一株高產(chǎn)脂肪酶菌株選育及其酶學(xué)性質(zhì)的研究

周秀軍 周利芳 周建民 隋喜龍 （威海天智皮毛制品有限公司 山東 文登 264400）

試驗(yàn)研究

一株高產(chǎn)脂肪酶菌株選育及其酶學(xué)性質(zhì)的研究

周秀軍 周利芳 周建民 隋喜龍 （威海天智皮毛制品有限公司 山東 文登 264400）

本研究對不同地點(diǎn)采集的可能含產(chǎn)脂肪酶菌的土壤樣本進(jìn)行篩選和菌種鑒定，分離得到其中產(chǎn)脂肪酶的菌株，通過紫外-光復(fù)活誘變選育提高產(chǎn)量。選擇穩(wěn)定的菌株進(jìn)行酶的分離純化，并且對部分酶特性及載體進(jìn)行研究。結(jié)果表明，從土壤中篩得脂肪酶產(chǎn)量為29.6U/ml的菌株，通過紫外-光復(fù)活誘變產(chǎn)量提高72%。酶學(xué)性質(zhì)研究顯示固化后酶的轉(zhuǎn)脂率遠(yuǎn)高于工業(yè)用酶的轉(zhuǎn)脂率。

脂肪酶 菌株 選育 酶學(xué)性質(zhì)

脂肪酶是一類重要的的水解酶[1]，它是能夠催化油脂降解為脂肪酸、甘油或其他長鏈脂肪酸的催化劑[2]，脂肪酶在動植物體內(nèi)及微生物中[3-4]廣泛存在。因脂肪酶可以分解油脂，因此被廣泛應(yīng)用在皮革加工、食品醫(yī)藥及合成多肽等領(lǐng)域。因此，獲得產(chǎn)脂肪酶高的菌株在未來發(fā)展中存在巨大的應(yīng)用價(jià)值。近年來有研究發(fā)現(xiàn)可通過紫外-光復(fù)活誘變得到正突變率高的菌株，進(jìn)而得到產(chǎn)脂肪酶突變高的菌株。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品的來源 從長期受油污覆蓋的油煙機(jī)排氣孔、或富含營養(yǎng)的排污池及下水道土壤等取得約30份土樣。

1.1.2 主要試驗(yàn)用培養(yǎng)基 富集培養(yǎng)基：橄欖油10ml、酵母粉0.2g、Na2HPO43.5g、KH2PO41.5g、MgSO40.5g、NH4NO35g、NaCl0.5g、加入微量金屬離子，調(diào)整pH7.5加入蒸餾水定容至1000ml，121℃高壓20min。細(xì)菌分離用培養(yǎng)基：牛肉膏0.5g、蛋白胨1g、NaCl5g、瓊脂20g、橄欖油20ml，加入微量金屬離子等，0.2%維多利亞藍(lán)B 3ml，調(diào)整pH7.5用蒸餾水定容至1000ml，115℃高壓滅菌20min。種子培養(yǎng)基：蛋白胨2.5g，葡萄糖2.0g，橄欖油1.0ml，KH2PO40.1g、MgSO40.05g、NH4NO30.5g、調(diào)整pH7.0，用蒸餾水定容至100ml，115℃滅菌20min。發(fā)酵培養(yǎng)基：蛋白胨20g，蔗糖5g，橄欖油10ml，NH4Cl 1g，K2HPO4·3H2O 2g，MgSO40.50g，NaCl 0.5g，用蒸餾水定容至1000ml，121℃高壓滅菌15min。

1.1.3 主要試劑 DNAzol Regent購自Invitrogen公司；RNAiso Plus、Reverse transcriptase XL(AMV)、Ribonuclease Inhibitor、dNTP、rTaq DNA polymerase、DNA Marker(DL2000)、RNase-free水、膠回收試劑盒購自TaKaRa公司；核酸染料購自北京SBS公司；大孔樹脂HPD600購自于滄州寶恩吸附材料科技有限公司；瓊脂糖購自西班牙Biowest公司。

1.2 方法

1.2.1 高產(chǎn)脂肪酶菌株的分離與鑒定 取1ml水樣((或稱取1g土樣)，加入10ml經(jīng)過高壓滅菌的蒸餾水中，混勻后按1:10接種到富集培養(yǎng)基中，30℃、低速振蕩培養(yǎng)48h后，將菌液進(jìn)行10倍系列梯度稀釋，取10-4、10-5、10-6三個梯稀釋度均勻涂抹于初篩羅丹明B平板，30℃培養(yǎng)，觀察菌落的生長狀態(tài)及變色圈的情況。挑取有變色圈的菌落純化分離，將純化后的單菌落在種子液中長到對數(shù)期后進(jìn)行培養(yǎng)96h，發(fā)酵液高速離心10min，吸取發(fā)酵液上清，檢測上清中的脂肪酶活力。

1.2.2 脂肪酶酶活測定 利用對硝基苯棕櫚酸酯(p-NPP)分光光度比色法[6-7]，測定初始水解酶活。

1.2.3 產(chǎn)脂肪酶菌株的鑒定 通過革蘭氏染色的方法、穿刺培養(yǎng)試驗(yàn)等進(jìn)行菌株的形態(tài)觀察，選擇4、20、28、37、41℃觀察細(xì)菌生長情況，確定最適溫度。提取細(xì)菌總DNA，用通用引物進(jìn)行擴(kuò)增，獲得目的片段后進(jìn)行測序。

1.2.4 紫外-光復(fù)活誘變 參考文獻(xiàn)8中菌株的誘變的方法，對菌株進(jìn)行誘變篩選，從誘變獲得的菌株中挑選出脂肪酶最高產(chǎn)量的菌株進(jìn)行傳代，進(jìn)行菌株產(chǎn)酶遺傳穩(wěn)定性檢測。

1.2.5 脂肪酶的純化 選用報(bào)道的方法進(jìn)行脂肪酶的發(fā)酵[9]。硫酸銨沉淀進(jìn)行脂肪酶的收集，冰浴3～4h。離心，收集沉淀，進(jìn)行透析脫鹽。將已透析脫鹽的粗酶液進(jìn)行高速離心，吸取上清，加到經(jīng)過平衡的陰離子交換柱(2.0cm×20cm)上，200ml 0～1mol/L的NaCl線性梯度洗脫。平板定性檢測脂肪酶活性，收集有酶活性溶液，進(jìn)行凍干。采用Bradford 法進(jìn)行測定，以牛血清白蛋白為標(biāo)準(zhǔn)蛋白進(jìn)行蛋白質(zhì)濃度的測定。

1.2.6 酶學(xué)性質(zhì)的研究 （1）脂肪酶分子量大小、純度及活性的測定：通過常規(guī)的聚丙烯凝膠電泳的方法檢測試驗(yàn)所獲得的脂肪酶分子量大小，通過高分離度液相色譜的方法進(jìn)行純化的脂肪酶的純度檢測，通過滴定法進(jìn)行脂肪酶活性測定。（2）酶學(xué)性質(zhì)的研究：將酶置于20、30、35、40、45、50、60、70℃下，以未經(jīng)過處理的酶的酶活為對照，計(jì)算相對酶活；選取pH分別為3、35.、4、4.5、5、5.5、6、6.7、7、7.5、8、8.5、9、10的緩沖液測定不同pH下脂肪酶的酶活。（3）脂肪酶固定及轉(zhuǎn)脂率的測定：用95%的酒精浸泡大孔樹脂24h，用超純水進(jìn)行反復(fù)沖洗后抽濾，依次經(jīng)過酸浸泡2h，反復(fù)沖洗，堿浸泡2h，反復(fù)沖洗，每次沖洗均需沖洗為中性。最后浸于pH為7的磷酸鈉緩沖液(pH7)中。將誘變以后可穩(wěn)定生長的菌株TZ-05脂肪酶進(jìn)行發(fā)酵純化后進(jìn)行固定，然后再研究其轉(zhuǎn)酯特性，采用考馬斯亮藍(lán)法測定發(fā)酵液上清的蛋白含量。選用橄欖油為底物，采用無溶劑轉(zhuǎn)酯體系，將底物20ml，依次加入10ml水、3.32ml甲醇，與固化脂肪酶進(jìn)行混合反應(yīng)，反應(yīng)條件為30℃、160 r/min，4h后取反應(yīng)液10000rpm離心5min，吸取上清稀釋150倍后進(jìn)行氣相色譜實(shí)驗(yàn)，計(jì)算轉(zhuǎn)酯率。

2 結(jié)果

2.1 菌株

分離篩選出10株能在初篩培養(yǎng)基中生長、有羅丹明B反應(yīng)的細(xì)菌。篩選獲得的大部分菌株初始所產(chǎn)脂肪酶酶活很低，酶活情況具體見表1，只有土壤樣品中篩選獲得的菌株TZ-05株的初始酶活較高，遠(yuǎn)高于試驗(yàn)其他菌株，可達(dá)到29.6U/ml，因此選擇菌株TZ-05作為試驗(yàn)菌，菌株TZ-05在羅丹明B篩選平板生長，可以生成的水解圈(圖1)。

表1 篩選菌株初始酶活結(jié)果

圖1 羅丹明B篩選平板上生成的水解圈；菌株TZ-05的菌落形態(tài)；革蘭氏染色觀察

2.2 高產(chǎn)脂肪酶菌株TZ-05

菌株TZ-05在LB固體培養(yǎng)基上，30℃下劃線生長24h后，發(fā)現(xiàn)菌落呈圓形，形態(tài)較小，菌落顏色為淺黃色，不透明，表面光滑，邊緣整齊，周圍培養(yǎng)基沒有暈染。取菌落進(jìn)行革蘭氏染色，鏡下觀察生長的菌株為G-細(xì)菌，細(xì)菌形態(tài)為短桿狀(圖1)。穿刺試驗(yàn)顯示細(xì)菌能運(yùn)動。對菌株TZ-05 16SrRNA分子生物學(xué)鑒定結(jié)果顯示獲得約1500bp片段的特異性條帶，與預(yù)期試驗(yàn)結(jié)果相符；進(jìn)化樹分析顯示，與伯克霍爾德菌同源性最高。

2.3 紫外-光復(fù)活誘變劑量

2.3.1 紫外照射結(jié)果 用紫外燈分別照射30、40、50、 60s，計(jì)算致死率和正突變率，試驗(yàn)操作重復(fù)6次，計(jì)算平均值，具體計(jì)算結(jié)果見表2。由表可見，在紫外照射50s時，正突變率最大，此時致死率為90%。因此，試驗(yàn)選定第一次紫外照射時間為50s。

表2 第一次紫外照射結(jié)果 (s、%)

2.3.2 光復(fù)活結(jié)果 選用紫外照射50s。進(jìn)行光復(fù)活試驗(yàn)，重復(fù)進(jìn)行試驗(yàn)10次，計(jì)算存活率和正突變率的平均值，結(jié)果見表3。由表3可見，在光復(fù)活10s時，正突變率為14%，存活率為26%，因此試驗(yàn)選定光照射10s。

表3 光復(fù)活結(jié)果 (s、%)

2.3.3 第2次紫外照射結(jié)果 重新選取菌液，分別按照上述試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行紫外誘變50s后光復(fù)活10s，然后進(jìn)行第2次紫外誘變，重復(fù)試驗(yàn)10次，計(jì)算致死率和正突變率的平均值，結(jié)果見表4。由表4可見，第2次誘變20s時得正突變率20%，所以試驗(yàn)選定第2次誘變時間為20s。

表4 第二次紫外照射結(jié)果 (s、%)

2.3.4 重復(fù)紫外-光復(fù)活誘變結(jié)果 按照紫外誘變50s，光復(fù)活10s，紫外誘變20s，每次處理都計(jì)算致死率和正突變率的影響結(jié)果見表5，進(jìn)行10次重復(fù)試驗(yàn)計(jì)算致死率和正突變率的平均值。確定誘變步驟為：紫外誘變的時間50s，光復(fù)活10s，第2次紫外誘變20s，按照相同的步驟對菌懸液重復(fù)處理2次。

表5 重復(fù)紫外-光復(fù)活誘變結(jié)果 (%)

2.4 菌株脂肪酶含量的穩(wěn)定性

選取誘變以后產(chǎn)量最高的菌株，測得其比原始菌株提高72%。將得到的最高產(chǎn)量的菌種保存，并且對其進(jìn)行連續(xù)傳代、發(fā)酵培養(yǎng)，并對每代次菌株的產(chǎn)酶活力進(jìn)行鑒定，具體結(jié)果見表6。由表6可見，第10代的TZ-05菌株，脂肪酶產(chǎn)量仍然比較穩(wěn)定。

表6 菌株酶活力穩(wěn)定性傳代結(jié)果 (IU/ml)

2.5 脂肪酶的分離純化

TZ-05菌株脂肪酶發(fā)酵液經(jīng)過硫酸銨沉淀、陰離子交換層析等步驟純化后，脂肪酶純化了78倍，活性回收率為35%。SDS-PAGE凝膠電泳圖譜顯示，純化后的脂肪酶分子量約為35～40Kd之間，為單一目的條帶。

圖2 S-PAGE電泳條帶

2.6 TZ-05脂肪酶活性在不同離子作用下脂肪酶活性的影響

向純化后的TZ-05脂肪酶酶液中，分別加入終濃度為2mmol/L鈣、鎂、鐵、鋅、銅、鐵等二價(jià)金屬離子和EDTA，同時設(shè)未加離子的空白TZ-05脂肪酶酶液為陰性對照，TZ-05脂肪酶的活性測定結(jié)果顯示，在鈣離子或鎂離子的作用下，脂肪酶的活力能顯著提高，其中鈣離子的作用效果最好，能夠提高到250%。而錳鐵鋅等離子對TZ-05脂肪酶有顯著的抑制作用，尤其是鐵離子和鋅離子，結(jié)果不到空白對照的二分之一，這與報(bào)道的實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致[10]。結(jié)果見表7。

表7 脂肪酶活性在不同離子作用下活性測定 (%)

2.7 TZ-05脂肪酶的最適溫度的確定

選取20、30、35、40、45、50、60、70℃溫度下進(jìn)行TZ-05肪酶酶液最適活力溫度的篩選，結(jié)果顯示在45℃時，酶活性最高，確定45℃為TZ-05脂肪酶的最適溫度，具體結(jié)果見表8。選取30、40、45、50、55、60、70℃等溫度進(jìn)行脂肪酶活力穩(wěn)定性的測試，結(jié)果顯示在60℃以后，酶活性急劇下降，處理30min 以后，脂肪酶的活性僅為50 %。結(jié)果見表9。

表8 最適溫度的選擇 (℃、%)

表9 不同溫度先酶活性的穩(wěn)定性 (℃、%)

2.8 TZ-05脂肪酶的最適pH和pH穩(wěn)定性的測定

選取pH分別為3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.7、7、7.5、8、8.5、9、10的緩沖液測定脂肪酶的酶活力，結(jié)果顯示pH 7.0 為TZ-05脂肪酶的最適pH。結(jié)果見表10。選取pH為2、3、4、5、6、7、8、9、10的脂肪酶酶液，室溫處理4h ，結(jié)果顯示脂肪酶在pH2.0～pH9.0的范圍內(nèi)活力保存較穩(wěn)定，見表11。

2.9 不同有機(jī)溶劑對TZ-05脂肪酶活性的影響

分別將甲醇、乙醇、丙醇、2-丙醇、乙酸乙酯及乙酸甲酯與脂肪酶酶液按照不同的比例混勻，25℃下處理，24h后測定脂肪酶酶活力。結(jié)果顯示，醇類有機(jī)溶劑碳鏈越長，脂肪酶的活性就越低。

表10 最適pH的選擇 (%)

表11 不同pH酶活性的穩(wěn)定性 (%)

表12 不同有機(jī)溶劑對酶活性的影響 (%)

2.10 TZ-05脂肪酶對不同油脂的水解特異性

用TZ-05脂肪酶分別水解橄欖油、棉籽油、蓖麻油、菜籽油、三油酸甘油酯等不同的油脂，結(jié)果顯示，脂肪酶對一般的油脂水解效果差異很小，只有蓖麻油的效果較差。

表13 不同油脂底物脂肪酶水解的特異性 (%)

2.1.1 菌株TZ-05脂肪酶的轉(zhuǎn)酯特性

將TZ-05脂肪酶發(fā)酵純化后進(jìn)行固定，1h后大孔樹脂HPD600載體的固定吸附率達(dá)到了95%以上，固定效果較好。以橄欖油為底物在無溶劑體系中進(jìn)行轉(zhuǎn)酯反應(yīng)，結(jié)果表明固化酶及實(shí)驗(yàn)對照酶均具有較高的轉(zhuǎn)酯率。并且2種酶的轉(zhuǎn)脂產(chǎn)物較為相似，油酸甲酯得率最高，均超過50%。固化酶的轉(zhuǎn)酯率為97.2%，遠(yuǎn)高于對照用工業(yè)脂肪酶LS-20的83.73%，反應(yīng)產(chǎn)物氣相色譜分析見表14所示。

表14 轉(zhuǎn)酯產(chǎn)物的氣相色譜結(jié)果

3 討論

微生物是脂肪酶的重要來源，篩選培育水解酶活高、且酶學(xué)特性優(yōu)良的產(chǎn)脂肪酶菌株，應(yīng)用于毛皮加工的脫脂工藝中，對于提高毛皮加工的效率具有重要意義。本試驗(yàn)經(jīng)過分離純化，獲得一株產(chǎn)酶量較高的脂肪酶菌，并且經(jīng)過紫外誘變，將產(chǎn)酶量提高了72%；對脂肪酶進(jìn)行分離純化，進(jìn)行酶部門性質(zhì)及固化載體的研究，得到溫度、有機(jī)溶劑及pH等對脂肪酶活性的影響，篩選出良好固化載體，均為以后的研究奠定了基礎(chǔ)。

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A

1007-1733(2015)11-0001-04

2015-09-15）

國家星火計(jì)劃(2013GA740002)。