禽源大腸桿菌的分離鑒定及耐藥性檢測

黃迪海 秦春芝 盛曉丹張從敬 郭 卉 劉 霞 徐秀榮 秦卓明③*（①山東省健牧生物藥業(yè)有限公司 濟南 250100 ②濟南市動物生物藥品工程技術(shù)研究中心③山東省農(nóng)業(yè)科學院家禽研究所 濟南）

禽源大腸桿菌的分離鑒定及耐藥性檢測

黃迪海①②秦春芝①②盛曉丹①②張從敬①②郭 卉①②劉 霞①②徐秀榮①②秦卓明①②③*（①山東省健牧生物藥業(yè)有限公司 濟南 250100 ②濟南市動物生物藥品工程技術(shù)研究中心③山東省農(nóng)業(yè)科學院家禽研究所 濟南）

了解規(guī)?；B(yǎng)禽場的大腸桿菌耐藥情況，為合理選擇抗生素提供參考。對山東、河北等地2013～2014年送檢病禽進行細菌分離鑒定，對獲得的大腸桿菌用17種藥物進行敏感性試驗。結(jié)果表明：在分離鑒定的28株大腸桿菌中，有27株對17種藥物存在不同程度的耐藥性。其中，對氨芐西林、氯霉素高度耐藥，分別為96.43%和89.29%；對阿米卡星、多粘菌素和加替沙星耐藥率較低分別為32.14%、35.71%和42.86%，對舒巴坦鈉與氨芐西林、頭孢曲松、頭孢克洛、頭孢呋辛、頭孢噻肟的組合物耐藥率最低，為7.14%。研究發(fā)現(xiàn)大腸桿菌分離株的耐藥性較為嚴重，應高度重視對大腸桿菌的耐藥性跟蹤監(jiān)測并根據(jù)藥敏結(jié)果篩選合適的藥物。

大腸桿菌 分離 鑒定 耐藥性

禽大腸桿菌病是由致病性大腸桿菌引起的家禽局部或全身性疾病，是危害家禽養(yǎng)殖業(yè)的主要傳染病之一。禽致病性大腸桿菌感染還可以作為禽流感、新城疫、傳染性支氣管炎等病毒性疫病的繼發(fā)病出現(xiàn)，進一步加劇疫病的危害[1]。在家禽養(yǎng)殖過程中，對禽大腸桿菌病的防控主要通過藥物預防和治療，但由于該菌耐藥性較強、藥敏檢測結(jié)果滯后、部分養(yǎng)殖場不具備藥敏檢測條件等原因，敏感藥物的篩選和及時應用具有一定難度。

本試驗通過對2013～2014年間在山東、河北、河南、遼寧等北方地區(qū)分離鑒定的禽大腸桿菌進行藥敏試驗，篩選敏感藥物，進而為大腸桿菌防治提供實驗室依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 采集山東、河北、河南等省送檢的、具有典型心包炎和肝周炎的病雞26批次和病鴨2批次，進行大腸桿菌分離和純化，獲得28個菌株，經(jīng)革蘭氏染色形態(tài)學觀察和生化試驗，鑒定為大腸桿菌(見表1)。質(zhì)控菌株為大腸桿菌ATCC 25922，購自中國獸醫(yī)藥品檢驗所。

表1 大腸桿菌分離株的來源 (株)

1.1.2 培養(yǎng)基和試劑 麥康凱培養(yǎng)基購自國藥集團化學試劑有限公司，MH肉湯、LB肉湯、普通營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、葡萄糖、甘露醇、麥芽糖等生化培養(yǎng)基為北京奧博星生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品，磷酸二氫鉀、磷酸氫二鈉、氯化鈉為中國上海試劑總廠產(chǎn)品。

1.1.3 藥敏片 標準藥敏片購自杭州濱和微生物試劑有限公司；復方藥敏片為自制，方法是用單方標準藥敏片，滴加40%舒巴坦水溶液20μl，37℃烘干8h，即每片含舒巴坦8μg；藥敏試驗判斷標準見表2。

表2 藥敏試驗判斷標準 (μg×片-1)

1.2 方法

1.2.1 生化特性 按常規(guī)方法[2]，將純化的疑似大腸桿菌培養(yǎng)物分別接種至葡萄糖、麥芽糖、甘露糖、乳糖、尿素、三糖鐵培養(yǎng)基、枸櫞酸鹽培養(yǎng)基、甲基紅試驗和吲哚試驗的生化常規(guī)微量發(fā)酵管中及糖蛋白胨水溶液后，置于37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2～3d，觀察其變化。

1.2.2 藥敏試驗 按照WHO推薦的Kirby－Bauer法[3]進行藥敏試驗。

2 結(jié)果

2.1 生化反應

試驗表明，28株疑似致病性大腸桿菌均符合大腸桿菌的生化特性，能分解葡萄糖、麥芽糖、乳糖、甘露糖，產(chǎn)酸產(chǎn)氣；甲基紅試驗、吲哚試驗均為陽性；在三糖鐵培養(yǎng)基上不產(chǎn)生硫化氫，不水解尿素，在枸櫞酸鹽培養(yǎng)基上不生長。

2.2 藥敏試驗結(jié)果

表3 28株大腸桿菌對17種藥物的敏感性試驗結(jié)果 (株、%)

由表3可見，28株受檢菌中，除1株對17種藥物均敏感外，27株對上述藥物均有不同程度的耐藥，其中，對氨芐西林、氯霉素耐藥率較高，分別為96.43%和89.29%，對頭孢呋辛、頭孢克洛、依諾沙星耐藥率均為82.14%；對復方藥敏片的耐藥率最低，僅為7.14%，較單方平均耐藥率73.57%具有顯著變化；對阿米卡星、多粘菌素、加替沙星的耐藥率均低于43%。值得關(guān)注的是，山東濰坊市分離株對加替沙星的耐藥率僅為11.11%(1/9)，而山東高青縣分離株對阿米卡星的耐藥率達80%(4/5)；山東高青縣和陽谷縣各有1株大腸桿菌對單方藥敏片全部耐藥，對復方藥敏片全部敏感。28株受檢菌中，3株來自山東濰坊市的大腸桿菌未表現(xiàn)出多重耐藥特點，其余25株均為多重耐藥。由圖1可見，85.7%的菌株對6種及6種以上藥物耐受，其中，山東分離株占71.4%，其它占14.3%；耐藥類型為7～10重類型的大腸桿菌比例最大，占受檢菌的60.71%。對被測藥物耐受種類最多的大腸桿菌有2株，僅對加替沙星/多粘菌素B、加替沙星/阿米卡星敏感，耐藥類型為15重耐藥，占受檢菌的7.14%，來自于山東寧陽縣和福山區(qū)。

圖1 28株大腸桿菌多重耐藥類型圖

3 討論

（1）本研究分離鑒定的28株大腸桿菌來源于山東省10個地市、河北滄州、河南鄭州及遼寧錦州規(guī)模化養(yǎng)禽場，多重耐藥率占89.29%，說明上述區(qū)域大腸桿菌耐藥性較強。分離株對上述養(yǎng)殖場常用藥物氨芐西林耐藥率高，對較少使用的多粘菌素、阿米卡星、加替沙星耐藥率較低，與當前的研究[3,4]一致。分離株對獸醫(yī)尚未應用的頭孢呋辛、頭孢克洛和依諾沙星耐藥率高達82.14%，可能與大腸桿菌產(chǎn)生β-內(nèi)酰胺酶水解β-內(nèi)酰胺類藥物[5]和GyrA基因突變耐喹諾酮藥物[6]的耐藥機制有關(guān)，提示我們在用藥過程中要關(guān)注病原菌對同類抗菌藥物的共同耐藥機制，合理選擇抗菌藥物。（2）本試驗證實舒巴坦與β-內(nèi)酰胺類藥物合用在體外對山東等地區(qū)的禽源大腸桿菌具有協(xié)同增效作用，可將大腸桿菌的平均耐藥率由75%降至7%，尤其是對獸醫(yī)常用藥物氨芐西林效果最為顯著，93%的大腸桿菌對其藥敏試驗結(jié)果由耐藥變?yōu)槊舾?。該作用產(chǎn)生的原因是舒巴坦不可逆的與大腸桿菌產(chǎn)生的β內(nèi)酰胺酶結(jié)合，阻止了該酶對β-內(nèi)酰胺類抗菌藥的水解作用。研究表明舒巴坦在人[7]和動物體內(nèi)[8,9]對β-內(nèi)酰胺類藥物也具有顯著的增效作用，但是舒巴坦口服吸收差，僅適合注射使用。為此，阿根廷的Laboratorios Bago S.A開發(fā)上市了口服吸收良好的舒巴坦匹酯；美國Pfizer和丹麥Leo公司研制出口服藥物舒他西林(舒巴坦與氨芐西林以酯鏈相縮合成雙酯型前體藥物)，1986年在日本上市[10]。在我國，口服使用的阿莫西林舒巴坦匹酯、舒他西林及阿莫西林克拉維酸復方制劑已在人醫(yī)領域上市應用。在獸醫(yī)領域，β-內(nèi)酰胺類抗菌藥+β-內(nèi)酰胺酶抑制劑僅有阿莫西林克拉維酸復方產(chǎn)品。在畜禽致病菌耐藥性不斷增強的情況下，一方面要規(guī)范使用抗生素，另一方面要開發(fā)和應用安全、有效、質(zhì)量可控的復方抗菌制劑，降低細菌性傳染病對養(yǎng)禽業(yè)造成的危害。

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S852..61+2

A

1007-1733(2015)11-0011-03

2015-09-06）

科技部農(nóng)轉(zhuǎn)資金項目(SQ2013ECC600059)；濟南市科技成果轉(zhuǎn)化項目(201211063)。

*通訊作者