勻至乳濁液，離心10 min，12 000 r/min；吸取上清液，轉(zhuǎn)入新的1.5 mL離心管中，加入等體積的酚-氯仿-異戊醇（25∶24∶1，V/V）溶液，搖勻至乳濁液，離心10 min，12 000 r/min。吸取上清液，轉(zhuǎn)入新的1.5 mL離心管中，加入2 倍體積無(wú)水乙醇溶液（提前預(yù)冷），顛倒混勻，－20 ℃靜置30 min，離心10 min，12 000 r/min；棄去上清液，體積分?jǐn)?shù)75%乙醇溶液洗滌2 次；烘干后加入50 μL dH2O，溶解DNA；取2 μL制備1%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測(cè)，同時(shí)吸取1 μL稀釋后使用紫外分光光度計(jì)進(jìn)行檢測(cè)；將原液存放于－20 ℃冰箱保存。

1.3.2 COⅠ基因的PCR擴(kuò)增和測(cè)序魚類通用引物[19]：

FishF2_t1（5’-TGTAAAACGACGGCCAGTCGACT AATCATAAAGATATCGGCAC-3’），VF2_t1（5’-TGTA AAACGACGGCCAGTCGACTAATCATAAAGATATCG GCAC-3’）；FishR2_t1（5’-TGTAAAACGACGGCCAG TCGACTAATCATAAAGATATCGGCAC-3’），F(xiàn)R1d_t1（5’-CAGGAAACAGCTATGACACCTCAGGGTGTCCGA ARAAYCARAA-3’）。

PCR反應(yīng)體系為25 μL：10×PCR Buffer為2.5 μL，dNTPs（2.5 mmol/L）1.0 μL，TaKaRa Taq（5 U/μL）0.5 μL，引物各0.25 μL，DNA模版1.0 μL，去離子水19.0 μL。PCR反應(yīng)程序：94 ℃、5 min；94 ℃、30 s，52 ℃、40 s，72 ℃、1 min，35個(gè)循環(huán)；72 ℃、10 min。PCR擴(kuò)增完成后，以1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物，挑選擴(kuò)增成功且條帶單一的產(chǎn)物送測(cè)。

1.3.3 序列比對(duì)及分析

將測(cè)序成功的序列人工比對(duì)拼接，將處理過(guò)的序列放到BOLD（http://www.boldsystems.org）以及NCBI（http://blast.ncbi.nlm.nih.gov）網(wǎng)站的數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)樣品的COⅠ序列進(jìn)行鑒定以及相似度分析，再將整理后的序列和GenBank下載的相關(guān)序列應(yīng)用DNAMAN 7.0軟件進(jìn)行多序列比對(duì)，分析相關(guān)序列的同源性。

2 結(jié)果與分析

2.1 樣品DNA濃度及純度

電泳檢測(cè)顯示，DNA質(zhì)量正常；紫外分光光度計(jì)檢測(cè)波長(zhǎng)260 nm和波長(zhǎng)280 nm處吸光度比值，即A260nm/ A280nm在1.8～2.0之間，滿足常規(guī)PCR反應(yīng)的要求。

2.2 COⅠ基因的擴(kuò)增和克隆

圖1 不同魚類樣品COI 基因的擴(kuò)增條帶Fig.1 Amplifi cation of COⅠ gene sequences from different commercial fi sh products

本研究設(shè)計(jì)的引物擴(kuò)增目標(biāo)片段約為750 bp，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物分子質(zhì)量與設(shè)計(jì)相符（圖1）。將DNA片段純化后送北京六合華大基因科技股份有限公司測(cè)序，所有77 份獲得測(cè)序序列，且經(jīng)過(guò)序列比對(duì)后相似度均在98%以上，說(shuō)明DNA條形碼技術(shù)可以精準(zhǔn)地對(duì)各種凍魚、魚片以及魚柳樣品進(jìn)行鑒定。

2.3 標(biāo)簽符合性分析

表1 批發(fā)市場(chǎng)樣品鑒定結(jié)果Table1 Identifi cation results of fi sh products obtained from wholesalers

批發(fā)市場(chǎng)購(gòu)買的59 份樣品，經(jīng)基因測(cè)序后其序列與NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)分析后的相似度匯總于表1。結(jié)果表明，有20 份存在標(biāo)簽貼錯(cuò)的混亂現(xiàn)象，誤貼率為33.9%，其中大多數(shù)是由于賣家沒(méi)有專業(yè)的分類知識(shí)所致。除了金線魚（Nemipterus virgatus）標(biāo)為“黃花魚”（序號(hào)31）、蛇鯔（Saurida elongata）標(biāo)為“九江魚”（序號(hào)41）這2 份樣品存在嚴(yán)重的錯(cuò)標(biāo)外，其他錯(cuò)標(biāo)可能是由于魚的外形不易辨別而導(dǎo)致的商品錯(cuò)標(biāo)。如眾多標(biāo)有“池魚”的商品是花腹鯖（Scomber australasicus）和日本鯖（Scomber japonicus）2 種不同的魚；標(biāo)有金線魚、“紅衫魚”和“紅三魚”的多屬于同一種魚；史氏低鰭鯧（Peprilus snyderi）在形態(tài)學(xué)上和南鯧（Psenopsis anomala）比較相似；長(zhǎng)尾大眼鯛（Priacanthus tayenus）也經(jīng)常被漁民當(dāng)作“紅衫魚”。紅尾圓鲹（Decapterus akaadsi）與花腹鯖和日本鯖雖然在種屬差別很大，但是形態(tài)上都是長(zhǎng)梭形，比較容易被商販誤以為是“池魚”。

表2 超市樣品鑒定結(jié)果Table2 Identifi cation results of fi sh samples obtained from supermarket

超市購(gòu)買的18 份魚片和魚柳樣品經(jīng)基因測(cè)序，其序列與NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)分析后的相似度匯總于表2。其中，超過(guò)1/3的樣品存在以價(jià)格較低的魚標(biāo)成價(jià)格較高的魚的現(xiàn)象?！褒埨~”一般指舌鰨科舌鰨屬的幾種魚類，如半滑舌鰨（Cynoglossus semilaevis）；然而此次調(diào)查所有標(biāo)有“龍俐魚”的商品竟然都是低價(jià)的“巴丁魚”（Pangasianodon hypophthalmus）；而羅非魚（Oreochromis niloticus）也被標(biāo)為價(jià)格較高的“鯛魚”；純正鱈魚一般為大西洋鱈魚（Gadus morhua）、格陵蘭鱈魚（Gadus ogac）和太平洋鱈魚（Gadus macrocephalus）3 種，雖然細(xì)鱗壯鱈（Albatrossiapectoralis）不能被當(dāng)作傳統(tǒng)意義上的鱈魚，也勉強(qiáng)可以叫鱈魚，然而一些商家竟然將馬舌鰈魚（Reinhardtius hippoglossoides）標(biāo)為“鱈魚片”；“白鯧”在一些地方也被標(biāo)為金鯧即卵形鯧鲹（Trachinotus ovatu）。

33 討 論

3.1 市場(chǎng)錯(cuò)貼標(biāo)簽的種類

各種因素都可能造成商品錯(cuò)標(biāo)現(xiàn)象。1）漁民由于缺乏專業(yè)的分類學(xué)知識(shí)導(dǎo)致魚從剛捕撈上來(lái)就被貼錯(cuò)標(biāo)簽[7]，這種情況主要由于魚的形態(tài)比較相似導(dǎo)致，在此次調(diào)查中這類現(xiàn)象普遍存在，如花腹鯖、日本鯖以及紅尾圓鲹被標(biāo)為“池魚”，而金線魚則被標(biāo)上“金線魚”、“紅衫魚”和“紅三魚”等多種商標(biāo)。2）有些魚的形態(tài)相差甚遠(yuǎn)，但魚肉無(wú)法區(qū)分，使得一些價(jià)格較低的魚可能被標(biāo)成價(jià)格較高的魚。這種行為不僅在國(guó)內(nèi)時(shí)常發(fā)生，在歐美等眾多發(fā)達(dá)國(guó)家也存在，一些漁業(yè)廠商甚至有意將低價(jià)魚貼上名貴魚肉的標(biāo)簽，以賺取更高利潤(rùn)[4,20-22]。本實(shí)驗(yàn)對(duì)收集的樣品進(jìn)行檢測(cè)后發(fā)現(xiàn)，被誤標(biāo)魚類多集中在高價(jià)值經(jīng)濟(jì)魚類，如羅非魚片代替“鯛魚”，“巴丁魚”代替“龍俐魚”、“鮰魚”，“鰈魚”代替鱈魚等。

此外，一些禁止銷售的魚類，也會(huì)發(fā)生貼錯(cuò)標(biāo)簽現(xiàn)象[23]。Birstein等[24]利用DNA條形碼分析發(fā)現(xiàn)23%的魚子醬標(biāo)注的魚類名稱錯(cuò)誤，部分商品涉及瀕危魚類成分；商販也會(huì)把瀕危和受保護(hù)的物種貼成市場(chǎng)可以銷售的商品標(biāo)簽，例如Liu等[25]研究了臺(tái)灣境內(nèi)548 份魚翅樣品，結(jié)果顯示有2.5%的鯊魚物種是瀕危，50%易危，24.5%近危，僅有23%的物種是非瀕危物種的。錯(cuò)貼標(biāo)簽還可能導(dǎo)致一些魚類引發(fā)的食物中毒[26]，我國(guó)沿海地區(qū)的一些餐館會(huì)把許多有毒的河豚當(dāng)作無(wú)毒的河豚販賣，最后導(dǎo)致悲劇的發(fā)生[1]；此次尚未檢測(cè)到瀕危物種和禁止銷售的魚類。

3.2 魚肉真?zhèn)舞b別方法

通常人們?cè)谫I魚時(shí)對(duì)魚肉好壞的鑒別方法主要是憑借感覺(jué)、經(jīng)驗(yàn)以及喜好程度進(jìn)行評(píng)判，但是這樣不能有效地分辨魚的種類。研究[27-28]表明，通過(guò)近紅外光譜法可對(duì)魚糜中水分和蛋白質(zhì)含量進(jìn)行快速、無(wú)損檢測(cè)。Mounier等[29]研究發(fā)現(xiàn)，變性高效液相色譜是一種快速、有效的肉類成分鑒定技術(shù)，可判斷魚糜及蟹棒中成分組成。酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法也被廣泛應(yīng)用到果汁飲料、奶類產(chǎn)品和動(dòng)物源性成分的檢測(cè)和鑒別，并且具有高靈敏度和特異性[30]。等電聚焦法和雙向電泳法可以對(duì)不同種類冷凍蝦、鱸魚進(jìn)行鑒定[31-32]。

隨著分子生物技術(shù)的快速發(fā)展，近年來(lái)DNA鑒別法越來(lái)越常見(jiàn)，限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性PCR（PCR-restrictionfragment length polymorphism，PCR-RFLP）技術(shù)可以對(duì)肉類制品進(jìn)行正確鑒別[33-35]，如Hsieh等[34]利用PCR-RFLP技術(shù)可以對(duì)熱處理（121 ℃，10～90 min）的河豚魚制品進(jìn)行正確鑒別。擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性（amplified fragment length polymorphism，AFLP）分子標(biāo)記技術(shù)鑒別魚肉品種早有報(bào)道，如Zhang Junbin等[36]采用AFLP和變性梯度電泳鑒別虹鱒魚和大西洋鮭魚，結(jié)果表明AFLP具有更高的靈敏度，可以對(duì)鮭魚進(jìn)行準(zhǔn)確鑒定。Maldini等[37]研究表明，AFLP分子標(biāo)記技術(shù)可以用于32 種冷凍魚類和家畜品種的準(zhǔn)確鑒別，也可以用于熱處理海產(chǎn)品的鑒別。最近幾年來(lái)，DNA條形碼技術(shù)也已被越來(lái)越多應(yīng)用到食品鑒定中[7-11,16-18,23-25,38]。

3.3 DNA條形碼技術(shù)的優(yōu)勢(shì)

與傳統(tǒng)形態(tài)鑒定相比較，DNA條形碼技術(shù)具有諸多優(yōu)勢(shì)：鑒定不依賴形態(tài)特征，不受個(gè)體差異的影響，能夠鑒定到種的水平[39-40]，對(duì)實(shí)驗(yàn)人員的操作技能要求低等特點(diǎn)。使得物種鑒定過(guò)程變得簡(jiǎn)單、有效和統(tǒng)一。與一般的蛋白質(zhì)鑒定方法相比，由于DNA比蛋白質(zhì)的耐熱性強(qiáng)，但是通過(guò)優(yōu)化手段仍然可以從加工產(chǎn)品中提取小片段的DNA[41]；DNA本身的復(fù)雜性也可以能提供更多信息；而且DNA條形碼技術(shù)不受組織類型、年齡及狀態(tài)等因素的影響。因此，該技術(shù)具有更高的特異性、靈敏度和可靠性。

與其他DNA鑒別方法比較，DNA條形碼技術(shù)具有操作簡(jiǎn)單、可靠快捷以及應(yīng)用廣泛等優(yōu)勢(shì)。PCR-RFLP在物種鑒定中已成為一個(gè)重要的方法，但由于物種的種內(nèi)變異可能導(dǎo)致在鑒定過(guò)程中出現(xiàn)誤判；AFLP雖然相對(duì)可靠、操作簡(jiǎn)便，但AFLP也會(huì)發(fā)生譜帶錯(cuò)配或缺失，而且其成本也比DNA條形碼技術(shù)高[42]；微衛(wèi)星標(biāo)記的等位基因數(shù)目多、帶型復(fù)雜，從而導(dǎo)致難以判型，給DNA指紋識(shí)別自動(dòng)化和規(guī)?；瘞?lái)困難[43]。

3.4 展望

盡管DNA條形碼技術(shù)具有許多優(yōu)勢(shì)，然而，在食物鑒定方面還存在一些挑戰(zhàn)。在食物加工過(guò)程中往往會(huì)因?yàn)楦邷氐葘?dǎo)致DNA降解，以及植物油、添加劑和調(diào)味料的加入對(duì)DNA提取和擴(kuò)增有很大影響，這就需要對(duì)一些步驟進(jìn)行各種優(yōu)化；另外，一些魚丸或肉丸可能不是來(lái)自單個(gè)物種，這就無(wú)法對(duì)食物種源進(jìn)行準(zhǔn)確鑒定。此外，由于食物的種類繁多，目前的DNA條形碼數(shù)據(jù)庫(kù)雖然物種量比較豐富但還遠(yuǎn)不夠完善，因此，在用公共數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)分析時(shí)可能存在一些困難。

目前，我國(guó)對(duì)DNA條形碼技術(shù)的應(yīng)用主要集中在分類學(xué)和物種鑒定研究中[12-15]，在應(yīng)用領(lǐng)域處于剛剛起步的階段。今后，DNA條形碼技術(shù)在進(jìn)出口物種鑒定、外來(lái)入侵物種監(jiān)管和食品鑒定等方面將會(huì)發(fā)揮越來(lái)越重要的作用。

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Identifying Fish Products in Shenzhen through DNA Barcoding

WANG Min1, LIU Hong2, HUANG Hai3, ZHAO Xiaomeng1, SHI Qiong1, HE Shunping1,4, SUN Ying1,*
(1. BGI-Shenzhen, Shenzhen 518083, China; 2. Animal & Plant Inspection and Quarantine Technology Center, Shenzhen Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau, S henzhen 518045, China; 3. Sanya Science and Technology Academy for Crop Winter Multiplication, Sanya 572000, China; 4. Institute of Hydrobiology, Chinese Academy of Sciences, Wuhan 430072, China)

In this study, DNA barcoding was applied to identify the exact species of fi sh products from Shenzhen wholesale and retail markets and to check if these products are correctly labeled. Using mitochondrial cytochrome C oxidase subunitⅠ (COⅠ) gene as the target, the sequences of COⅠ from different samples were analyzed. Our results showed that the COⅠgene sequences of all 77 samples examined were successfully amplifi ed by PCR. Howe ver, up to 36.36%（28/77）of them were inconsistent with their label descriptions, in which all the products labeled with “tongue fi sh” were actually the low-cost Pangasian odon hypophthalmus. As a simple, rapid and effi cient technology, DNA barcoding can be widely used for species identifi cation of fi sh products.

DNA barcoding; mitochondrial cytochrome C oxidase subunit Ⅰ (COⅠ) gene; species identifi cation; fi sh products

Q95

B

1002-6630（2015）20-0247-05

10.7506/spkx1002-6630-201520048

2015-01-29

深圳市科技計(jì)劃深港創(chuàng)新圈項(xiàng)目（SGLH20131010105856414）；廣東省省部產(chǎn)學(xué)研專項(xiàng)（2013B090800017）

王敏（1988—），男，碩士，研究方向?yàn)樗飳W(xué)。E-mail：wangmin2@genomics.cn

*通信作者：孫穎（1972—），女，副研究員，博士，研究方向?yàn)轸~類生物學(xué)。E-mail：yingsun09@163.com