溫熱抑制人胃癌 SGC790l細胞增殖、遷移

肖 鳳劉 彬 余海紅

（井岡山大學醫(yī)學院，吉安 343009）

溫熱抑制人胃癌 SGC790l細胞增殖、遷移

肖 鳳*劉 彬 余海紅

（井岡山大學醫(yī)學院，吉安 343009）

目的 探討溫熱對人胃癌 SGC790l細胞增殖、遷移的影響。方法 對照組常溫（37℃）下培養(yǎng)人胃癌 SGC790l細胞，實驗組43℃水浴加熱0.5h、1h、2h、3h后培養(yǎng)24h，采用倒置顯微鏡觀察胃癌細胞的形態(tài)結構變化；Hoechst-33258熒光染色觀察細胞核的變化；四甲基偶氮唑鹽比色法（MTT）檢測細胞增殖抑制；細胞劃痕愈合實驗觀察溫熱對胃癌細胞的運動遷移能力的影響；體外細胞侵襲實驗（Transwell實驗）觀察溫熱對胃癌細胞侵襲能力的影響。結果 溫熱后細胞明顯皺縮、變圓及細胞漂浮，3h大部分細胞漂??；熒光染色顯示溫熱后部分細胞核內出現濃染致密的顆粒塊狀熒光，胞核固縮、染色質高度凝聚和碎裂；MTT實驗提示溫熱可明顯抑制 SGC790l細胞生長；細胞劃痕實驗發(fā)現SGC790l細胞溫熱 1h、2 h后細胞遷移距離均明顯小于對照組，溫熱3h后細胞基本未發(fā)生遷移；Transwell實驗提示 SGC790l細胞溫熱后細胞侵襲能力明顯下降。結論 溫熱對胃癌 SGC790l細胞具有明顯的殺傷作用，溫熱可明顯抑制胃癌 SGC790l細胞增殖和侵襲遷移能力。

胃癌；SGC790l細胞；溫熱；細胞遷移；細胞侵襲

腫瘤熱療（Hyperthermia）是繼手術、放射治療、化學治療和生物治療之后的第五大腫瘤治療手段，其在腫瘤綜合治療中的地位及意義受到越來越多的關注。研究表明，43℃左右的溫熱治療胃癌這類空腔臟器腫瘤效果較為確切，但其機制要比高熱直接殺傷實質性臟器腫瘤細胞復雜得多。在胃癌熱療方面，相關的研究報道很少，且與臨床實際條件不一致［1，2］。為此我們采用臨床有效且相對安全的 43℃作為溫熱的條件，在體外觀察溫熱對胃癌細胞生物學行為的影響，為臨床應用提供理論基礎。

材料和方法

1.材料

人胃癌細胞株 SGC7901細胞由江西省消化系疾病研究所饋贈。0.25%胰蛋白酶、高糖 DMEM培養(yǎng)液（美國GIBCO公司）；DMSO（美國 Amresco公司）；胎牛血清（杭州四季青公司）四甲基偶氮唑鹽（MTT，美國 Amresco公司）；Hochest33258熒光染料（美國Sigma公司）；MATRIGEL MATRIX（香港BD公司）；纖維連接蛋白（鄭州德福恩生物技術有限公司）；BSA（上海江萊生物科技有限公司）；抗熒光淬滅封片液（南京碧云天試劑公司）。

2.方法

2.1 細胞培養(yǎng)

用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液常規(guī)培養(yǎng)（37℃、5%CO2飽和濕度），取對數生長期的細胞進行加熱處理。

2.2 加熱實驗

實驗組加熱溫度設置 43℃，根據加熱時間不同分為43℃0.5h、1 h、2h及3h等亞組。將處于對數生長期內的 SGC7901細胞常規(guī)消化、離心、重懸混勻，計數后，接種于 35mm NEST培養(yǎng)皿，置 37℃、5% CO2恒溫孵育箱培養(yǎng)至貼壁。用封口膜封口后放入43℃的電熱恒溫水浴箱加熱（溫度波動 ＜±0.1℃）。確保整瓶細胞平放淹沒于水中，將溫熱處理后的細胞換新鮮的10%FBS-高糖DMEM培養(yǎng)液，并放置37℃、5%CO2恒溫孵育箱繼續(xù)培養(yǎng)24h。

對照組用封口膜封口后放入 37℃的水浴箱 3h后換新鮮的10%FBS-高糖DMEM培養(yǎng)液，并放置37℃、5%CO2恒溫孵育箱繼續(xù)培養(yǎng)24h。

2.3 細胞抑制率的 MTT法測定

非溫熱處理組作為常溫對照，同時設不加細胞的背景對照，取溫熱處理后培養(yǎng)24h的各組細胞于倒置顯微鏡下觀察細胞生長情況和形態(tài)變化。然后用0.25%的胰蛋白酶消化離心，用培養(yǎng)液重懸細胞計數，稀釋成 1×104／ml，按每孔 200μl接種到 96孔培養(yǎng)板中，每組設6個復孔。再將每孔加入 MTT溶液20μl，避光條件下繼續(xù)培養(yǎng)4h，終止培養(yǎng)，小心吸棄孔內培養(yǎng)基上清液，每孔加入 150μl DMSO，振蕩10min，用酶聯免疫檢測儀測定每孔的光密度（OD）值，波長為570nm。根據各組測得的OD值計算各溫熱處理組 SGC7901細胞增殖抑制率，計算公式如下：

細胞增殖抑制率 ＝［1－實驗組 OD值／對照組OD值］×100%

2.4 細胞核的 Hoechst-33258熒光染色

溫熱處理后培養(yǎng)24h的各組細胞，用4%多聚甲醛室溫固定10min，加入 Hoechst 33258染色液，避光室溫10min，用抗熒光淬滅封片液封片。實驗重復3次。熒光顯微鏡觀察細胞形態(tài)結構及胞核的變化并拍照。

結果評判標準：正常細胞胞核為 Hoechst（HO）藍色淡染，濃染或成顆粒狀為陽性，HO（－）為活細胞，HO（＋）為凋亡細胞。

2.5 細胞運動遷移能力的細胞劃痕愈合實驗檢測

將對數生長期的 SGC7901細胞1×106個／ml接種于6孔培養(yǎng)板中，于 37℃，5%CO2恒溫孵育箱中繼續(xù)培養(yǎng)至上述細胞相互融合時，用 20μl槍頭垂直于皿底在單層細胞上劃痕，造成培養(yǎng)細胞傷口模型，劃痕后用不含血清DMEM培養(yǎng)液輕柔漂洗 3次，再加入含10%FBS的 DMEM培養(yǎng)基分別予43℃溫熱處理0.5h、1h、2h及 3h，非溫熱處理組作為對照組，然后用不含血清 DMEM培養(yǎng)液輕柔漂洗3次，加入無血清培養(yǎng)基，放入37℃，5%CO2恒溫孵育箱中，按0h，6h，12h，24h及48h后置于倒置顯微鏡下觀察并拍照。并用ImageTool圖像分析軟件分析各溫熱時間組的細胞運動遷移情況。

2.6 細胞侵襲能力的體外侵襲實驗檢測

用 DMEM稀釋 Matrigel膠至 5mg／mL，每孔取100μl包被 Transwell小室底部膜的上室面，用 5mg／mL纖維連接蛋白（fibroneetin，FN）10μl均勻涂在小室的下表面；每孔加入50μl含10g／L BSA的無血清培養(yǎng)基 37℃，30min；分別取對照組和各溫熱時間組（0.5h、1h、2h及3h）的胃癌 SGC7901細胞常規(guī)繼續(xù)培養(yǎng)24h。0.25%EDTA胰酶消化細胞，用含10g／L BSA的 無 血 清 培養(yǎng) 基 重 懸，調 整 細胞 密 度 值5×105／ml；取細胞懸液 200μl加入 Transwell上室，每組設置3個復孔。Transwell下室中加入 500μl含10%FBS的培養(yǎng)基，將經上述處理后的24孔板常規(guī)繼續(xù)培養(yǎng)24h后，用濕棉簽擦去膜上面細胞，0.1%結晶紫染色后將小室置于倒置顯微鏡下觀察穿過膜的細胞并計數。每個樣本計數7個視野，取平均值。

2.7 統計學分析

應用 SPSS13.0統計軟件行統計分析，數據均采用均數 ±標準差表示（（±s）），以單因素方差分析（one－way ANOVE）計算多組間差異，兩兩比較采用q檢驗，P＜0.05認為差異有統計學意義。

結 果

1.溫熱使胃癌細胞皺縮、變圓、漂浮

倒置顯微鏡觀察：與對照組相比，溫熱0.5h部分貼壁SGC7901細胞出現皺縮，從胞膜伸出胞外的偽足逐漸減少，細胞逐漸變圓，細胞內顆粒成分逐漸增多，細胞漂浮，1h相對較少，2h細胞皺縮、變圓、漂浮明顯增多，3h大部分細胞出現漂浮現象，溫熱0.5h、1h、2h和3h可明顯損傷胃癌SGC7901細胞（圖1）。

圖1 不同時間溫熱處理 SGC7901細胞的形態(tài)變化（400×）Fig.1 Morphological changes of SGC7901 cells in various time thermotherapy group（400×）

2.溫熱抑制胃癌細胞增殖

根據 MTT實驗原理，測量OD值可間接測量活細胞數量和其代謝活力。MTT結果顯示：溫熱后，SGC790l細胞增殖抑制率逐漸升高，至3h最高，溫熱處理0.5h、1h、2h、3h后SGC790l細胞增殖抑制率分別為（32.7±2.3）%、（30.6±1.9）%、（43.8±3.4）%、（52.9±2.8）%，提示溫熱可明顯抑制胃癌細胞。

3.溫熱使細胞核核濃縮和碎裂

對照組（0h）SGC790l細胞絕大數胞核呈彌散均勻的熒光，個別細胞核呈濃染致密的顆粒塊狀熒光，而實驗組（溫熱0.5h、1h、2h和3h）更多細胞的細胞核內出現濃染致密的顆粒塊狀熒光，并顯示出胞核固縮、染色質高度凝聚和碎裂，并且溫熱 0.5h就有較多細胞核出現核濃縮和碎裂，2h明顯增多，3h最嚴重（圖2）。

圖2 不同時間溫熱處理對 SGC7901細胞核影響的 Hoechst-33258染色檢測（400×）Fig.2 Nuclear change of SGC790l cells in various thermotherapy time by Hoechst-33258 fluorescent staining（400×）

4.溫熱使細胞運動遷移能力下降

細胞劃痕愈合實驗可檢測細胞自身的運動遷移能力的強弱。我們采用此實驗比較各溫熱組的各時間點 SGC790l細胞的運動遷移能力情況。結果顯示劃痕 24h后，由于細胞遷移，溫熱 1h組和 2 h組SGC790l細胞的劃痕均有不同程度的“愈合”，對照組（溫熱0h）劃痕愈合明顯；劃痕48h后溫熱1h組中度愈合，2h組輕度愈合，并且后者出現部分細胞漂浮，3h組細胞基本未發(fā)生遷移，對照組48h后基本愈合（表1，圖3）。與對照組比較，溫熱1h組的細胞體外遷移能力明顯下降（P＜0.05），溫熱2h組的細胞體外遷移能力下降更甚（P＜0.01），提示溫熱可顯著抑制 SGC790l細胞的體外遷移能力。

5.溫熱對細胞侵襲能力的影響

體外侵襲實驗可反映腫瘤細胞侵襲能力的強弱。本實驗結果顯示，SGC790l細胞溫熱后 3h細胞侵襲能力下降最明顯，溫熱0.5h、1h、2h、3h后，每個視野中SGC790l細胞穿過 Matrigel膠到達 Transwell小室膜背面的細胞數明顯減少，與對照組比較，均有顯著差異（P＜0.05）（表2，圖4A、4B）。結果表明：溫熱可顯著抑制 SGC790l細胞侵襲能力。

圖3 溫熱處理對 SGC791細胞愈合能力的影響（100×）Fig.3 Wound healing ability of SGC7901 cells in various time thermotherapy group（100×）.A0，B0，C0，D0，E0：the wound healing ability of control group after 0h，6h，12h，24h and 48h，and A1，B1，C1，D1，E1：the wound healing ability of thermotherapy 1h group after 0h，6h，12h，24h and 48h，and A2，B2，C2，D2，E2：the wound healing ability of thermotherapy 2h group after 0h，6h，12h，24h and 48h

圖4 溫熱處理對 SGC7901細胞侵襲能力的影響（400×）Fig.4 Cell invasion change of SGC7901 cells in various time thermotherapy group（400×）.A-E，crystal violet staining；F，Average amount of invaded cells in various time thermotherapy group

討 論

腫瘤熱療是一種以非電離輻射方式作用于腫瘤的物理治療方法，其最大優(yōu)勢是毒副作用小，并能夠多次重復使用，且可增強放射治療和化學藥物治療的效果，目前在腫瘤綜合治療中備受關注［3］。一些腫瘤的體外研究發(fā)現，溫熱處理可殺傷腫瘤細胞。但不同類型的腫瘤細胞對熱療的反應和敏感性也存在明顯差異。卞春安等［4］報道43℃熱處理 15min或30min即可明顯抑制肺癌 A549細胞增殖，殺傷 A549細胞；湯睿等［5］報道 43℃熱處理 2 h可直接殺傷胃癌 SNU-1細胞；Brehmer的研究證實較溫和的熱療引起前列腺癌細胞凋亡，較強的熱療則引起前列腺癌細胞壞死［6］。為此，我們選擇了溫熱（43℃）分別處理 0.5h、1h、2h及3h，以期探討溫熱對胃癌 SGC7901細胞生物學行為的影響。本研究 MTT結果顯示，熱療0.5h、1h、2h和3h均引起 SGC790l細胞增殖明顯受到抑制，3h細胞活力降為最低。

熱療對細胞殺傷作用的最突出證據就是細胞核仁和膜結構變化［7］。本實驗倒置顯微鏡觀察到溫熱后 SGC7901細胞體積變小變圓，核膜皺縮，核染色質凝聚和碎裂，3h大部分細胞漂浮。Hoechst-33258熒光染色結果顯示，溫熱0.5h就較多細胞核呈濃縮顆粒塊狀熒光，2h明顯增多且出現核碎裂，3h最嚴重。從形態(tài)學角度證實了溫熱具有明顯損傷胃癌細胞的作用。

腫瘤細胞的侵襲與遷移是惡性腫瘤的主要生物學特征，也是影響患者預后的主要因素。有研究表明，溫熱能使貼壁腫瘤細胞表面的整合素等粘附分子表達降低［8］，抑制粘著斑激酶（focal adhesion kinase，FAK）的活性，從而抑制 FAK-Ras-MAPK信號通路介導細胞黏附和遷移。溫熱能降低uPA表達，減弱蛋白水解從而抑制腫瘤細胞的浸潤和轉移［9］。也能抑制有關 MMP的活性，增加 TIMP的釋放，降低細胞侵襲能力［10］。我們在研究溫熱對胃癌細胞形態(tài)結構和增殖影響的基礎上，檢測溫熱后胃癌SGC7901細胞運動遷移和侵襲能力情況。本實驗證實溫熱能夠顯著降低 SGC7901細胞的運動遷移和侵襲能力，為溫熱臨床應用提供理論依據。而溫熱降低 SGC7901細胞的運動遷移和侵襲能力的具體機制還有待于深入研究。

［1］楊耀琴，陳斌，陶惠紅，等.吐溫 80合并溫熱誘導 BGC-823胃癌細胞凋亡及對 Hsp70，Bcl-2和 Bax表達的影響.中國組織化學與細胞化學雜志，2002；11（2）：306-309

［2］陳衛(wèi)星，顧竹影，厲有名.加熱誘導人胃癌細胞株MKN28凋亡的動力學研究.實用癌癥雜志，2001；16（1）：126-128

［3］Lin TC，Lin FH，Lin JC.In vitro feasibility study of the use of a magnetic electrospun chitosan nanofiber composite for hyperthermia treatment of tumor cells.Acta Biomater.2012 Jul；8（7）：2704-2711

［4］卞春安，嚴煜，蔣琰華.加熱對肺癌A549細胞生長和細胞周期影響的實驗研究.中華腫瘤防治雜志2010，17（10）：732-735

［5］湯睿，朱正綱，瞿穎等.溫熱體外對人胃癌細胞株生物學行為的影響.世界華人消化雜志，2006，14（2）：144-150

［6］Brehmer M.Morphological changes in prostatic adenomas after transurethral microwave theromotherapy.Br J Urol，1997，80（1）：123

［7］Tronov VA，Konstantinov EM，Kramarenko II.Hyperthermia induced signal for apoptosis and pathways of its transduction in the cell.Tsitologiia.2002；44（11）：1079-1088

［8］Luchetti F，Mannello F，Canonico B，etal.Integrin and cytoskeleton behaviour in human neuroblastoma cells during hyperthermia-related apoptosis.Apoptosis 2004，9（4）：635-648

［9］Liang X，Xiao G，Mao Z.The effect of heat shock on the expression of urokinase-type plasminogen activator in human tongue squamous cell carcinoma cell line（Tca8113）.Huaxi Kouqiang Yixue Zazhi 2003，21（1）：150-152

［10］Sawaji Y，Sato T，Takeuchi A，etal.Antiangiogenic action of hyperthermia by suppressing gene expression and production of tumour-derived vascular endothelial growth factor in vivo and in vitro.Br J Cancer 2002，86（11）：1597-1603

Inhibition of proliferation and migration by hyperthermia in the human gastric cancer cell line SGC7901

Xiao Feng*，Liu Bin，Yu Haihong
（Department of Pathology，Medical School，Jinggangshan University，Ji'an 343000，China）

Objective To investigate the effect of hyperthermia on proliferation and migration of the human gastric cancer cell line SGC7901.Methods Human gastric cancer MKN45 cells were resuscitated and cultured in vitro.Following thermotherapy at 43℃for 0，0.5，1，2 or 3h，human gastric cancer SGC7901 cells were further cultured for 24 h.Their morphology was observed by inverted microscopy.Nuclear analysis was evaluated by Hoechst-33258 fluorescent staining.Cell proliferation was determined by MTT.Cell migration and cell invasion were evaluated by wound healing assay and transwell assay.Results Inverted microscopy revealed shrinked，rounded and floated SGC7901 cells，and Hoechst-33258 fluorescent staining demonstrated that there were nuclear condensation and fragmentation after thermotherapy.MTT assay showed that the growth of SGC7901 cells was inhibited.Cell migration was obviously reduced compared to that of the controls.No obvious migration was detected at 3 h of treatment.Invasion of SGC790l cells was reduced significantly.Conclusions Thermotherapy has a destructive effect on GC7901 cells，and significantly inhibits their proliferation，migration and invasion.

Gastric cancer；SGC7901 Cell Hyperthermia；Cell migration；Cell invasion

R735.2

A

10.16705／j.cnki.1004-1850.2015.05.010

2013-08-01

2013-08-15

江西省自然科學基金（20114BAB204025）

肖鳳，女（1965年），漢族，教授

＊通訊作者（To whom correspondence should be addressed）：164949497＠qq.com